בדיקת חדירות קרום ליפוזום לחקירת ההשפעות של קבוצות פוספטידילינוזיטול פוספט על הפעולה הממברנוטרופית של ארס PLA₂

פוספטידילינוזיטול (PI) הוא פוספוליפיד אניוני המורכב מעמוד שדרה של חומצה פוספטית המקושר לאינוזיטול, טבעת הקסהידרוקסית בעלת שישה פחמנים, באמצעות קבוצת פוספט. ניתן להמיר אינוזיטול באופן הפיך לפוספואינוזיטידים על ידי זרחון במיקומי פחמן², 3, 4, 5 ו-6 1. PI ופוספואינוזיטידים נמצאים בממברנות פלזמה ובאברונים של תאים שונים על פני בעלי חיים, צמחים ומיקרואורגניזמים. שבעים שנה לאחר גילויים על ידי Mable ו-Lowell Hokin ^2,3,4, PI ופוספואינוזיטידים נותרו נושא למחקר מקיף שמטרתו להבין את המנגנונים המולקולריים שלהם ואת הרלוונטיות שלהם לבריאות האדם ^5,6,7.

מלבד רקמת המוח, פוספואינוזיטידים נמצאים בדרך כלל בריכוזים נמוכים, המהווים כ-0.5 עד 1% מסך השומנים בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. הנתונים שפורסמו מצביעים על כך שסביר להניח ש-PI לא ימלא תפקיד מבני מרכזי בתנאים פיזיולוגיים¹. עם זאת, במצבי מחלה, רמות ה-PI והפוספואינוזיטידים עולות, והם מתהפכים לעלון החיצוני של קרום הפלזמה, מה שמצביע על כך שפוספוליפידים אלה עשויים להיות קשורים לעמידות למחלות¹. למרות שבמשך זמן רב חשבו ש-PI ממלא תפקיד פיזיולוגי פחות משמעותי בהשוואה לפוספואינוזיטידים, ראיות מתפתחות מדגישות את החשיבות של PI-4-P ו-PI-4,5-P₂ בתהליכים פיזיולוגיים שונים¹. תהליכים אלה כוללים איתות תוך-תאי, העברת אותות בין-תאיים ^8,9,10, סחר בממברנה 11,12,13, אפנון ביטוי גנים¹, כמו גם התפשטות תאים¹⁴ והישרדות¹. למרות זאת, המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם PI ופוספואינוזיטידים מניעים תהליכים אלה נותרו לא מובנים היטב.

PI ופוספואינוזיטידים נמצאים בשפע בתאי רקמת המוח, שם הם מהווים כ-10% מכלל הפוספוליפידים, אם כי רמותיהם עשויות לעלות באופן זמני בשלבים המוקדמים של מחלות מוח, מה שמרמז על כך שפוספואינוזיטידים עשויים לנטרל את התפתחותן של פתולוגיות נוירולוגיות¹ כגון טרשת נפוצה ומחלת אלצהיימר המופעלת על ידי דה-מיאלינציה אקסונלית הנגרמת על ידי פעילות חריגה של PLA₂^{s 15, 16,17}. אנזימים אלה שייכים למחלקות ולקבוצות השונות כולל פוספוליפאז מפריש מקבוצה IIA A₂ (sPLA₂)¹⁵. רמות גבוהות של קבוצת אנזימים זו נמצאות בנוזל המוח של חולים עם טרשת נפוצה ואלצהיימר, שם הם תורמים לפירוק ממברנות המיאלין, מה שמוביל לדמיאלינציה¹⁵. כמו כן, דווח כי sPLA_2sמארס נחשים מעכב העברה בסינפסות עצביות-שריריות^18,19, גורם להפרעות במערכת העצבים המרכזית ומשפיע לרעה על המערכת העצבית-שרירית ההיקפית²⁰.

במחקר זה, חקרנו האם PI ופוספואינוזיטידים יכולים להגן על ממברנות פוספוליפידים מודל מפני ההשפעות של אנזימי sPLA₂ המתבטאים באופן חריג. ממברנות המודל היו עשויות מפוספטידילכולין (PC), הפוספוליפיד הנפוץ ביותר בכל ממברנות תאי היונקים²¹, מועשר ביחס מולארי של 20% של PI, PI-4-P או PI-4,5-P₂. כדי לחקות את ההשפעות של אנזימי sPLA₂ המתבטאים באופן חריג על ממברנות המודל, השתמשנו בתת-היחידה הבסיסית HDP-2P של אנזים PLA₂ מפריש ארס צפע^{מקבוצה IIA}, שפעילותו ההידרוליטית נחקרה בעבר על ממברנות מיאלין מודל²³.

לצורך עבודה זו, פיתחנו גישה חדשה לחקירת שינויים בחדירות של ממברנות ליפוזומליות המושפעות מ-HDP-2P. השיטה החדשנית מבוססת על תגובת החלפת ליגנד בתמיסת CuSO₄ מחוץ לליפוזומים, הכוללת ליגנד NH₃ הכלוא בתוך הליפוזומים. אם חדירות הממברנה המושרה על ידי HDP-2P מאפשרת דליפת NH₃ מליפוזומים, האמוניה המשתחררת תחליף כמותית ארבע מולקולות מים ביוני נחושת מיובשות באמצעות התגובה: [Cu(H₂O)₆]²⁺ (aq) + 4NH₃ (aq) [Cu(H₂O)₂(NH₃)₄]²⁺ (aq) + 4H₂O (l). חילופי ליגנד אלה מייצרים עלייה אופיינית בצפיפות האופטית של התמיסה הניתנת למדידה על ידי ספקטרופוטומטריה (λ = 600 ננומטר), המשמשת כקריאה הכמותית שלנו לשינויים בחדירות הממברנה. הגישה שלנו המבוססת על החלפת ליגנד מדגימה רגישות מעולה להערכת חדירות הממברנה בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות כמו ¹H-NMR 23,24,25,26,27,28 ומבחני הובלת יונים²⁹, תוך שהיא מציעה את היתרון הנוסף של אי דרישת מכשור יקר. שיטה פשוטה וחסכונית זו, המיושמת בשילוב עם מדידות פעילות הידרוליטית HDP-2P וסימולציה בסיליקו של קשירת PI, PI-4-P ו-PI-4,5-P₂ למשטח המולקולרי של HDP-2P, אפשרה לנו להסיק כי הפוספטים של טבעת האינוזיטול ב-PI מבטלים את ההשפעות המשבשות של HDP-2P על ממברנות PC המועשרות ב-PI-4-P או PI-4, 5-עמ'₂. אם ממצא זה יאושר במחקרים נוספים, היכולת של פוספטים טבעתיים אינוזיטול ב-PI להגן מפני ההשפעות המזיקות של חלבונים תאיים הפועלים באופן חריג, מה שעלול לתרום ליציבות הממברנה במצבי מחלה הכוללים פעילות חלבון חריגה, עשויה לסלול את הדרך לפיתוח תרופות חדשות לטיפול בהפרעות נוירולוגיות כגון מחלת אלצהיימר וטרשת נפוצה.

