חומצה רטינואית קטיונית בעטוף ננו-תחליב כאדג'ובנט לקידום תגובות מערכתיות וריריות ספציפיות ל-OVA

אדג'ובנטים משמשים לעתים קרובות כדי לשפר את היעילות של חיסון על ידי גירוי המערכת החיסונית להגיב חזק יותר לחיסון, ובכך להגדיל את החסינות לפתוגן מסוים¹. ננו-תחליב (NE) אדג'ובנט מתייחס למערכת פיזור קולואידית עם יציבות תרמודינמית על ידי תחליב חלק מסוים של פאזת שמן ופאזה מימית כדי לייצר תחליב בצורה של מים בשמן (W/O) או שמן במים (O/W)². אדג'ובנט ננו-תחליב O/W יכול לייצר ציטוקינים וכימוקינים באתר ההזרקה, לגרום לצבירה מהירה ולשגשוג של תאים חיסוניים חשובים כגון מונוציטים, נויטרופילים ואאוזינופילים, לשפר את התגובה החיסונית, ולשפר את האימונוגניות של אנטיגנים³. נכון לעכשיו, שלושה אדג'ובנטים של ננו-תחליב (MF59, AS03 ו-AF03) קיבלו רישיון לשימוש בחיסונים והראו בטיחות ויעילות טובות⁴.

עם זאת, חסינות הרירית טופלה בצורה גרועה על ידי פורמולציות האדג'ובנטיות המורשות כיום בחיסון פרנטרלי קונבנציונאלי⁵. דווח כי חומצה רטינואית (RA) גורמת לביות מעיים של תאי מערכת החיסון, אך הקוטביות הנמוכה שלה, המסיסות הירודה שלה במים, האור החלש והיציבות התרמית שלה מגבילים את השימוש בה לחיסון אנטרי חזק. ננו-תחליבים מציעים הזדמנויות להגדיל את הזמינות הביולוגית של תרופות ליפופיליות מאוד, וליבת השמן של אדג'ובנטים של תחליב O/W מתאימה להמסת חומרים לא קוטביים כגון RA⁶. לכן, ננו-תחליבים יכולים לשמש כנשאים עבור RA על מנת להשיג את אפקט התגובה הכפולה של חסינות מערכתית וחסינות רירית.

בהשוואה למערכות משלוח ניטרליות או אניוניות, למערכות משלוח קטיוניות יש יכולות אנקפסולציה ומסירה יעילות יחסית של אנטיגן, שיכולות לשפר את האימונוגניות של אנטיגנים ^7,8,9. מטען פני השטח הקטיוני של מגוון מערכות אדג'ובנטיות חשוב להשפעתן האדג'ובנטית 10,11,12. המטען הקטיוני הוא גורם חשוב בהארכת שימור החיסון באתר ההזרקה, הגברת הצגת האנטיגן והארכת גירוי החסינות התאית בגוף¹².

בהתבסס על השיקולים לעיל, פיתחנו ננו-תחליב קטיוני כדי לספק ביעילות RA ואנטיגנים. גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטה של הננו-תחליב נקבעו באמצעות פיזור אור דינמי (DLS), והתגובות החיסוניות המערכתיות והריריות של ננו-תחליב בשילוב עם OVA הוערכו על ידי הזרקה תוך שרירית¹³.

הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לשימוש וטיפול בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה לרווחת חיות מעבדה ואתיקה של האוניברסיטה הצבאית השלישית לרפואה.

1. הכנת ננו-תחליבים (NEs)

