פציעת הקפאה בשריר המסה של עכבר להקמת מודל פיברוזיס שריר הלסת

שרירי הלסת הם קריטיים בפעילויות פיזיולוגיות יומיומיות כגון מסטיקציה, דיבור, נשימה והבעות פנים¹. עם זאת, בעיוותים אורופציאליים מולדים, שרירים אלה מפגינים שינויים אטרופיים ופיברוטיים, מה שמוביל לפגיעה בבריאות הגוף ובקוגניציה חברתית². ניתוח שחזור פנים נותר טיפול הקו הראשון, אך עד 30-70% מהמטופלים לאחר הניתוח עדיין סובלים מאובדן שרירים ותפקוד לקוי של שרירים ^3,4 כישלון התחדשות שריר הלסת מיוחס לגורמים פנימיים, שאינם ניתנים לתיקון על ידי ניתוח בלבד.

הופעתם של שרירי הלסת היא חידוש אבולוציוני, המלווה את ראש החוליות המורכב והלב הקאמרי ^5,6. שלא כמו עמיתיהם הגפיים שמקורם בסומיט, שרירי הלסת מקורם בקשת הענפית⁷. תווים פילוגנטיים ואונטוגנטיים אלה עשויים לגרום להם להתנהגויות רגנרטיביות מובחנות⁸. דווח כי שריר המעסה (MAS) פיתח פיברוזיס חמור בזמן ששריר הטיביאליס הקדמי (TA) התחדש במלואו לאחר חשיפה באותה מידה של פציעה ^1,9. עם זאת, המנגנון הבסיסי של התחדשות נותר מובן היטב.

במחקר זה נקבע מודל פציעה מקפיא של שריר המסה של עכברים כדי להקל על חקירת התחדשות שרירי הפנים. בחרנו 14 יום לאחר הפציעה כנקודת הזמן להערכת פנוטיפ פיברוזיס מכיוון שזו הייתה נקודת הזמן המוקדמת ביותר שבה ניתן היה להבחין בסטייה בין שני שרירים. התחדשות מלאה של MAS לאחר פציעה דורשת לפחות 40 שבועות¹. באופן עקבי, מחקר זה גילה שקיעת קולגן יוצאת דופן לאחר פציעה קפואה של MAS בהשוואה להתחדשות רגילה של TA לאחר 14 יום לאחר הפציעה. בעזרת מודל זה ניתן לבצע מחקרים מכניסטיים נוספים על ניוון שרירים ופיברוזיס, אשר בתורו יסייעו בפיתוח דרכים טיפוליות פוטנציאליות לקידום התחדשות שרירי הלסת לאחר הניתוח.

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה במערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (WCHSIRB-D-2020-114). עכברי C57BL/6 זכרים (בני 5 שבועות) גודלו במתקן מבוקר לחות (53 ± 2%) ובטמפרטורה מבוקרת (23 ± 2 מעלות צלזיוס) והיו במחזור אור/חושך של 12 שעות. ראה טבלת חומרים לפרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הקפאת פציעה