1. סימולציה בסיליקו של אינטראקציה HDP-2P עם PI ופוספואינוזיטידים באמצעות תוכנת מידול מולקולרי

1. התקנה והכנה של תוכנה
   1. התקן את עורך השרטוט הכימי המוזכר לבניית מולקולות ליגנד כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S1A.
   2. התקן את תוכנת המידול המולקולרי לעגינה מולקולרית של ליגנד לקולטן.
   3. התקן את כלי העגינה האוטומטיים להכנת ליגנד וקולטנים.
   4. מכיוון שתוכנת הדמיית המידול המולקולרי תלויה בסביבת Python, התקן את Python.
2. הכנת ליגנד
   1. ראשית, השתמש בעורך השרטוט הכימי כדי לבנות את הקואורדינטות האטומיות עבור מבנים מולקולריים של PI, PI-4-P, PI-4,5-P₂, קרדיוליפין ופוספטידילסרין.
      הערה: הפרוטוקול לדוגמה בשלבים הבאים של הכנת הליגנד מתאר את השלבים עבור PI בלבד.
   2. בנה את המבנה המולקולרי של PI באמצעות עורך השרטוט הכימי כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S1B ושמור את הקובץ בפורמט PDB כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S2.
   3. פתח את ה-PDB file בתוכנת כלי העגינה האוטומטי כפי שמוצג ב-Supplemental File 1-Supplemental Figure S3A.
   4. הוסף אטומי מימן כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S3B ובחר אטומי מימן קוטביים או את כל אטומי המימן כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S4A.
      הערה: לאחר השלמת עגינת PI עם HDP-2P, בחר רק אטומי מימן קוטביים כדי לפשט את ההדמיה של קשרי קוטב או מימן.
   5. הגדר את מולקולת ה-PI כליגנד עבור תוכנת כלי העגינה האוטומטי כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S4B.
   6. שמור את הליגנד כקובץ PDBQT כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S5A. הקפד להפוך את כל אגרות החוב לניתנות לסיבוב.
3. הכנת קולטנים
   1. הורד את קובץ ה-PDB של פוספוליפאז A₂ HDP-2 (קוד PDB 2I0U), המורכב משני מונומרים, האחד חומצי, לא פעיל אנזימטית, A, והשני בסיסי, פעיל אנזימטית, E. כדי למחוק מונומר לא פעיל אנזימטית A, ייבא את קובץ 2I0U לתוכנת המידול המולקולרי (קובץ משלים 1 - איור משלים S5B), בחר את כל האטומים של מונומר A (קובץ משלים 1 - איור משלים S6A), ולאחר מכן עבור אל ערוך ומחק את כל האטומים של מונומר A (קובץ משלים 1 - איור משלים S6B). שמור על מונומר E פעיל אנזימטית, המוגדר כעת כקולטן.
   2. פתח את קולטן HDP-2P PDB file בתוכנת כלי העגינה האוטומטי כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S7.
   3. הסר את כל מולקולות המים כפי שמוצג בקובץ משלים 1 - איור משלים S8A.
   4. הוסף אטומי מימן כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S8B. שימו לב שלאחר השלמת עגינת HDP-2P עם PI, יש לבחור רק מימנים קוטביים כדי לפשט את ההדמיה של קשרים קוטביים ומימן.
   5. הגדר את ה-HDP-2P כקולטן, כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S9A, ושמור אותו כקובץ PDBQT. ודא שהקולטן מוגדר ללא קשרים הניתנים לסיבוב.
4. הגדרת פרמטר עגינה
   1. פתח גם את הליגנד וגם את קבצי ה-PDBQT של הקולטן.
   2. היכנס לממשק הגדרת תיבת הרשת, כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S9B, והגדר את גודל תיבת הרשת (גודל x = 44.644; גודל y = 74.939; גודל z = 43.050) ואת המרכז (מרכז x = 25.626; מרכז y = 9.582; מרכז z = 41.825), הסוגרים באופן מלא את כל פני השטח של מולקולת הקולטן כפי שמוצג בקובץ משלים 1 - איור משלים S10A.
   3. סגור את ממשק ההתקנה של תיבת הרשת עם ההגדרות הנוכחיות כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S10B ושמור את פרמטרי העגינה בקובץ config.txt כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S11A.
5. הפעלת תוכנת העגינה המולקולרית
   1. הפעל את תוכנת העגינה המולקולרית באמצעות קובץ config.txt כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S11B.
   2. בצע את חישוב העגינה (~30-90 דקות; קובץ משלים 1 - איור משלים S12).
   3. בדוק את קובץ docking_log.txt כדי לסקור את ציוני העגינה (זיקה מחייבת).
   4. בחר את תוצאת העגינה עם קונפורמציית האנרגיה הנמוכה ביותר.
6. ניתוח נתוני עגינה
   1. השתמש בתוכנת כלי העגינה האוטומטי כדי לפתוח את תוצאת העגינה PDBQT file.
   2. לנתח את אתרי הקישור של ליגנד-קולטן, תוך התמקדות במרכז הפעיל של הקולטן ובאינטראקציות בין-מולקולריות, כולל אינטראקציות יוניות, יוניות-קוטביות, קוטביות ומימן. הכינו טבלה עבור PI ופוספואינוזיטיד, המקיימים אינטראקציה עם האתר הפעיל של הקולטן, כדי לתאר זיקות אתר קשירה ב-kcal/mol, חלקים טעונים וקוטביים בראש קוטבי PI/phosphoinositide, ושאריות HDP-2P המעורבות בקשרים בין-מולקולריים, וסוגי קשרים כפי שמוצג בטבלה 1 ובטבלה 2. חזור על העגינה עבור כל זוג קולטנים-ליגנד פי 3 כדי לוודא שאין סטייה באתרי הקשירה, זיקות קשירה, חלקים טעונים וקוטביים של שאריות PI/פוספואינוזיטיד ו-HDP-2P, וסוג הקשרים.