1. להכנת פאזה מימית, יש להמיס 0.15 גרם פוליסורבט 80 ב-28.2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) תוך ערבוב ב-40°C.
2. להכנת שלב השמן, השתמש בנוסחת פאזת השמן של ננו-תחליב המוצג בטבלה 1. ממיסים את הטרילאט הסוריניטני 85, DOTAP ו-RA בסקוואלן תוך ערבוב ב-40°C.
3. להכנת תחליב O/W ראשוני, ערבבו את פאזת השמן באופן מגנטי ב-1,400 סל"ד תוך הוספת המימית לאט ובטיפה בקצב של 1 מ"ל/דקה. בצעו תחליב מראש את התערובת באמצעות מתחלב גזירה גבוה ב-30,000 סל"ד למשך 6 דקות.
4. עבור הומוגניזציה בלחץ גבוה (HPH), טפל בתחליב O/W הראשוני שהוכן לעיל עם הומוגנייזר בלחץ גבוה במשך 12 מחזורים ב- 900 בר כדי לקבל ננו-תחליב הומוגני בטווח של 160-190 ננומטר.
5. בסוף התהליך, אספו את התחליב בבקבוק של 50 מ"ל וסננו את התחליב דרך קרום מסנן PES של 0.2 מיקרומטר.
6. חברו את הבקבוק לקו שלנק דרך הצנתר, סובבו את הסטופקוק התלת-כיווני כדי לחבר את המערכת לשפופרת הוואקום והפעילו את משאבת הוואקום כדי ליצור ואקום בצלוחית. לאחר מכן, מסובבים את הסטופקוק המשולש, מחברים את המערכת לצינור ארגון וממלאים אותו בארגון. חזור על שלב זה 3 פעמים כדי לוודא שהבקבוק מלא בארגון.
7. החלף את הפקק ואטם עם סרט paraffine, לעטוף את הבקבוק בנייר כסף ולאחסן אותו ב 4 ° C.

2. אפיון הננו-אמולסיות

1. גודל חלקיקים וזיהוי פוטנציאל זטה
   1. הפעל את המכשיר והמתן 30 דקות עד שמקור אור הלייזר יתייצב.
   2. לדלל את NE 50-fold עם מים טהורים במיוחד ולהוסיף 1 מ"ל של דגימה לתא הדגימה המתאים.
   3. כדי למדוד את גודל החלקיקים, כוונו את הטמפרטורה ל-25°C, בחרו מים כמדיום לפיזור ובחרו כלי פלסטיק חד-פעמיים כתא המדידה. טען את הדגימות ומדוד באופן אוטומטי. דווח על הערך הממוצע של שלוש מדידות חוזרות עבור כל דגימה כתוצאה הסופית.
   4. למדידת פוטנציאל זטה, הגדר את הטמפרטורה ל -25 מעלות צלזיוס. בשל הבחירה בפאזה המימית כמדיום הפיזור, בחר במודל סמולוצ'וסי, ובתא הנימי המקופל כתא המדידה. טען את הדגימות ומדוד באופן אוטומטי. דווח על הממוצע של שלוש מדידות משוכפלות עבור כל דגימה כתוצאה הסופית.
2. קביעת קצב אנקפסולציה וקצב העמסת תרופות
   1. כדי לקבוע את כמות RA טעון NE, להשתמש אתנול מוחלט כדי demulsify ולחלץ את RA מן NE. כדי 5 μL של דגימה, להוסיף 995 μL של אתנול ולקבוע את התוכן RA של הפתרון באמצעות ספקטרופוטומטר ב 355 ננומטר. השווה את הספיגה לעקומה סטנדרטית. השתמש במשוואה הבאה:
      אנקפסולציה = עומס RA בפועל / משקל של תרופה נוספת
      קצב העמסת תרופות = העמסת RA בפועל / איכות הדגימה

