ניתוחים של פרוטאינוריה, חדירה כלייתית של לויקוציטים ותצהיר כלייתי של חלבונים בעכברי MRL/lpr המועדים לזאבת

תפקידה העיקרי של הכליה הוא חיסול חומרים רעילים באמצעות שתן תוך שמירה על הומאוסטזיס של מים ומלחים¹. פונקציה זו מאוימת בחולים עם זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), מה שמוביל למה שמכונה זאבת נפריטיס (LN). LN הוא תוצאה של מערכת החיסון התוקפת את הכליה, מה שמוביל לדלקת כליות מתמשכת, ולכן מאבד את יכולתו לנקות פסולת מהדם ולווסת את ריכוזי המלח והנוזלים. זה יוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות, אשר יכול להיות קטלני. במהלך התהליך הנפריטי, תאי B במחזור, תאי T ומונוציטים מגויסים לכליה, ומפרישים כימוקינים, ציטוקינים ונוגדנים עצמיים יוצרי קומפלקס חיסוני. התוצאה היא בסופו של דבר נזק לתאי האנדותל, פציעות ממברניות, ניוון צינורית הכליה ופיברוזיס².

עכברי MRL/Mp-Fas^lpr (MRL/lpr) הנוטים לזאבת הם מודל עכברים קלאסי המציג סימנים קליניים דמויי זאבת הדומים ל-SLE³ אנושי. מודל זה סייע בהבנת אחד הגורמים המובילים לתמותה בחולי SLE, זאבת נפריטיס (LN)⁴. הן ב- SLE אנושי והן בעכבר, LN מאופיין בדלקת הדרגתית המופעלת על ידי תצהיר כלייתי של מתחמי חיסון, ואחריו הפעלה משלימה, גיוס תאי דלקת ואובדן תפקוד כלייתי⁵. תצהיר הקומפלקס החיסוני הוא הצעד הראשון להשראת ייצור כימוקין וציטוקינים על ידי תאי כליה פנימיים, המרחיבים את התגובה הדלקתית על ידי גיוס תאי חיסון⁶. הפרוטוקול הנוכחי מציג מספר טכניקות למעקב אחר התקדמות מחלת כליות המנתחות חדירת תאים ותצהיר קומפלקס חיסוני.

שתן שנאסף מדי שבוע מאפשר זיהוי והדמיה של מהלך הזמן של פרוטאינוריה לפני, במהלך ואחרי הופעת זאבת. פרוטאינוריה כסמן ביולוגי יכולה לקבוע את ההתקדמות הביולוגית של LN. יתרונות נוספים של טכניקה זו הם שהיא לא פולשנית, חסכונית וקלה ליישום⁷. כאשר הכליה פועלת בצורה מושלמת, רמת הפרוטאינוריה נמוכה באופן עקבי; עם זאת, בעכברי MRL/lpr, לאחר 8-9 שבועות של גיל, נצפתה עלייה הדרגתית של רמת הפרוטאינוריה, שבסופו של דבר גבוהה מספיק כדי לגרום לאי ספיקת כליות⁸. רצועות ריאגנטים מרובות וריאגנטים צבעוניים זמינים מסחרית לניטור הבעיה. עם זאת, מבחן ברדפורד הוא זול ומדויק מאוד בקביעת הופעת פרוטאינוריה ואת מהלך זאבת נפריטיס. בדיקה זו היא מהירה, והמגיב אינו מושפע מנוכחותם של ממסים, מאגרים, חומרים מחזרים וחומרים מטאליים שעשויים להיות במדגם^שלך 9,10,11^.