2. פעילות הידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC מועשרים ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P₂ , PS או CL המנוטרים באמצעות הקו-אנזים A עם חומצות שומן חופשיות

הערה: כלורופורם, מתנול, NH₃ ו-CuSO₄ מסוכנים. השתמש תמיד בכפפות ניטריל, משקפי מגן ומעיל מעבדה. טפל בכל הפרוטוקולים עם ריאגנטים אלה מתחת למכסה האדים. אחסן כלורופורם בבקבוק זכוכית ענבר. אחסן מתנול בארונות דליקים הרחק ממחמצנים. הרחק מתנול מלהבות וניצוצות. סמן את כל מיכלי הפסולת עבור ריאגנטים אלה והשליך בהתאם לתקנות פינוי הפסולת המסוכנת המקומיות.

1. הכן 100 מ"ל של תמיסת חיץ עבור הידרוליזה פוספוליפידית מזורזת HDP-2P על ידי המסת 5.55 מ"ג של CaCl₂ במאגר Tris-HCl של 0.10 M (pH 7.4).
2. הכן 50 מ"ל של תמיסת מלאי EDTA של 1.0 M על ידי המסת 7.31 גרם EDTA במים מזוקקים דה-יונים (ddH₂0).
3. הכן תמיסת מלאי HDP-2P של 0.54 מ"מ במאגר Tris-HCl 0.10 M (pH 7.4). המסה המולרית של HDP-2P היא 13.827 kDa.
4. הכן את תמיסות המלאי הבאות של פוספוליפידים בריכוז 10.0 M בתערובת כלורופורם/מתנול (2 עד 1 בנפח): חלמון ביצה L-α-פוספטידילכולין (PC), קרדיוליפין לב בקר (CL), מוח בקר L-α-פוספטידיל-L-סרין (PS), PI, PI-4-P ו-PI-4,5-P₂. המסות הטוחנות של PC, CL, PS, PI, PI-4-P ו-PI-4,5-P₂ הן 768 Da, 1,466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da ו-1,057 Da, בהתאמה, כמתואר בהמשך.
5. הכן חמש דוגמאות של ליפוזומי PC. להכנת דגימה של ליפוזומי PC, הוסף 75 מיקרוליטר של תמיסת מלאי כלורופורם/מתנול של PC למבחנה מזכוכית וייבש את השומנים ב-25 מעלות צלזיוס מתחת ל-10 Pa ואקום למשך שעה אחת עד שנוצר סרט שומנים. לחות את סרט השומנים למשך שעה אחת עם 15 מ"ל של תמיסת חיץ להידרוליזה של פוספוליפידים ב-25 מעלות צלזיוס בתרמוסטט. לאחר מכן, הכנס את אקדח הטיטניום של מתקן קולי של 100-150 וואט לתוך מתלה השומנים במבחנה הזכוכית המונחת באמבט קרח וסוניקציה של המתלה בתדר 22 קילו-הרץ למשך 10 דקות, לא יעלה על 50% מההספק המרבי. להסרת חלקיקי 'אבק' טיטניום, צנטריפוגה ליפוזומים ב-200 × גרם (1,270 סל"ד עם רוטור 10 ס"מ) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הכן דגימות של ליפוזומי PC מועשרים ב-CL, PS, PI, PI-4-P או PI-4,5-P₂ ב-PC ויחס טוחנת שומנים אחר 4 ל-1 על ידי ערבוב תמיסות מלאי כלורופורם/מתנולפוספוליפידים -60 מיקרוליטר של PC עם 15 מיקרוליטר של CL, PS, PI, PI-4-P או PI-4,5-P_{2-בצינור} זכוכית. לאחר מכן, יבש את השומנים בוואקום של 10 Pa או למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר, הרטיב את סרט השומנים בתמיסת חיץ להידרוליזה של פוספוליפידים, וסוניקט עם גלים קוליים כמתואר לעיל.
   הערה: עבור כל סוג של ליפוזומים, הכינו חמש דגימות.
7. הנח 1.0 מ"ל מחמש דגימות מכל סוג של ליפוזומים שתוארו לעיל כדי להפריד צינורות והוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת קו-אנזים-A חסרת צבע מערכת NEFA לכל צינור ולאחר מכן הוסף 0.00, 0.93, 1.86, 2.79 או 3.72 מיקרוליטר של 0.54 מ"מ תמיסת מלאי HDP-2P כדי להפריד צינורות כדי להשיג בדגימות ליפוזום את היחס המולרי HDP-2P / פוספוליפיד של 0.000, 0.001, 0.002, 0.003 ו-0.004, בהתאמה.
8. מיד לאחר הוספת HDP-2P לליפוזומים, דגרו דגימות ליפוזום למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמוסטט ולאחר מכן, עצרו הידרוליזה של פוספוליפידים הנגרמת על ידי HDP-2P על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת EDTA מלאי. לאחר מכן, מערבל את הדגימות למשך דקה.
9. כמת את הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P על ידי מדידת הצפיפות האופטית של דגימות ליפוזומליות ב-550 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר, שימדוד את המידה שבה תמיסת קו-אנזים-A חסרת צבע הופכת לסגולה כאשר היא עוברת אצילציה עם חומצות שומן חופשיות.
10. חזור על ההליך לעיל פעמיים נוספות כך שערכי הצפיפות האופטית הממוצעים נגזרים משלושה ניסויים בלתי תלויים.
    הערה: כל נקודת נתונים המתקבלת בניסוי ניסיוני זה היא הערך הממוצע של הצפיפות האופטית. באופן אידיאלי, סטיית התקן של נקודות נתונים ניסיוניות צריכה להיות בטווח של ±5% מהממוצע.