3. נהלי חיסון ואיסוף דגימות

1. הליך החיסון והקיבוץ
   1. נקבות קבוצת עכברי Balb/C בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל של כ-18-21 גרם בקבוצות של 5 לחיסון ביום 0, יום 14, יום 28 על פי קבוצות הניסוי הבאות: (1) קבוצת PBS, (2) קבוצת אובאלבומין (OVA), (3) קבוצת OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA), (4) קבוצת OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA).
   2. חסן את כל העכברים על ידי הזרקה תוך שרירית לשרירי הארבע ראשי העליונים עם 200 μL של נוסחאות חיסון שונות: 100 μL של תחליב ו 15 מיקרוגרם OVA נספג ב 100 μL של PBS, מעורבב לפני מתן המוצר. יש להזריק 100 μL/רגל אחורית. עבור עכברים בקבוצת הביקורת לנהל PBS לבד.
   3. המתת חסד: המתת חסד של כל העכברים על ידי זריקה תוך צפקית של 100 מ"ג / ק"ג של 1% נתרן pentobarbital 2 שבועות לאחר השלמת שלושת החיסונים.
   4. איסוף דגימות ועיבוד: לאחר המתת חסד, השתמש מספריים כדי לחתוך את החזה של עכברים ולהכניס מזרק ישירות לתוך הלב כדי לשאוף כ 0.5 מ"ל של דם שלם. אפשר את הדם לעמוד במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F). יש לאסוף סרום, aliquot ולאחסן ב -80 °C לניתוח נוסף.
   5. יש לאסוף דם מלא, טחול, נוזל שטיפת נרתיק (VLF), נוזל שטיפה סימפונות (BALF), נוזל שטיפת אף (NLF) ונוזל שטיפת מעי דק (SILF).
2. בידוד של לימפוציטים טחול
   1. משרים עכברים באתנול 75% (v/v) לעיקור קצר, מעבירים את העכברים לספסל נקי. לחתוך את העור על הבטן השמאלית עם מספריים, לחשוף ולהסיר את הטחול.
   2. מניחים את הטחול בצלחת פטרי המכילה 3 מ"ל PBS, טוחנים ומסננים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל באמצעות מסננת (200 רשת, 70 מיקרומטר) ומוט השחזה.
   3. צנטריפוגה את התאים ב 650 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את supernatant ולהשעות את המשקע עם 3 מ"ל של תמיסת ליזה של תאי דם אדומים, לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   4. הוסף 10 מ"ל של PBS לצינור ולנער היטב כדי לסיים את התגובה, ולאחר מכן צנטריפוגה אותו ב 650 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-10 מ"ל PBS, הוסיפו 20 מיקרוליטר של דילול התא למונה התאים האוטומטי לצורך ספירת תאים.
   6. צנטריפוגה את התאים ב 650 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט ולדלל את התאים ל-1 x 10⁶ תאים/מ"ל עם 1640 תווך מלא (1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% נסיוב בקר עוברי).
3. אוסף VLF: יש לשטוף את הנרתיק 4x עם 75 μL של 1% BSA/PBST, לשלב את תמיסת השטיפה ולאסוף בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל, צנטריפוגה ב 5000 x גרם ב 4 ° C במשך 20 דקות ולאסוף את supernatant עם פיפטה ולאחסן ב -80 ° C.
4. אוסף BALF ו-NLF
   1. יש לחטא את העכברים לאחר ההקרבה באתנול 75% (v/v). החזק את בטן העכבר למעלה ויישר את הצוואר. השתמש מספריים כדי לבצע חתך אורכי בעור של צוואר העכבר ולהשתמש מלקחיים כדי להפריד את השרירים לחשוף את קנה הנשימה כראוי.
   2. חותכים את קנה הנשימה דרך פתח רוחבי קטן ומכניסים את הצינור לכיוון הריאות, מחברים את המזרק לצינור ומזריקים 0.5 מ"ל PBS לריאות ונסוגים, חוזרים על שטיפה 3x וצנטריפוגה ב 650 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות, לאחסן את supernatant (BALF) ב -80 ° C.
   3. הפוך את הצינור לחלל האף, חבר את המזרק לצינור והזריק 0.5 מ"ל של PBS, הנוזל יזרום דרך חלל האף לתוך צינור הצנטריפוגה 1.5 מ"ל. שאפו את השטיפה מצינור הצנטריפוגה וחזרו על השטיפה 2x, לאחר מכן צנטריפוגה ב 650 x גרם ב 4 °C במשך 5 דקות, לאחסן את supernatant (NLF) ב -80 ° C.
5. אוסף SILF
   1. הכינו תמיסת PBS המכילה מעכב טריפסין 0.1 מ"ג/מ"ל, 50 mM/L EDTA-2Na, 1 mM/L פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) כתמיסת שטיפת המעי הדק. יש לערבב בטמפרטורת החדר עד להתמוססות ולאחסן ב-4°C.
   2. חותכים את המעי הדק לפתוח לאורך צינור המעי לטבול 3 מ"ל של נוזל שטיפה במעי הדק. יש לערבב על ידי ניעור אנכי ב-15 סל"ד למשך 30 דקות ב-4°C. צנטריפוגה ב 1440 x גרם ב 4 ° C במשך 20 דקות ולאסוף את supernatant עם פיפטה, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 5000 x גרם ב 4 ° C במשך 20 דקות. אחסנו את הסופרנאטנט (SILF) בטמפרטורה של -80°C.