היבט חשוב אחד שיש לקחת בחשבון הוא חדירת תאים לכליה. חדירות אלה מקדמות פתוגנזה על ידי הפעלת הפרשת גורמים מסיסים כגון ציטוקינים כדי להחמיר את הדלקת¹². כדי להבין טוב יותר אילו אוכלוסיות תאים נמצאות בחדירות, שיטה שימושית היא לבודד לויקוציטים¹³. כאן, זיהוי של חדירה כלייתית של תאי B משמש כדוגמה. ההליך מתחיל בתהליך עיכול עם deoxyribonuclease (DNase) ו collagenase, ואחריו הפרדת גרדיאנט צפיפות המסירה פסולת, כדוריות דם אדומות, גרנולוציטים צפופים. הסיבה לבידוד תאי B (CD19+) ותאי פלזמה (CD138⁺) היא שכליות זאבת יכולות לרכז את התאים האלה¹⁴. הוא הציע כי נוכחות של תאי B באגרגטים קטנים בכליה יכולה להצביע על התרחבות clonal, וכתוצאה מכך, ייצור אימונוגלובולין (Ig). ידוע כי תאי פלזמה נמצאים באגרגטים אלה גם¹⁵. לאחר בידוד לויקוציטים, ניתן להשתמש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לנתח את התאים המעניינים בעת צביעה בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים שונים.

אימונופלואורסצנציה היא אחת משיטות הזיהוי האימונוהיסטוכימיה (IHC) המאפשרת הדמיה פלואורסצנטית של חלבונים בדגימות רקמת כליה בעובי 4 מיקרומטר. שיטות גילוי IHC אחרות תלויות באופי האנליטים, בכימיה המחייבת ובגורמים אחרים¹⁶. אימונופלואורסצנציה היא שיטת זיהוי מהירה החושפת את האנטיגן לנוגדן מקבילו המסומן בפלואורוכרום ספציפי (או צבע פלואורסצנטי). כאשר הוא מתרגש, הוא מייצר אור שמיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לזהות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התצהיר של משלים C3 ו IgG2a¹⁷. הפעלה מוגזמת של מפל משלים יכולה להיות קשורה לתגובה חיסונית בלתי מבוקרת ולאובדן תפקוד¹⁸. תצהיר חיסוני של נוגדנים עצמיים נגד דנ"א דו-גדילי (anti-dsDNA) בכליה הוא דאגה מרכזית¹⁹, כאשר אלה עם איזוטיפ IgG2a נקשרו ל-LN²⁰. באופן ספציפי, נוגדנים נגד dsDNA מפגינים יותר פתוגניות וזיקה לחומרים גרעיניים, ויוצרים קומפלקסים חיסוניים²¹. כאשר IgG2a קיים, מפל המשלים, כולל C3, מופעל כדי לנקות את מתחמי החיסון²². ניתן לכמת את סמני C3 ו- IgG2a בנפרד או לכסות אותם כדי לבסס את המתאם ביניהם.

יש לציין כי מדידת קריאטינין בסרום היא טכניקה אמינה נוספת שניתן להשתמש בה יחד עם המטוריה מיקרוסקופית וביופסיות כליות לאבחון LN²³. עם זאת, נוכחות של פרוטאינוריה היא אינדיקטור חזק של נזק גלומרולרי. במובן זה, ניטור רמת הפרוטאינוריה במהלך זאבת יכול לזהות התפרצות מחלה ולהשלים שיטות אחרות לאבחון זאבת. בנוסף, קומפלקסים חיסוניים שהופקדו glomeruli יכול לעורר תגובה דלקתית, להפעיל את מערכת המשלים, ולגייס תאים דלקתיים נוספים. נקודה נוספת ראויה לציון של פרוטוקול זה היא חדירת תאי B לכליה. זה, יחד עם תאי ה-T החודרים, מגביר את התגובות החיסוניות המקומיות שגורמות נזק לאיברים. חשוב לציין כי הסיווג של LN אינו מבוסס רק על שינויים מורפולוגיים גלומרולריים הנראים במיקרוסקופיה, אלא גם על משקעים חיסוניים שנצפו עם אימונופלואורסצנציה. לכן, בפרוטוקול זה, שיטות מדויקות וחסכוניות לניתוח תפקוד הכליות מוצעות במסגרות מעבדה.