3. השפעות של HDP-2P על חדירות של ממברנות ליפוזומליות PC המועשרות ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P₂ , PS או CL שנמדדו על ידי תגובת החלפת ליגנד בתמיסת CuSO₄ הכוללת ליגנד NH₃ הכלוא בתוך הליפוזומים

הערה: כלורופורם, מתנול, NH₃ ו-CuSO₄ מסוכנים. השתמש תמיד בכפפות ניטריל, משקפי מגן ומעיל מעבדה. טפל בכל הפרוטוקולים עם ריאגנטים אלה מתחת למכסה האדים. אחסן כלורופורם בבקבוק זכוכית ענבר. אחסן מתנול בארונות דליקים הרחק ממחמצנים. הרחק מתנול מלהבות או ניצוצות. סמן את כל מיכלי הפסולת עבור ריאגנטים אלה והשליך בהתאם לתקנות פינוי הפסולת המסוכנת המקומיות.

1. הכן 20 מ"ל של תמיסות מלאי של 0.03 M עבור כל אחד מששת הפוספוליפידים - PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P₂- בכלורופורם/מתנול (נפח 2 עד 1). המסות המולקולריות של PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P₂ הן 768, 1466, 792, 867, 962 ו-1057 Da, בהתאמה.
2. הכן 100 מ"ל של מאגר Tris-HCl (pH 7.4) של 0.10 M עם ריכוז סופי של 0.05 M CuSO₄.
3. הכן 4 מ"ל של מלאי 1.5 × ^10-3 M HDP-2P במאגר 0.05 M CuSO₄, 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4). המסה המולרית של HDP-2P היא 13.827 kDa.
4. להכנת 100 מ"ל של תמיסת NH₃ של 0.5 מ', השתמש בתמיסת NH₃ של 25% (צפיפות 905 גרם/ליטר³⁰, שווה ל-13.30 מ' [905 גרם/ליטר ×-0.25 מ' ÷-17.00 גרם/ליטר = 13.30 מ']). לפיכך, כדי להכין 100 מ"ל של 0.5 מ"ל NH₃, השתמש ב-3.76 מ"ל של תמיסה של 25% NH₃ : (0.5 מ×1,000 מ"ל ÷ 13.30 מ') ÷ 10 = 3.76 מ"ל של תמיסה של 25% NH₃ . הניחו 3.76 מ"ל של תמיסת NH₃ 25% בבקבוק נפחי של 100 מ"ל והביאו את הנפח ל-100 מ"ל עם מאגר של 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4).
5. להכנת ליפוזומים עם NH₃ בנפח הפנימי של הליפוזומים, יש להניח 12.5 מ"ל של תמיסת פוספוליפידים מלאי 0.03 M בכלורופורם/מתנול בשפופרת ולייבש פוספוליפידים בוואקום של 10 Pa או למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. לחות את סרט הפוספוליפיד למשך שעה אחת עם 12.5 מ"ל של 0.5 M NH₃, 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4) ב-25 מעלות צלזיוס בתרמוסטט; לאחר מכן סוניקציה של תרחיף השומנים בתדר 22 קילו-הרץ כמתואר בשלב 2.5 כדי לייצר ליפוזומים סוניקטיביים.
   הערה: בתמיסה עם ליפוזומים סוניקטיביים, NH₃ ממוקם בתוך ומחוץ לליפוזומים.
6. כדי לחסל NH₃ מחוץ לליפוזומים, יש לבצע דיאליזה של הליפוזומים באמצעות קרום דיאליזה (חתך מולקולרי 1.0 kDa) לטמפרטורת חדר של 5 כובעים כנגד 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4) באמצעות מערבל מגנטי.
   הערה: דיאליזה במשך 5 שעות הספיקה כדי להסיר לחלוטין את NH₃, שכן תוספת של 0.5 מ"ל של ליפוזומים שעברו דיאליזה ל-0.5 מ"ל של 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO₄ buffer הניבה את אותה צפיפות אופטית ב-600 ננומטר כמו זו של ליפוזומים שהוכנו ללא NH₃ ומעורבבים עם אותו מאגר.
7. לאחר דיאליזה, צנטריפוגה של הליפוזומים ב-200 × גרם למשך 90 דקות כמתואר בשלב 2.5 כדי לגלול את הליפוזומים. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הליפוזומים עם 5.0 מ"ל של 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO₄ (pH 7.4), וחלקו את הליפוזומים המרחפים לחמש דגימות של 1.0 מ"ל כל אחת. הוסף לחמש דגימות 1.0 מ"ל אלה בנפרד 60, 40, 20 ו-0 מיקרוליטר של 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO₄ (pH 7.4) ולאחר מכן 0, 20, 40, 60, 80 מיקרוליטר של מאגר מלאי HDP-2P כדי להתאים בדגימות הליפוזום את היחסים המולאריים HDP-2P/פוספוליפידים 0.000, 0.001, 0.002, 0.003 ו-0.004, בהתאמה.
8. לדגור את דגימות הליפוזום למשך 30 דקות בתרמוסטט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס; לאחר מכן, מדוד את הצפיפות האופטית של דגימות הליפוזום ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. בצע את השלבים המתוארים בסעיף 3 עבור כל שש דגימות הליפוזום וחזור על הפעולה פי 3 כדי להבטיח קריאות משולשות של צפיפות אופטית עבור כל נקודת נתונים.
   הערה: סטיית התקן של נקודות נתונים ניסיוניות צריכה להיות תמיד בטווח של ±5% מהממוצע.