1. הרדמה: להרדים את העכברים בכדורי צמר גפן ספוגי איזופלורן ולהזריק tiletamine-zolazepam intraperitoneally במינון של 50 מ"ג / ק"ג. לפני ואחרי ניתוח שיכוך כאבים סופק על ידי הזרקה intraperitoneal של meloxicam במינון של 1 מ"ג / ק"ג. הגנו על עיניהם באמצעות משחה וטרינרית. כרית חימום שנשמרה בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס הוכנסה מתחת לווילון הכירורגי במהלך כל ההליך כדי לספק תמיכה תרמית לחיה. תקנו את העכברים בעזרת סרט הדבקה לאחר שהשכיבו אותם על צדם על שולחן ניתוחים (איור 1). להעריך את מידת ההרדמה על ידי אובדן רפלקס העפעפיים, רפלקס התיקון ורפלקס הנסיגה מדוושה.
   הערה: בעת מריחת חומר הרדמה איזופלואורן, החזק את העכבר ביד אחת ואת כדור הצמר גפן הספוג באיזופלואורן ביד אחרת. הקפידו לשמור את כדור הצמר גפן במרחק מהחיה כדי למנוע אי נוחות וגירוי בעור.
2. הסרת שיער לפני הניתוח: השתמש בסכין גילוח חשמלי כדי לגלח את השיער על השוק והפנים של העכבר ולמרוח את משחת depilatory עם צמר גפן על העור, מכסה את שריר Masseter ואת שריר tibialis הקדמי. לאחר 1-2 דקות, שטפו את העיסה עם מגבון כירורגי על בסיס אתנול (איור 2A ואיור 2G). אתרי הניתוח עברו חיטוי בשלושה סבבים של פילינג על בסיס יוד ו-75% אתנול.
   הערה: סכין הגילוח החשמלי לבדו לא הספיק להסרת שיער, במיוחד באזור המסה. בעת החלת הדבק depilatory, חשוב לא להשתמש להדביק מוגזם. נגבו את העור בעדינות בעת שטיפת המשחה כדי למנוע כוויות בעור.
3. חשיפה לשדה הניתוח: יש לכסות בווילונות כירורגיים לפני הניתוח. עבור שריר MAS, למשש תחילה לאורך הקצה התחתון של הלסת התחתונה. במרחק של 5 מ"מ מהקצה, בצעו חתך של 7 מ"מ לאורך הקו המחבר בין הקו האוראלי לטרגוס (הקו המקווקו מציין את מיקום החתך באיור 2B).
4. עבור שריר TA, יש למשש תחילה לאורך השוק כדי לאתר את הקצה הקדמי של עצם השוקה. חתכו 2 מ"מ אחורית לקצה העור דרך העור בעזרת אזמל, החל מהברך וכלה בקרסול (הקו המקווקו מציין את מיקום החתך באיור 2H). עבור כל עכבר, אם שריר MAS ושריר TA בצד שמאל נפגעים, השתמש בשריר השני בצד הנגדי כבקרה.
   הערה: חתך זה שטחי מאוד כדי להבטיח שהשרירים לא ייפגעו במהלך החתך. החתך בפנים לא צריך להיות קרוב מדי לטרגוס. אחרת, בלוטת הפרוטיד תיחשף, מה שיוביל לדימום מוגזם במהלך תהליך ההקפאה הבא.
5. הקפאת קרח יבש: החזיקו פיסה אחת של קרח יבש עם מלקחיים מקוררים מראש לאורך הצירים הארוכים של שרירי MAS ו-TA (איור 2C ואיור 2I, בהתאמה). הניחו את הקרח היבש ישירות על פני השטח של השריר למשך 5 שניות. אשרו שהשריר נראה נוקשה ולבן בהיר מיד לאחר הסרת הקרח היבש (איור 2D ואיור 2J), אולם הוא חוזר לצבעו ולמרקמו הרגילים תוך 22-25 שניות, בדומה לשריר הסמוך שלא נפגע (איור 2E ואיור 2K).
   הערה: יש לקרר מראש את המלקחיים המחזיקים את הקרח היבש כדי למנוע סובלימציה מהירה של הקרח היבש. טיימר הוא חובה בביצוע פציעת הקפאה של 5 שניות וספירת זמן ההחלמה של 22-25 שניות של השריר. יש לנטוש כל שריר שזמן ההחלמה שלו קצר מ-22 שניות או ארוך מ-25 שניות. שלב זה דורש תרגול.
6. סגירת פצע: לאחר התאוששות מלאה של השריר, סגרו את פצע העור עם לפחות שלושה תפרים 7-0 (איור 2F ואיור 2L).
7. החייאה: כאשר התפר הושלם, הכניסו את העכברים לכלוב עם תמיכה תרמית ועקבו אחריהם ברציפות עד שכל הרפלקסים הנכונים הוחזרו.