הפרוטוקול הנוכחי מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בווירג'יניה טק. מאחר שלמחלת הזאבת יש שכיחות גבוהה יותר אצל נקבות, נעשה שימוש רק בנקבות עכברי MRL/lpr. איסוף הדגימות החל בגיל 4 שבועות והסתיים בגיל 15 שבועות. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) וגודלו ותוחזקו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. בדיקת פרוטאינוריה

1. לאסוף שתן בעקבות השלבים הבאים.
   1. יש לעקר את מכסה המנוע על ידי ריסוס 70% אתנול. מניחים יריעת פלסטיק סטרילית על פני השטח. הכינו טיפים, צינורות 1.5 מ"ל ופיפטה לאיסוף כ-20 מיקרון ליטר מהנוזל.
      הערה: טיפים וצינורות חייבים להיות סטריליים וללא כל טיפול מקדים.
   2. קח את הכלוב ורסס 70% אתנול לפני שתכניס אותו לתוך מכסה המנוע.
   3. החזיקו את העכבר ביד אחת והשתמשו ביד השנייה כדי לעסות בעדינות את אזור הגחון מלמעלה למטה.
   4. השתמש בצינור 1.5 מ"ל או פיפטה כדי לאסוף את השתן ישירות, או אם הדגימה טיפה, לאסוף אותו מיריעת פלסטיק. השתמש בכפפות, סדינים וטיפים טריים עבור כל דוגמה.
      הערה: אם זה לא עובד, השתמש בכוס סטרילית כדי לבודד את העכבר, ולאחר מכן אסוף את השתן מהכוס לאחר שהעכבר משתין.
   5. החזירו את העכבר לכלוב. הוצא עכבר נוסף וחזור על שלבים 1.1.3-1.1.4.
      הערה: נקו תמיד את יריעת הפלסטיק ואת הכוס עם 70% אתנול לאחר איסוף הדגימה עבור כל עכבר. לפחות חמישה עכברים לקבוצה נחוצים למובהקות סטטיסטית. דגימות שתן ניתן לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש עד 12 חודשים.
2. כימות החלבונים בשיטת ברדפורד²⁴.
   1. אפשרו לדגימות שתן, לתקן אלבומין ולמגיב ברדפורד להגיע לטמפרטורת החדר (RT) על ידי השארתם מחוץ למקפיא למשך 10-20 דקות.
      הערה: מגיב ברדפורד ותקן אלבומין כלולים בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). הריכוז ההתחלתי של תקן אלבומין הוא 2 מ"ג/מ"ל. דילולים סדרתיים (1:2 שש פעמים) חייבים להיעשות עם מים.
   2. הוסיפו את מגיב ברדפורד לצלחת של 96 בארות (200 μL/well), ללא דילול.
   3. פיפטה 5 μL של דגימת שתן לא מדולל לכל באר ולהשתמש בקצה כדי פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב כראוי.
   4. הוסף תקנים (400, 200, 100, 50, 25, 12.5 mg/dL) בכפילויות. השאירו כמה בארות כריקים.
      הערה: הוספת דוגמאות ותקנים צריכה להיעשות במהירות.
   5. תן לזה לעמוד במשך 5-10 דקות ב- RT.
   6. קרא את הלוחית בגודל 595 ננומטר בקורא צלחות בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).