סימולציה של מידול מולקולרי של אינטראקציה של HDP-2P עם PI ופוספואינוזיטידים
תוכנית המידול המולקולרי מחשבת את תשעת אתרי הקישור הטובים ביותר על פני השטח המולקולאריים של קולטן (מולקולה גדולה יותר), הממוקד על ידי ליגנד (מולקולה קטנה יותר). אתרים אלה נקבעים על ידי שחרור תשע האנטלפיות הגבוהות ביותר, המציינים את האתרים בעלי זיקות הקישור הטובות ביותר. זיקות הקישור באות לידי ביטוי כערכים שליליים, מה שמצביע על כך שהקישור הבין-מולקולרי הוא תהליך אקסותרמי. במקרה של אינטראקציה של HDP-2P עם PI, הסימולציה חזתה ארבעה אתרי קישור (#3, #6, #7 ו-#8) עבור PI על פני השטח המולקולרי של HDP-2P בתוך המרכז הפעיל (טבלה 1). בנוסף, חמשת אתרי הקישור ל-PI נמצאו מחוץ למרכז הפעיל של HDP-2P. הסימונים של החלקים הטעונים והקוטביים בראש הקוטב של PI מומחשים באיור 1.

המרכז הפעיל של HDP-2P מורכב מחמש שאריות חומצות אמינו מרכזיות: Gly30, Gly32, His48, Asp49 ו-Lys69, המאפשרים יישור נכון של מצע פוספוליפידים במרכז הפעיל כדי להבטיח הידרוליזה קטליטית. כמה מבנים מעוגנים מייצגים מראים את הקישור של PI לשאריות חומצות אמינו מסוימות של המרכז הפעיל, בעוד שבאתר קשירה #6, PI עוסק בכל חמשת שאריות חומצות האמינו העיקריות של המרכז הפעיל באמצעות קשרים יוניים, יונים-קוטביים ומימן (טבלה 1). איור 2 ממחיש כיצד PI מקיים אינטראקציה עם כל חמש שאריות חומצות האמינו העיקריות במרכז הפעיל של HDP-2P בתוך אתר הקישור #6.

סימולציית העגינה של האינטראקציה בין HDP-2P ל-PI-4-P, המכילה קבוצת פוספט במיקום 4 של טבעת האינוזיטול, ניבאה רק את אתר הקישור #1 כמיקום שבו PI-4-P נקשר למרכז הפעיל של HDP-2P. באופן ספציפי, באתר זה, PI-4-P מקיים אינטראקציה עם שלוש שאריות חומצות אמינו מרכזיות של המרכז הפעיל - Gly30, Gly32 ו- Lys69 - באמצעות קשרים יוניים, יונים קוטביים ומימן (טבלה 2). איור 3 ממחיש את האינטראקציה של PI-4-P עם המרכז הפעיל של HDP-2P. בשמונת אתרי הקישור הנותרים על פני השטח המולקולרי של HDP-2P, PI-4-P נקשר למקומות מחוץ למרכז הפעיל.

סימולציות העגינה המולקולרית של אינטראקציות HDP-2P עם PI-4,5-P₂ (המכילות קבוצות פוספט במיקומים 4 ו-5 של טבעת האינוזיטול) לא גילו שום קישור למרכז הפעיל של האנזים בכל תשעת אתרי הקישור החזוי. במקום זאת, PI-4,5-P₂ נקשר באופן עקבי לחלל דמוי חריץ הסמוך למרכז הפעיל (איור 4), ויוצר קשרי יונים קוטביים ומימן עם שלושת שאריות HDP-2P, Trp31, Gly33 ו-Gln34).

בעוד שהקשירה של PI-4,5-P₂ לחלל דמוי חריץ ליד המרכז הפעיל של PLA2s התא או הארס לא תועדה בעבר, מאפיינים אנלוגיים מבניים מבוססים היטב בתחומי הומולוגיה של pleckstrin31 (PH) ו-epsin N-terminal homology32 (ENTH). תחומי איתות אלה משתמשים בארכיטקטורות חריץ הידרופוביות-קוטביות-קטיוניות דומות לזיהוי PI-4,5-P2 ספציפי31,32, למרות אופיים הלא אנזימטי. נוכחותו של מוטיב מבני דומה ב-HDP-2P מעלה אפשרויות מסקרנות של חיקוי אבולוציוני או אבולוציה מתכנסת כדי להקל על זיהוי תחום הממברנה על ידי HDP-2P. אם יאומת עוד יותר בשיטות אחרות, מחקר זה עשוי לייצג את המקרה המדווח הראשון של ארס PLA2 המשתמש במנגנון כזה לזיהוי פוספואינוזיטיד.

מעניין לציין שסימולציות עגינה מולקולרית של CL ו-PS באינטראקציה עם HDP-2P חזו את הקישור של שני הפוספוליפידים למרכז הפעיל של HDP-2P בשמונה מתוך תשעה אתרי קשירה, בעוד שאתר הקישור היחיד של CL ו-PS מחוץ למרכז הפעיל לא היה ממוקם בחלל דמוי החריץ (הנתונים לא הוצגו). ראוי גם לציין שכמו PI, PC נקשר למרכז הפעיל של HDP-2P בארבעה מתוך תשעה אתרי קשירה, וגם PI וגם PC, כמו CL ו-PS, אינם נקשרים לחלל דמוי החריץ (הנתונים אינם מוצגים). ממצאים אלה מצביעים על כך שלקבוצות הפוספט בטבעת האינוזיטול של PI יש זיקה גבוהה לחלל דמוי החריץ הממוקם בסמוך למרכז הפעיל. ניתוחים מבניים זיהו חללים אנלוגיים דמויי חריץ עם כתמי משטח הידרופוביים-קוטביים-קטיוניים ליד המרכז הקטליטי הן באנזימי תא33 והן באנזימי ארס34 PLA2 . הקישור של פוספואינוזיטידים לחללים אלה עשוי לגרום לשינויים קונפורמטיביים משמעותיים מבחינה פיזיולוגית, מה שעלול לעכב פעילות אנזימטית. יש לציין כי בקרב פוספואינוזיטידים, PI-4,5-P2 מפגין מאפייני סובסטרט גרועים במיוחד - איזופורמים אנושיים של PLA2 (סוגים ציטוזוליים, בלתי תלויים בסידן ומופרשים) מראים פעילות הידרוליטית מינימלית עד בלתי ניתנת לזיהוי כלפי PI-4,5-P235. זה מצביע על כך שקשירת פוספואינוזיטיד לתכונות מבניות שמורות אלה עשויה לשרת פונקציה פיזיולוגית מובהקת (למשל, עיכוב אלוסטרי) ולא פונקציות קטליטיות על פני משפחת העל PLA2 , הדורשת אימות ניסיוני עתידי.