2. אוסף שרירים

1. להרדים את העכברים עם מנת יתר של isoflurane, ואחריו נקע צוואר הרחם. קצרו את שרירי MAS ו-TA משני הצדדים לצורך ניתוח היסטולוגי.
2. דיסקציה של שריר MAS: יש לפתוח את העור על פני העכבר ולהסיר את בלוטת הפרוטיד כדי לחשוף את החלק האחורי של שריר ה-MAS. נתחו את MAS מהחיבור הקדמי שלו עד לחיבור האחורי שלו על הלסת התחתונה. האזור המנוקד הלבן מציין את החלק החשוף של MAS (איור 3A).
   הערה: שריר MAS מורכב מתאים עמוקים ושטחיים, שניהם מחוברים באופן הדוק לפני השטח של הלסת התחתונה. הקפד ללחוץ על המספריים ללסת התחתונה במהלך הדיסקציה כדי להבטיח בידוד מלא של MAS. היזהר להבחין בין הזיגומטיקו-מנדיבולריס לבין MAS על ידי גבולותיו בין הזיגומטי ללסת התחתונה.
3. דיסקציה של שריר TA: חתכו את העור מהקרסול ועד הברך והסירו את הפאשיה כדי לחשוף את שריר TA. השתמש בקצה של מלקחיים micro-dissection כדי לבודד את הגיד של TA ולהחליק אותו כל הדרך עד הברך כדי לנתק את הסיבים המתחברים לשוקה. לאחר מכן, חתכו את הגיד בקרסול (איור 3B).
   הערה: עבור שריר TA, ישנם כמה גידי שריר סביב קרסול העכבר; יידרש תרגול כדי להבחין בגיד של ת"א, שהוא הגדול והקרוב ביותר לשוקה.
4. טרום קירור איזופנטאן: מכינים שתי חביות בידוד; ממלאים את החבית הקטנה באיזופנטאן ואת החבית הגדולה בחנקן נוזלי. הניחו את החבית הקטנה בתוך החבית הגדולה 10 דקות לפני נתיחת השריר (איור 3D).
5. הכנת תבנית הטבעה: הכינו תבנית רדיד אלומיניום גלילית לכל דגימה ומלאו אותה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
6. קפוא טרי: השקיעו את השריר ב-OCT, והחזיקו אותו בניצב לתרכובת OCT (איור 3C). השתמש מחזיק מחט כדי להעביר את התבנית לתוך isopentane precooled. המתינו 40 שניות עד שה-OCT יהפוך לבן ומוצק (איור 3D).
   הערה: ודא שמיקום התבנית אינו נמוך מדי. אחרת, האיזופנטאן יתערבב עם ה-OCT ויפגע בתהליך הקפאת השרירים. רמת OCT בתבנית צריכה להיות דומה לגובה דגימת השריר. הימנע מכמות מוגזמת של OCT כדי להבטיח הקפאה מהירה ויעילה.
7. אחסון דוגמאות: אחסנו דגימות שריר קפואות טריות בצלחות 24 בארות המסומנות בבירור. חתכו את הדגימות מיד או אחסנו אותן בטמפרטורה של -80°C לשימוש ארוך טווח.