2. בידוד של תאי הכליה

1. המתת העכבר באמצעות CO₂ (קצב זרימה: 30%-70% נפח/דקה, כדי להשיג חוסר הכרה או מוות) בתא ואחריו נקע צוואר הרחם. המשך עם דיסקציה כדי לאסוף את שתי הכליות. מניחים כליה וחצי במדיום C10 קר כקרח. שים את חצי הכליה השנייה ב- OCT (שלב 3.1.1).
   הערה: C10 מיוצר עם RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1 mM של נתרן פירובט, 1% של 100x חומצות אמינו לא חיוניות MEM, 10 mM של HEPES, 55 μM של 2-mercaptoethanol, ו 100 U/mL של פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים).
2. חותכים את הכליות לגודל דגנים (1-2 מ"מ³ חתיכות) ומתעכלים ב-5 מ"ל של מאגר עיכול המכיל 1 מ"ג/מ"ל של קולגן ו-0.2 מ"ג/מ"ל של DNase I (ראו טבלת חומרים) במדיום RPMI 1640 המכיל 10 mmol /L של HEPES למשך שעה אחת עם רעידות עדינות מתמשכות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: יש להוסיף חיץ עיכול של 1 מ"ל בצינור סטרילי של 2 מ"ל ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לקצוץ את הכליה.
3. הוסיפו 10 מ"ל של PBS קר כקרח המכיל 10 מ"מ של חומצה אתילנדיאמינטטראציטית (EDTA) ודגרה במשך 10 דקות על קרח. ואז מערבלים את ההשעיה פעמיים.
4. סנן את מתלה התא דרך מסננת 100 μM ושטוף עם 10 מ"ל של HBSS מלא.
   הערה: HBSS-full מכיל 5 mM של EDTA, 0.1% BSA ו-10 mM של HEPES.
5. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ב RT.
6. הכן פתרון 30%, 37% ו-70% סטוק איזוטוני פרקול (SIP).
   הערה: ערבבו נפח חלק אחד של 10x PBS ונפח של 9 חלקים של Percoll להכנת SIP (ראו טבלת חומרים); השתמש ב-HBSS-full כדי לדלל את SIP ל-30%, 37% ו-70% SIP.
7. יש לתלות תאים ב-5 מ"ל של 30% SIP ולטעון 37% מ-5 מ"ל (למעלה) ו-70% מ-5 מ"ל (למטה), מה שהופך את SIP לשיפוע, לאט לאט עם פיפטה פאסטר.
8. צנטריפוגה עם Up9 down0 (או בלם 0) ב-1000 x גרם למשך 30 דקות ב-RT.
9. לאסוף לויקוציטים מן הממשק 37%-70% ולחדש אותם ב 5 מ"ל של C10.
10. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
11. השהה את גלולת התא ב-3 מ"ל של מאגר FACS. התאים מוכנים לצביעת FACS.
    הערה: מאגר FACS מכיל PBS אחד ואלבומין בסרום בקר (BSA) של 0.1%.
12. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant (SN), משאיר כ 50 μL.
    הערה: כדי להסיר את הסופרנטנט, יש לשפוך בזהירות או לפטם את התמיסה הרחק מהמוצק או להשתמש בוואקום חצי-אוטומטי כדי לשאוף את הסופרנטנט.
13. הוסף 50 μL של בלוק FcR (ראה טבלת חומרים) לכל שפופרת (מדולל מראש 1/50 ב 1x PBS); מערבבים ודוגרים על קרח בחושך במשך 10 דקות.
14. יש להוסיף 2 מ"ל של מאגר FACS לשטיפה.
15. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך SN, משאיר כ 50 μL.
16. הוסיפו 20 μL של הצבע הפלואורסצנטי המתאים (דיללו 1/100 עם 1x PBS, ראו טבלת חומרים) ותנו לו לעמוד במשך 15-30 דקות על קרח.
17. הוסף 50 μL של תערובת נוגדנים¹⁵ לכל צינור: CD138-BV711 (1/200 ב-PBS אחד) ו-CD45-AF700 (1/200 ב-PBS אחד) (ראה טבלת חומרים).
18. דגרו על קרח בחושך במשך 15-30 דקות והוסיפו 3 מ"ל של חיץ FACS.
19. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C ו ואקום SN, משאיר כ 50 μL. השעיה ב 200 μL של 1x PBS. זה עכשיו מוכן להיות מנותח על ידי ציטומטריה זרימה.