פעילות הידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC מועשרים ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS או CL המנוטרים באמצעות קו-אנזים A עם חומצות שומן חופשיות
הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P בדגימות ליפוזומליות הוערכה על ידי שימוש בתמיסת קו-אנזים A. תמיסת הקו-אנזים A היא חסרת צבע אך הופכת לסגולה עם אצילציה על ידי חומצות שומן חופשיות המשתחררות במהלך הידרוליזה של פוספוליפידים המזרזת על ידי HDP-2P. העלייה שנוצרה בצפיפות האופטית, המתאימה למידת האצילציה של קואנזים A, נמדדה באופן ספקטרופוטומטרי ב-550 ננומטר. לכן, העלייה בצפיפות האופטית בדגימות ליפוזומליות שטופלו בקו-אנזים A ו-HDP-2P עומדת ביחס ישר לפעילות ההידרוליטית של HDP-2P.

איור 5 מציג את עקומות הפעילות ההידרוליטית כפונקציה של היחס המולרי HDP-2P/פוספוליפיד בדגימות ליפוזומליות שונות. הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P מתבטאת ביחידות שרירותיות (a.u.) של צפיפות אופטית (OD) הנמדדת ב-550 ננומטר. לא בנינו עקומת כיול כדי לקשר את ערכי ה-a.u. לריכוזים המולאריים של חומצות שומן חופשיות, שכן הניסויים הניסיוניים שלנו הראו כי חומצות שומן בממיסים אורגניים, כאשר הן מתווספות לתמיסות מימיות המכילות קו-אנזים A ואציל-קואנזים A סינתטאז, לא יצרו שינוי OD שניתן לזהות ב-550 ננומטר. זה מצביע על כך שחומצות שומן כאלה יוצרות מיצלות במקום להיקשר לקו-אנזים A. לעומת זאת, רק חומצות שומן שנוצרו על ידי ממברנה (המיוצרות על ידי פעילות PLA2 ) נקשרות לקו-אנזים A הקשור לממברנה, וכתוצאה מכך שינוי OD מדיד. האופי האמפיפתי של קו-אנזים A - בעל אזורים הידרופוביים והידרופיליים על פני השטח המולקולריים שלו - ממקם אותו באופן מועדף בממשק הממברנה-מים, מה שמקל על קשירת חומצות שומן המיוצרות על ידי פעילות PLA2 לקו-אנזים A. עם זאת, בתנאי בדיקה אלה, קביעת הריכוז המולרי של חומצות שומן אינה אפשרית. מסיבה זו, חוקרים המשתמשים בבדיקת קואנזים A מבטאים את הפעילות ההידרוליטית של PLA2 ביחידות שרירותיות של OD הנמדדות ב-550 ננומטר20.

העלייה הגבוהה ביותר בצפיפות האופטית, המקבילה לפעילות ההידרוליטית הגדולה ביותר של HDP-2P, נצפתה בליפוזומי PC מועשרים ב-CL או PS. ממצא זה מתיישב היטב עם המספר הגבוה ביותר של אתרי קישור ל-CL ו-PS במרכז הפעיל של HDP-2P. הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC מועשרים ב-PI הייתה נמוכה פי 3.0 ו-2.5 מאשר בליפוזומים מועשרים ב-CL או PS, בהתאמה, אך גבוהה יותר מאשר בליפוזומים טהורים של PC. זה מצביע על כך שהזיקה למרכז הפעיל של HDP-2P של PI גבוהה מזו של PC, למרות שלשני השומנים יש אותו מספר של אתרי קישור במרכז הפעיל.

ניתן להסביר את הפער לכאורה הזה על ידי הבדלים מבניים בקבוצות הראש הקוטביות של PI ו-PC. בעוד ש-PC היא מולקולה ניטרלית, קבוצת הטרימתילאמוניום הקטיוני שלה משתרעת החוצה לתוך התמיסה, בעוד שקבוצת הפוספט האניונית שלה ממוקמת קרוב יותר לאזור ההידרופובי של הממברנה. התפלגות מטען זו בקבוצת ה-PC עשויה ליצור דחייה אלקטרוסטטית כנגד ה-HDP-2P הבסיסי, ולהפחית את זיקת הקישור שלו. לעומת זאת, האופי החומצי של PI הופך אותו לזן שומנים אטרקטיבי יותר לאינטראקציה עם HDP-2P הבסיסי, מה שיכול להסביר את הפעילות ההידרוליטית הגבוהה יותר שלו בהשוואה לליפוזומים טהורים של PC.

הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC המועשרים ב-PI-4-P, כפי שמוצג באיור 5, מצביעה על הידרוליזה קטליטית מינימלית של פוספוליפידים. למרבה הפלא, עקומת הצפיפות האופטית המתקבלת מליפוזומי PC המועשרים ב-PI-4,5-P מצביעה על ביטול מוחלט של הפעילות ההידרוליטית על ידי HDP-2P בדגימת ליפוזום זו. ממצאים אלה מתיישבים היטב עם סימולציות העגינה, המנבאות אתר קישור אחד ל-PI-4-P במרכז הפעיל של HDP-2P, בעוד ש-PI-4,5-P2 אינו מראה זיקה קשירה למרכז הפעיל כלל. זה מצביע על כך שקבוצות הפוספט הקשורות לטבעת האינוזיטול מעכבות את קשירת הפוספוליפיד למרכז הפעיל של HDP-2P. אנו מציעים שקבוצות הפוספט על טבעת האינוזיטול משתרעות החוצה לתוך התמיסה, ועל ידי קשירה ל-HDP-2P באמצעות אינטראקציות בין-מולקולריות יוניות ויונים-קוטביות, הן שומרות על HDP-2P במרחק מפני הממברנה, ובכך מגנות על הממברנה מפני הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P. זה עולה בקנה אחד עם הממצאים האחרונים שחשפו כי אנזימי PLA2 ציטוזוליים, בלתי תלויים בסידן ומופרשים הראו פעילות הידרוליטית בקושי ניתנת לזיהוי או ללא פעילות הידרוליטית כלפי מצעי PI-4-P ו-PI-4,5-P2 35.