3. ניתוח היסטולוגי

1. השתמש בהקפאה כדי לחתוך מקטעים בעובי 10 מיקרומטר מדגימת השריר לשקופיות שטופלו על פני השטח.
2. הניחו את המגלשות באצטון קר כקרח למשך 20 דקות וייבשו אותן באוויר במכסה האדים למשך 20 דקות.
3. שטפו את המגלשות במשך 3 x 5 דקות במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
   הערה: משלב זה ואילך, המגלשות נשמרו בתא לחות כדי למנוע התייבשות.
4. סיריוס מכתים אדום
   1. הכינו את תמיסת העבודה Sirius Red על ידי המסת 0.5 גרם של אבקת Sirius Red ב-500 מ"ל של חומצה פיקרית רוויה.
   2. צבעו את המגלשות עם פתרון העבודה Sirius Red למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   3. שטפו את המגלשות במשך 2X5 דקות עם 0.5% חומצה אצטית.
   4. לאחר תהליך הצביעה, הדגימות צריכות להיות מיובשות תחילה באתנול 95% למשך 15 שניות, ולאחר מכן התייבשות באתנול נטול מים למשך דקה אחת. השלב האחרון כולל הרכבה של המגלשה עם בלסם ניטרלי.
5. צביעה אימונוהיסטולוגית
   1. חדרו את המקטעים עם 0.3% טריטון ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטיפת PBS.
   2. עבור צביעת Pax7, חסום את המקטעים באמצעות המגיב שסופק עם הערכה המוזכרת; לצביעת למינין ו-Pdgfrα, יש לחסום עם אלבומין בסרום בקר 5% (BSA) וסרום חמור 5% ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   3. יש לדגור על החלקים עם נוגדנים ראשוניים נגד Pax7, למינין ו-Pdgfrα למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן לשטוף עם PBS למשך 3X5 דקות.
   4. יש לדגור על המקטעים עם נוגדנים משניים מצומדים בצבע פלואורסצנטי למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS במשך 3X5 דקות.
   5. יש לדגור עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS במשך 3 x 5 דקות.
   6. הניחו את אמצעי ההרכבה על החלק, הניחו את הכיסוי מעליו והשתמשו בלק כדי לאטום את הכיסוי.

צביעה אדומה של HE וסיריוס (איור 4 ואיור משלים S1) חשפה התחדשות שרירים מלאה של TA במודל זה של פציעת הקפאה. לעומת זאת, MAS הציג רגנרציה לקויה של מיופייבר ושקיעת מטריצה חוץ-תאית מוגזמת. ההיסטולוגיה של שרירי MAS ו-TA שלמים מוצגת באיור 4A,B, כאשר שרירי המיופייבר נמצאים ביישור והאזור הפיברוטי הופיע רק בחלל הבין-תאי ובין צרורות שונים. בעוד ששריר TA נשאר במידה רבה באותו מבנה שריר כמו השליטה השלמה שלו לאחר 14 יום לאחר הפציעה (איור 4G-J), המבנה של שריר MAS הופר באופן חמור (איור 4C-F). אזורים פיברוטיים הופיעו במקום של כמעט כל סיבי השריר בחתכים הקדמיים, האמצעיים והאחוריים של שריר MAS (איור 4C-F).

צביעה אימונוהיסטולוגית של Pax7 (איור משלים S2) ו-Pdgfrα הקלה על חקירה נוספת של תאי לוויין שריר (MuSCs) ואבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs), בהתאמה. בשריר MAS, ברזולוציה של 14 dpi, הופיעו גרעינים מאוכלסים בצפיפות, אך ללא MuSCs מוגברים באופן יחסי (איור 5A,B). מספר גדול של מיופייברים בעלי גרעין מרכזי (מוצגים על-ידי ראש החץ הכחול) זוהו בת"א ב-14 dpi (איור 5H), בעוד שקווי המתאר של שרירי ה-myofiber כמעט ולא הורגשו ב-MAS באזור הפגוע (איור 5E,F). במקום זאת, נצפתה חדירה של FAPs חיוביים ל-Pdgfrα ושל שרירי מיופייבר בקוטר קטן שנוצרו לאחרונה (מחודדים על-ידי חיצים לבנים) (איור 5F).