3. מכתים אימונופלואורסצנטיים

1. בצע את איסוף הדגימות.
   1. הטמע את חצי הכליה בקריומולד הפלסטי הקטן עם תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) (ראו טבלת חומרים).
   2. הוסיפו קרח יבש לקופסת קצף פוליסטירן (ראו טבלת חומרים), והניחו בזהירות את הקריומולד על גבי הקרח היבש. ודא כי cryomolds ממוקמים שטוח.
      הערה: לוקח 3-4 דקות עד שתרכובת OCT מתמצקת והופכת ללבנה.
   3. מוציאים את הקריומולד ועוטפים אותו בנייר אלומיניום. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
      הערה: ניתן לאחסן אותו ב-80°C- למשך שנה אחת לפחות.
2. בצע חיתוך ותיקון של המדגם.
   1. חותכים את הדגימות למקטעים של 4 מיקרומטר, ממתינים לפחות 2-3 שעות לייבוש, ואז מתקנים עם אצטון קר (ב-4 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
      הערה: היזהר בעת שימוש באצטון, הדורש מכסה מנוע כימי מיוחד.
   2. לאחר תיקון המגלשות, יש לייבש באוויר למשך 0.5-1 שעות ולאחסן אותן לזמן קצר ב-20°C-, או למשך זמן רב ב-80°C-.
3. להכתים את הדגימות.
   1. תקן את השקופיות באצטון קר במשך 5-10 דקות.
   2. אפשרו למקטעים להתחמם ל-RT. השתמשו בעט PAP (ראו טבלת חומרים) מסביב למקטע ותנו לו להתייבש.
      הערה: ניתן להשתמש גם באמייל הציפורן. שלב זה מונע מדילול נוגדנים לצוף על כל המגלשה.
   3. הניחו את השקופיות ב-1x Tris-buffered saline (TBS) בצנצנת קופלין (ראו טבלת חומרים) למשך 20 דקות, הניחו את הצנצנת על השייקר ונערו בעדינות.
   4. מוזגים 1x TBS וממלאים את הצנצנת ב-1x TBS, 5% BSA ו-0.1% Tween 20. לדגור במשך 20 דקות על השייקר, לנער בעדינות.
   5. הוציאו את המגלשות ונגבו את תחתית השקופיות לייבוש. במידת הצורך, נערו את המגלשות לייבוש. הוסף 100 μL של נוגדנים מצומדים²⁵ C3-FITC (1/100) ו- IgG2a-PE (1/100) לסעיף (ראה טבלת חומרים). דגירה ב- RT בתא לחות למשך שעה אחת.
   6. יש לשטוף את הקטע 3 פעמים ב-1x TBS, 5% BSA ו-0.1% Tween 20 למשך 10 דקות על השייקר.
   7. יש לייבש את המגלשות ולהרכיב את הקטע עם מגיב אנטי-פאדי (ראו טבלת חומרים) ולאחר מכן עם כיסוי כיסוי.
   8. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצפייה מתחת למיקרוסקופ (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ מערכת הדמיה). כימות תמונות באמצעות תוכנה והפחת אותות רקע בעת השוואת עוצמת הפלואורסצנטיות בין אזורים.
   9. לניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים), התווה את האזור הרצוי.
   10. הגדר פרמטרים סטנדרטיים על ידי לחיצה על נתח, ולאחר מכן הגדר מדידות ומדידת שטח כדי לקבל את התוצאות.
   11. העבר את הנתונים המתקבלים מחלונות המדידה לגיליון אלקטרוני.
       הערה: ניתן לבחור שטח קטן מהתמונה כרקע; זה לא צריך להיות שום פלואורסצנציה.
   12. לאחר שתסיים, לחץ על נתח כדי למדוד את האזור ולהעביר נתונים שוב לגיליון האלקטרוני הקודם.
   13. חזור על שלבים 3.3.11-3.3.12 עבור מספר אזורים.
   14. חישוב הפלואורסצנציה הממוצעת כפלואורסצנציה של תא מתוקן (CCF) = צפיפות משולבת - (אזור תא נבחר x פלואורסצנטיות רקע ממוצעת).
   15. חשב עבור כל אזור ונתח נתונים באמצעות תוכנת הגרפים והסטטיסטיקה (ראה טבלת חומרים).