שינויי חדירות המושרים על ידי HDP-2P בממברנות ליפוזומליות PC מועשרות ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS או CL: הערכה באמצעות תגובת החלפת ליגנד בתמיסת CuSO4 עם NH₃ עטוף

ההשפעה של פעילות הידרוליטית HDP-2P על חדירות הממברנה של ליפוזומי PC המועשרים ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS או CL נחקרה באמצעות תגובת החלפת ליגנד במערכת יונים מורכבת, שבה הליגנד המחליף היה עטוף בנפח הפנימי של הליפוזומים. שיטה פשוטה ואמינה זו מבוססת על תזוזה של ארבע מולקולות מים הפועלות כליגנדים ביון המורכב [Cu(H2O)6]2+ על ידי NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

במהלך התהליך של החלפת מולקולות מים ב-NH3 ביון הקומפלקס [Cu(H2O)6]2+, הצבע הכחול החיוור של [Cu(H2O)6]2+ עובר לצבע הכחול הכהה של [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. במערכת שבה NH3 עטוף בנפח הפנימי של הליפוזומים ו-[Cu(H2O)6]2+ קיים בתמיסה החיצונית, שינוי צבע זה - המנוטר באופן ספקטרופוטומטרי - מצביע על עלייה בחדירות הממברנה הליפוזומלית ל-NH3.

כדי להקים מערכת כזו, ביצענו פיזור פוספוליפידים במאגר Tris-HCl המכיל NH3, ויצרנו ליפוזומים סוניקטיביים עם NH₃ בתוך ומחוץ לליפוזומים. NH3 חיצוני הוסר על ידי דיאליזה, ולאחר מכן נוספה תמיסת CuSO4 לדגימת הליפוזום המכילה NH3 בנפח הפנימי שלה. לאחר מכן טיפלנו בליפוזומים ב-HDP-2P ועקבנו אחר שינויים בצפיפות האופטית באופן ספקטרופוטומטרי.

כדי לקבוע את אורך הגל האופטימלי למדידת שינויי צפיפות אופטית, רשמנו את ספקטרום הספיגה של [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ בתמיסת CuSO4 של 0.025 M, 0.100 M NH3 ו-[Cu(H2O)6]2+ בתמיסת CuSO4 של 0.025 M, תוך שימוש באור נראה בטווח של 500 ננומטר עד 900 ננומטר. כפי שמוצג באיור 6, הקרנה ב-600 ננומטר הניבה ספיגה מקסימלית עבור [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ וספיגה מינימלית עבור [Cu(H2O)6]2+, מה שהוביל אותנו לבחור 600 ננומטר כאורך הגל האופטימלי עבור ניסויי חדירות הממברנה שלנו.

איור 7 מראה כי חדירות הממברנה ל-NH₃ היא הגבוהה ביותר בליפוזומי PC המועשרים ב-CL ו-PS אניוניים. תצפית זו עולה בקנה אחד עם הנתונים שדווחו בעבר המראים כי HDP-2P, קבוצה IIA PLA2, מקיים אינטראקציה יעילה עם הפוספוליפיד האניוני פלמיטואילולויל-גליצרופוספוגליצרול, מה שמוביל להידרוליזה של סובסטרט - השפעה שלא נצפתה עם הפוספוליפיד הנייטרלי פלמיטואילולוילגליצרופוספוכולין36. באופן כללי, רוב האנזימים מקבוצה IIA PLA2 מציגים פעילות הידרוליטית גבוהה משמעותית כלפי פוספוליפידים אניונים 33,37,38. החדירות של ליפוזומי PC+PI נמוכה מזו של ליפוזומי PC+CL ו-PC+PS אך נשארת גבוהה מזו של ליפוזומי PC טהורים. ממצאים אלה מתיישבים היטב עם התוצאות של סימולציות עגינה ומבחני פעילות הידרוליטית HDP-2P. במילים אחרות, דגימות ליפוסומליות המציגות חדירות נמוכה צפויות להיות יציבות מבנית בשל חוסר היכולת של HDP-2P להידרוליפידים ובשל זיקה נמוכה יותר של HDP-2 להיקשר ל-PI ופוספואינוזיטידים, כפי שנחזה על ידי נתוני העגינה המולקולרית (איור 2, איור 3 ואיור 4). לכן, פעילות הידרוליטית של אנזים על ידי HDP-2P (איור 5) וחדירות הממברנה, כפי שמוצג באיור 7, צריכות להיות בקורלציה חיובית.

עם זאת, בליפוזומים PC+PI-4-P ו-PC+PI-4,5-P2 , החדירות לא עלתה עם טיפול ב-HDP-2P. בעוד שתוצאות החדירות של ליפוזומי PC+PI-4,5-P2 מתואמות היטב עם סימולציות עגינה ונתוני פעילות הידרוליטית HDP-2P עבור אותם ליפוזומים, היעדר חדירות מוגברת בליפוזומים PC+PI-4-P אינו מתיישב לחלוטין עם תוצאות הפעילות ההידרוליטית, שכן נרשמה מידה קטנה של פעילות הידרוליטית בליפוזומים אלה. ממצאים אלה מצביעים על כך שעלייה מקומית קלה בפעילות ההידרוליטית בליפוזומים PC+PI-4-P אינה מפריעה לאריזה דו-שכבתית של פוספוליפידים במידה שתשנה את חדירות הממברנה ל-NH3.