4. הערכה של תגובת נוגדנים ספציפית ל- OVA לאחר מתן תוך שרירי

1. לקבוע רמות של IgG בסרום, תת-מחלקות של IgG1, IgG2a ואת רמות sIgA ספציפיות ב- VLF, BALF, NLF ו- SILF על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA).
2. לציפוי אנטיגן, יש לדלל את OVA ל-5 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות חיץ ציפוי, ולצפות צלחות ELISA של 96 בארות למשך הלילה ב-4°C עם 100 מיקרוליטר של תמיסת OVA לכל באר.
3. יש לשטוף את צלחות ELISA 5x עם PBST ולחסום על ידי דגירה עם 250 μL של 1% BSA/PBST ב-37°C למשך שעתיים.
4. יש לשטוף את צלחות ELISA 5x עם PBST, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של הדגימה מדולל כמתואר להלן כדי להיבדק ולדגור ב 37 ° C במשך 1 שעות. סרום מדולל, VLF, BALF, NLF עם 0.5% BSA/PBST, סילף מדולל עם 20% סרום עגל עוברי (FCS)/PBST.
   1. התחל על ידי דילול הסרום 1000x באמצעות הליך דילול דו-שלבי: לדלל 20 μL של סרום ל 1 מ"ל, ולאחר מכן לדלל 25 μL של סרום מדולל זה ל 500 μL. השתמש בדילול זה של סרום לזיהוי של IgG1, IgG2a.
5. הוסף 200 μL של הסרום מדולל ב 1000x לשורה הראשונה של הצלחת המצופה ולהוסיף 100 μL של 0.5% BSA/PBST לכל הבארות למעט השורה הראשונה. מעבירים 100 μL מהשורה הראשונה לשורה השנייה ומערבבים 10x עם הפיפטה. חזור על שלב זה עד שורה 8 ולהשליך 100 μL של נוזל, הסרום של ריכוזים שונים התקבל לזיהוי של IgG.
6. בצע דילול 1:1 של BALF, NLF ו- SILF כדי לזהות IgA. השתמש באותו הליך דילול עבור VLF כמו זה עבור סרום.
7. שטפו את צלחות ELISA 5x עם PBST. הוסף 100 μL של עז מצומדת HRP נגד עכבר IgG/IgG1/IgG2a/IgA (מדולל 1:10000 עם PBST) לבארות המתאימות ודגור ב 37 ° C במשך 40 דקות.
8. שטפו את צלחות ELISA 5x עם PBST, הוסיפו 100 μL של מצע TMB ELISA (רגיש במיוחד), והעבירו את הצלחת למקום מוגן מאור למשך 5 דקות. הוסף מיד 100 μL של תמיסת עצירה של 450 ננומטר עבור מצע TMB כדי לעצור את התגובה.
9. מדוד את הספיגה (OD) ב- 450 ננומטר עבור כל באר וחשב את טיטר הנוגדנים על ידי לקיחת פי 2.1 מערך הסרום של עכבר הקבוצה הריקה כערך התגובה החיובית.

