הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למעקב אחר התקדמות זאבת בעכברים. שני הליכים נוספים מוצגים כדי לאפיין זאבת נפריטיס בהתבסס על חדירת תאים ותצהיר חלבון בכליות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוחים של פרוטאינוריה, חדירה כלייתית של לויקוציטים ותצהיר כלייתי של חלבונים בעכברי MRL/lpr המועדים לזאבת
במאמר זה
סיכום
תקציר
זאבת אדמנתית מערכתית (SLE) היא הפרעה אוטואימונית ללא תרופה ידועה ומאופיינת בדלקת מתמשכת באיברים רבים, כולל הכליות. בנסיבות כאלה, הכליה מאבדת את יכולתה לנקות פסולת מהדם ולווסת את ריכוזי המלח והנוזלים, מה שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות. נשים, במיוחד אלה בגיל הפוריות, מאובחנות פי תשעה יותר מאשר גברים. מחלת כליות היא הגורם המוביל לתמותה בחולי SLE. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מהירה ופשוטה למדידת רמות החלבון המופרש בשתן שנאסף, תוך מעקב אחר התקדמות הזאבת לאורך זמן. בנוסף, גישה לבידוד תאים חד-גרעיניים בכליות מסופקת על בסיס בחירת גודל וצפיפות כדי לחקור חדירה כלייתית של לויקוציטים. יתר על כן, פותחה שיטה אימונוהיסטוכימית לאפיון תצהיר חלבונים בחדירת גלומרולי ולויקוציטים במרחב הטובולואינטרסטיציאלי. יחד, שיטות אלה יכולות לעזור לחקור את ההתקדמות של דלקת כרונית הקשורה לכליות של עכברי MRL/lpr המועדים לזאבת.
מבוא
תפקידה העיקרי של הכליה הוא חיסול חומרים רעילים באמצעות שתן תוך שמירה על הומאוסטזיס של מים ומלחים1. פונקציה זו מאוימת בחולים עם זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), מה שמוביל למה שמכונה זאבת נפריטיס (LN). LN הוא תוצאה של מערכת החיסון התוקפת את הכליה, מה שמוביל לדלקת כליות מתמשכת, ולכן מאבד את יכולתו לנקות פסולת מהדם ולווסת את ריכוזי המלח והנוזלים. זה יוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות, אשר יכול להיות קטלני. במהלך התהליך הנפריטי, תאי B במחזור, תאי T ומונוציטים מגויסים לכליה, ומפרישים כימוקינים, ציטוקינים ונוגדנים עצמיים יוצרי קומפלקס חיסוני. התוצאה היא בסופו של דבר נזק לתאי האנדותל, פציעות ממברניות, ניוון צינורית הכליה ופיברוזיס2.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול הנוכחי מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בווירג'יניה טק. מאחר שלמחלת הזאבת יש שכיחות גבוהה יותר אצל נקבות, נעשה שימוש רק בנקבות עכברי MRL/lpr. איסוף הדגימות החל בגיל 4 שבועות והסתיים בגיל 15 שבועות. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) וגודלו ותוחזקו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים בהתאם להנחיות המוסדיות.
1. בדיקת פרוטאינוריה
- לאסוף שתן בעקבות השלבים הבאים.
- יש לעקר את מכסה המנוע על ידי ריסוס 70% אתנול. מניחים יריעת פלסטיק סטרילית על פני השטח. הכינו טיפים, צינורות 1.5 מ"ל ופיפטה לאיסוף כ-20 מיקרון ליטר מהנוזל.
הערה: טיפים וצינורות חייבים להיות ....
- יש לעקר את מכסה המנוע על ידי ריסוס 70% אתנול. מניחים יריעת פלסטיק סטרילית על פני השטח. הכינו טיפים, צינורות 1.5 מ"ל ופיפטה לאיסוף כ-20 מיקרון ליטר מהנוזל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול משתמש במספר שיטות כדי להעריך עכברי MRL/lpr עבור זאבת נפריטיס. ראשית, מתואר הליך לחקר רמות פרוטאינוריה מוגברות עקב תפקוד לקוי של הכליות לאורך זמן. כפי שמוצג באיור 1, נקבות עכברים טופלו בנטילת שתן פומית של 200 μL של מי מלח עם מאגרי פוספט (1x PBS) כקבוצת הביקורת ולקטובצילוס ראוטרי פרוביוטי כקבוצת הטיפול, בריכוז של 109 cfu/mL, פעמיים בשבוע. הטיפול החל בגיל 3 שבועות והסתיים בגיל 15 שבועות. קבוצת העכברים שטופלה ב-L. reuteri הייתה בעלת התקדמות פרוטאינוריה אגרס.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
LN הוא גורם מוביל לתמותה בחולי SLE, והגורמים המחמירים את המחלה עדיין אינם ברורים. היישום של פרוטוקול זה הוא לאפיין את תפקוד הכליות באמצעות שיטות מרובות, כולל מדידה של פרוטאינוריה, ניתוח FACS של לויקוציטים בכליות מבודדות, והכתמה אימונופלואורסצנטית של מקטעי כליות קפואים.
נקודה חשובה אחת שיש לקחת בחשבון בעת איסוף שתן היא כי אחד צריך להיות עקבי עם השעה של היום ואת המיקום של איסוף שתן. עכברים הם בעלי חיים ליליים, ולכן הדגימות המדויקות ביותר נאספות בשעות אחר הצהריים המאוחרות לפני שהעכברים מתחילים לה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
אנו מודים למתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה, למעבדה היסטופתולוגית, למרכז ההדמיה של פרלין במכון הפוליטכני של וירג'יניה ולאוניברסיטת המדינה על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שונים של NIH ומענקים פנימיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10x Tris-Buffered מלח (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764. K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| אנטי אנושי/עכבר C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| נגד עכבר CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא-אולדריץ' | A9418-100G | |
| קולגנאז D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| צנצנת קופלין | פישר סיינטיפיק | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| שיפוע צפיפות בינוני | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated | מים תרמו Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 מערכת הדמיה מיקרוסקופ | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell Sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| סרום בקר עוברי - פרימיום, מו"פ מומת בחום | D מערכות | S11150H | |
| פישרברנד 96 בארות לוחות פוליסטירן | פישר סיינטיפיק | 12-565-501 | |
| Graphpad פריזמה | GraphPad | N/A | |
| Hank' s תמיסת מלח מאוזנת | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| תוכנת ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM חומצות אמינו לא חיוניות | תרמו פישר סיינטיפיק | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr/J עכברים (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| אמייל ציפורניים | N/A | N/ | A כל חנות קונבנציונלית |
| תרכובת O.C.T | Tisse-Tek | 4583 | |
| עט PAP | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| תבניות הטבעה חד פעמיות Peel-A-Way | Polysciences | R-30 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | תרמו פישר סיינטיפיק | 15140-122 | |
| מי מלח חוצץ פוספט (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| ערכת בדיקה של פירס קומאסי פלוס (ברדפורד) | Thermo Fisher Scientific | 23236 | תקן אלבומין כלול |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | בלוק FcR |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| נתרן פירובט | תרמו פישר סיינטיפיק | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | מכשירים מולקולריים | N/A | תוכנת SoftMax Pro 6.1 |
| מסנני תאים סטריליים 100 ומיקרו; M | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | צבע פלואורסצנטי לניתוח זרימה ציטומטרית |
מקורות
- Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