איור 1: סקירה כללית של מערך הניתוח. (A) העכבר הורדם והתקבע על שולחן הניתוחים. השיער הוסר מהפנים והרגל בצד שמאל. טיימר שימש כדי לפקח על הקפאת השרירים וזמן ההתאוששות. (B) קרח יבש, בקוטר 3.5 מ"מ ובגובה 6-12 מ"מ, הוכן בתוך זכוכית להקפאה. המלקחיים צוננו בקרח יבש לשימוש מאוחר יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: התיעוד התוך-ניתוחי של פציעת הקפאת MAS ו-TA. (A) הסרת שיער להקפאת MAS. (B) פתח את העור כדי לחשוף את שריר ה-MAS. (C) הקפאה עם קרח יבש לאורך הציר הארוך של MAS. (D) הופעת MAS מיד לאחר 5 שניות של הקפאה. (E) הופעת MAS לאחר 22-25 שניות של התאוששות. (F) סגירת פצע בפנים. (ז) הסרת שיער להקפאת ת"א. (H) לפתוח את העור כדי לחשוף את שריר TA. (I) הקפאה באמצעות קרח יבש לאורך הציר הארוך של ת"א. (J) הופעת ת"א מיד לאחר 5 שניות של הקפאה. (K) הופעת ת"א לאחר 22-25 שניות של החלמה. (L) סגירת פצע ברגל. קיצורים: MAS = Masseter; TA = tibialis anterior. קווים מקווקווים באיורים 2B ו-2H מציינים את מיקום החתכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: קצירת שרירי MAS ו-TA. (A) הופעת שריר MAS לאחר 14 יום לאחר הקפאת הפציעה. האליפסה המקווקו האדום מציינת MAS; המשולש המקווקו הלבן מראה את החשיפה של שריר MAS. (B) הופעת שריר TA לאחר 14 יום לאחר הקפאת הפציעה. האליפסה המקווקו האדומה מציינת את TA. (C) השקיעו את דגימת השריר בתרכובת OCT בצורה אנכית. (D) העבירו את דגימת השריר לאיזופנטאן מקורר חנקן. קיצורים: MAS = Masseter; TA = טיביאליס קדמי; OCT = טמפרטורת חיתוך אופטימלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח היסטולוגי של שרירי MAS ו-TA. סיריוס מכתים אדום של שלם (A-E) קטע שריר שלם של MAS וחלקים קדמיים, אמצעיים ואחוריים של MAS ב 14 dpi. (פ-י) חתך שרירי שלם של TA וחלק קדמי, אמצעי ואחורי של TA ב 14 dpi. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: MAS = Masseter; TA = טיביאליס קדמי; dpi = ימים לאחר הפציעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח אימונופלואורסצנטי של שרירי MAS ו-TA. צביעה חיסונית של Pax7 ו- DAPI (כחול) ב- (A) MAS שלם, (B) 14 dpi MAS, (C) TA שלם ו- (D) 14 dpi TA. Immunostaining של למינין, Pax7 ו- DAPI (כחול) ב- (E) MAS שלם, (F) 14 dpi MAS, (G) TA שלם ו- (H) 14 dpi TA. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: MAS = Masseter; TA = טיביאליס קדמי; dpi = ימים לאחר פציעה; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. החצים הלבנים מציינים את הסיב בקוטר קטן מייצג של MAS. האזור הכחול המנוקד והחצים מציינים את המיופייבר המתחדש המייצג ואת הגרעינים המרכזיים של TA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: פיברוזיס מתמשך במהלך התחדשות שרירים. (A) המחשה סכמטית של התחדשות שרירי TA ו-MAS הנגרמת על ידי פציעת הקפאה. (ב-ג) תמונות מייצגות של המטוקסילין וכתמי אאוזין בחתכי שריר TA ו-MAS בנקודות זמן שונות לאחר פציעה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. נתון זה משוכפל מצ'נג ואחרים 8. קיצורים: MAS = Masseter; TA = טיביאליס קדמי; dpi = ימים לאחר הפציעה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: פגיעה בתהליך מיוגנזה. (A) תמונות אימונופלואורסצנטיות של Pax7 (ירוק) ו-DAPI (כחול) בשריר TA ו-MAS. (B) כימות של אחוז גרעיני Pax7 חיוביים/DAPI. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר * מציין שונה באופן משמעותי מבקרת השרירים השלמים. # מציין שונה משמעותית מהשריר השני באותה נקודת זמן. **p < 0.01, ##p < 0.01. נתון זה משוכפל מצ'נג ואחרים 8. קיצורים: MAS = Masseter; TA = טיביאליס קדמי; dpi = ימים לאחר פציעה; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.