5. בדיקת ELISpot

1. עקוב אחר ההנחיות עבור ELISpot Plus, השתמש בעכבר IFN-γ (ALP) מהערכה כדי לבצע את הבדיקות.
2. מוציאים את הצלחת מהאריזה האטומה ושוטפים 4x עם PBS סטרילי (200 מיקרוליטר/באר). מזננים את הצלחת ב-1640 מדיום שלם (200 מיקרוליטר/באר) ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר את המדיום והוסף את הריכוז המותאם של תרחיף לימפוציטים שהוכן בשלב 3.2.2 (100 μL / באר) לצלחת, ולאחר מכן הוסף 100 μL של הגירוי כלומר, 1640 מדיום שלם המכיל 20 מיקרוגרם / מ"ל OVA257 ~ 264 או OVA323 ~ 339 או 1640 מדיום שלם. מניחים את הצלחת באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 48 שעות. עטפו את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי למנוע אידוי.
4. השליכו את מתלה התא ושטפו את הצלחת 5x עם PBS (200 μL/well). יש לדלל את נוגדן הזיהוי (R4-6A2-ביוטין) ל-1 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS המכיל 0.5% סרום עגל עובר (PBS-0.5% FCS). מוסיפים 100 μL/באר ודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
5. יש לשטוף את הצלחת כמו בשלב 5.2. לדלל את streptavidin-ALP (1:1000) ב PBS-0.5% FCS ולהוסיף 100 μL / באר, לדגור במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
6. יש לשטוף את הצלחת כמו בשלב 5.2. סנן את פתרון המצע המוכן לשימוש (BCIP/NBT-plus) דרך מסנן 0.45 מיקרומטר והוסף 100 מיקרוליטר/באר. יש לפתח עד להופעת נקודות ברורות.
7. עצרו את התפתחות הצבע על ידי שטיפה נרחבת במי ברז, הסירו את הפלסטיק הרך והשאירו את הצלחת לייבוש.
8. בדוק וספור כתמים בקורא ELISpot.

6. ניתוח סטטיסטי

1. נתח את ההבדלים בין נתונים של 4 קבוצות על ידי ANOVA חד כיווני ואחריו Tukey השוואה מרובים לאחר המבחן. בטא את כל התוצאות כממוצע ± SD. ערך P קטן מ- 0.05 נחשב למשמעותי.

בסך הכל הוכנו ארבע פורמולציות ננו-תחליב שאופיינו על-ידי גודל החלקיקים שלהן (איור 1), פוטנציאל הזטה שלהן ויעילות האנקפסולציה שלהן כפי שמוצג בטבלה 2. גודל החלקיקים היה מרוכז סביב 160-190nm והתוספת של DOTAP הפכה את פוטנציאל Zeta של ננו-תחליב. IgG בסרום ספציפי ל-OVA ותת-הקבוצה שלו ברמת נוגדנים בסרום זוהו שבועיים לאחר החיסון השלישי. החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב הגדיל באופן משמעותי את טיטר הנוגדנים IgG, IgG1 ו-IgG 2a הספציפיים ל-OVA בסרום (איור 2). חשוב מכך, רמות ה-sIgA הספציפי בנוזל שטיפת הנרתיק ובנוזל שטיפת המעי הדק השתפרו באופן משמעותי כאשר OVA היה אדג'ובנט עם CNE-RA (איור 3). בבדיקת ELISpot לא נמצאו כתמים משמעותיים.

איור 1: גודל קוטר והתפלגות. (A) גודל קוטר והתפלגות של NE-RA. (B) גודל, קוטר ופיזור של CNE-RA. d.nm הוא הקוטר הממוצע של החלקיקים בננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: IgG בסרום ספציפי ל-OVA ותת-הקבוצה שלו רמות נוגדנים בסרום. IgG בסרום ספציפי ל-OVA ותת-הקבוצה שלו רמות נוגדנים בסרום שבועיים לאחר השלמת שלושת החיסונים. (A) ערך Log2 של titers IgG. (B) צפיפות אופטית מסוג IgG1 ב-450 ננומטר. (C) צפיפות אופטית מסוג IgG2a ב-450 ננומטר. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD (n = 5), ***: P<0.001. השוואות של ההבדלים בין הקבוצות לבין קבוצת PBS מוצגות ישירות מעל העמודות באיור ומסומנות באופן הבא: ns: no significance, #p<0.05, ###p<0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: sIgA ספציפי ל-OVA. sIgA ספציפי ל-OVA בנוזל שטיפה בנרתיק, נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי, נוזל שטיפת אף, נוזל שטיפה במעי הדק. (A) נוזל שטיפה בנרתיק, (B) נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי, (C) נוזל שטיפת אף, ו-(D) נוזל שטיפה במעי הדק. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD (n = 5), ns: אין משמעות, *p<0.05; עמ<0.001. השוואות של ההבדלים בין הקבוצות לבין קבוצת PBS מוצגות ישירות מעל העמודות באיור ומסומנות באופן הבא: ns: no significance, ###p<0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: נוסחת שלב השמן של NEs.

טבלה 2: מאפיינים פיסיקוכימיים של NEs.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים בעבודה זו.