הפרוטוקול משתמש במספר שיטות כדי להעריך עכברי MRL/lpr עבור זאבת נפריטיס. ראשית, מתואר הליך לחקר רמות פרוטאינוריה מוגברות עקב תפקוד לקוי של הכליות לאורך זמן. כפי שמוצג באיור 1, נקבות עכברים טופלו בנטילת שתן פומית של 200 μL של מי מלח עם מאגרי פוספט (1x PBS) כקבוצת הביקורת ולקטובצילוס ראוטרי פרוביוטי כקבוצת הטיפול, בריכוז של 109 cfu/mL, פעמיים בשבוע. הטיפול החל בגיל 3 שבועות והסתיים בגיל 15 שבועות. קבוצת העכברים שטופלה ב-L. reuteri הייתה בעלת התקדמות פרוטאינוריה אגרסיבית יותר מאשר בקבוצת הביקורת.

איור 1: זיהוי רמות חלבון בשתן של עכברי MRL/lpr לאורך זמן. n = 5 עכברים לקבוצה. הסטטיסטיקה בוצעה באמצעות מבחן רגרסיה ליניארית פשוטה. *P < 0.05, **P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2 מציג את ניתוח ה-FACS של לויקוציטים בכליות המבודדות. העכברים טופלו עם ונקומיצין (2 גרם לליטר) או ונקומיצין בתוספת E. coli dsDNA (80 מיקרוגרם) בניסוי זה. Vancomycin ניתנה יחד עם מי השתייה במהלך פרק הזמן שצוין. גאווה אוראלית של דנ"א חיידקי ניתנה לעכברים שטופלו בוונקומיצין פעם בשבוע במשך ארבעה שבועות רצופים בגיל 4, 5, 6 ו-7 שבועות. E. coli dsDNA היה צפוי לגרום לחדירה כלייתית של תאי פלזמה המובילה לפגיעה בתפקוד הכליות, אך לא נמצא הבדל משמעותי.

איור 2: ניתוח של תאי פלזמה בלויקוציטים מבודדים בכליות. (A) אסטרטגיית גידור רציפה: סך תאים, תאים בודדים, תאים חיים, תאי CD45+ ולבסוף תאי CD138+. (B) אחוז תאי הפלזמה לאחר טיפול בוואן (Vancomycin) או van + DNA (Vancomycin + E. coli dsDNA) במשך 3 שבועות (n ≥ 5 עכברים לקבוצה). לא נצפתה מובהקות סטטיסטית ('ns'). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3 מראה צביעה אימונופלואורסצנטית של משלים C3 ו-IgG2a על מקטעי כליות MRL/lpr של נשים. בניסוי זה הושוותה ההשפעה של גורמים סביבתיים לגבי תצהיר הכליות של C3 ו- IgG2a. עכברים פנימיים גודלו במתקן החיות במשך כמה דורות, והם הושוו לעכברים שנרכשו לאחרונה מספק. הניתוח האימונוהיסטוכימי לא הראה הבדל בין מתקנים שונים.

איור 3: זיהוי של משלים C3 ו-IgG2a במקטעי כליות באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. (A) תמונות מייצגות של מקטעי כליות המוכתמים באנטי-C3-FITC (ירוק) ואנטי-IgG2a-PE (אדום). (B) השוואה של פלואורסצנטיות תאים מתוקנת (CCF) בין שתי הקבוצות (n ≥ 5 עכברים לקבוצה). סרגל קנה מידה = 100 μM. לא נצפתה מובהקות סטטיסטית ('ns'). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.