איור 1: סימונים של חלקים טעונים וקוטביים של הראש הקוטבי של פוספטידילינוזיטול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אינטראקציה של PI עם המרכז הפעיל של HDP-2P הצפוי עבור אתר קשירה #6 על ידי תוכנת עגינה מולקולרית. PI ניתן בייצוג מקל ו-HDP-2P ניתן בייצוג קו (תרשים משמאל) ומשטח מולקולרי (דיאגרמה מימין). עבור ייצוגי המקל, אמרלד מייצג פחמן, כתום הוא זרחן, אדום הוא חמצן ולבן הוא מימן. עבור פני השטח והקווים המולקולריים, ירוק מייצג פחמן, כחול הוא חנקן, אדום הוא חמצן, לבן הוא מימן וצהוב הוא גופרית. קווים שבורים צהובים מזהים קשרים בין-מולקולריים. חיצים מצביעים על שאריות חומצות אמינו במרכז הפעיל. קיצורים: PI = פוספטידילינוזיטול; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אינטראקציה של PI-4-P עם המרכז הפעיל של HDP-2P הצפוי עבור אתר קשירה #1 על ידי תוכנת עגינה מולקולרית. PI-4-P ניתן בייצוג מקל ו-HDP-2P ניתן בייצוגי קווים (תרשים משמאל) ומשטח מולקולרי (תרשים מימין). עבור המקלות, אמרלד מייצג פחמן, כתום הוא זרחן, אדום הוא חמצן ולבן הוא מימן. עבור פני השטח והקווים המולקולריים, ירוק מייצג פחמן, כחול הוא חנקן, אדום הוא חמצן, לבן הוא מימן וצהוב הוא גופרית. קווים שבורים צהובים מזהים קשרים בין-מולקולריים. חיצים מצביעים על שאריות חומצות אמינו במרכז הפעיל. קיצורים: PI-4-P = פוספטידילינוזיטול-4-פוספט; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אינטראקציה של PI-4,5-P2 עם המשטח המולקולרי של HDP-2P הצפוי עבור אתר קשירה #6 על ידי תוכנת עגינה מולקולרית. PI-4,5-P2 נקשר למערה דמוית חריץ הממוקמת מתחת למרכז הפעיל של HDP-2P. חמש שאריות חומצות האמינו העיקריות במרכז הפעיל ניתנות בסימון בן שלוש האותיות. PI-4,5-P2 ניתן בייצוג מקל ו-HDP-2P ניתן בייצוג קו (תרשים משמאל) ומשטח מולקולרי (תרשים מימין). עבור המקלות, אמרלד מייצג פחמן, כתום הוא זרחן, אדום הוא חמצן ולבן הוא מימן. עבור פני השטח והקווים המולקולריים, ירוק מייצג פחמן, כחול הוא חנקן, אדום הוא חמצן, לבן הוא מימן וצהוב הוא גופרית. קיצורים: PI-4,5-P2 = פוספטידילינוזיטול-4,5-דיפוספט; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: עקומות פעילות הידרוליטית מדגימות של ליפוזומים ביחסים טוחנים שונים של HDP-2P/פוספוליפידים. ליפוזומים עשויים PC+CL (ירוק כהה), PC+PS (כתום), PC+PI (כחול כהה), PC+PI-4-P (כחול), PC+PI-4,5-P2 (ירוק) ו-PC (סגול). ערכי הצפיפות האופטית ביחידות שרירותיות מייצגים את האמצעים של קריאות משולשות ב-550 ננומטר. קווי שגיאה מציינים את ה-SD של הקריאות המשולשות. המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בערכי הצפיפות האופטית בין דגימות הליפוזום הוערכה באמצעות ANOVA, כאשר כל ערכי ה-p נמצאו הרבה מתחת ל-0.05. קיצורים: PC = פוספטידילכולין; CL = קרדיוליפין לב בקר ; PS = פוספטידילסרין; PI = פוספטידילינוזיטול; PI-4-P = פוספטידילינוזיטול-4-פוספט; PI-4,5-P2 = פוספטידילינוזיטול-4,5-דיפוספט; a.u. = יחידות שרירותיות; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ספקטרום ספיגה של תמיסות מימיות של קומפלקסים נחושת. קומפלקסים של נחושת [Cu(H2O)6]2+ (קו כתום) ו-[Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (קו כחול), המוקרנים על ידי אור נראה בטווח שבין 500 ננומטר ל-900 ננומטר. קומפלקס נחושת [Cu(H2O)6]2+ נוצר בתמיסה של 0.025 M CuSO4 וקומפלקס נחושת [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ נוצר בתמיסה של 0.025 M CuSO4 המכילה 0.100 M NH3. ערכי הספיגה באיור זה עבור כל נקודת נתונים הם האמצעים לקריאות הספיגה שנעשו בשלוש עותקים. קווי שגיאה מייצגים את ה-SD מהקריאות המשולשות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: עקומות חדירות הממברנה מדגימות של ליפוזומים. ליפוזומים עשויים PC+CL (סגול), PC+PS (כחול), PC+PI (כחול כהה), PC+PI-4-P (ירוק כהה), PC+PI-4,5-P2 (כתום) ו-PC (ירוק) ביחסים טוחנים שונים של HDP-2P/פוספוליפידים. ערכי חדירות הממברנה מבוטאים כערכי צפיפות אופטית ביחידות שרירותיות (a.u.) הנמדדות ב-600 ננומטר. כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של קריאות משולשות. קווי שגיאה מציינים את ה-SD של הקריאות המשולשות. המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בערכי הצפיפות האופטית בין דגימות הליפוזום הוערכה באמצעות ANOVA, כאשר כל ערכי ה-p נמצאו הרבה מתחת ל-0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: אנרגיות קשירת זיקה חזויות עבור קומפלקסים מולקולריים מועמדים של HDP-2P עם PI. סימולציות מודלים מולקולריים שימשו לחיזוי סוגי הקשרים וזיקות אתר הקשירה, כמו גם את החלקים הטעונים והקוטביים של קבוצת הראש של פוספטידילינוזיטול ושאריות חומצות האמינו HDP2P המשתתפות באינטראקציות הבין-מולקולריות שלהם. הקבוצות הטעונות והקוטביות של פוספטידילינוזיטול מודגשות באיור 1. שימו לב ש-Pb ב-NHpbδ+ מציין קשר פפטידי. קיצורים: PI = פוספטידילינוזיטול; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: אנרגיות קשירת זיקה חזויות עבור קומפלקסים מולקולריים מועמדים של HDP-2P עם PI-4-P. סימולציות מודלים מולקולריים שימשו כדי לחזות את סוגי הקשרים וזיקות אתר הקשירה, כמו גם את החלקים הטעונים והקוטביים הן של קבוצת הראש פוספטידיל-אינוזיטול-4-פוספט (PI-4-P) והן של שאריות חומצות האמינו HDP2P המשתתפות באינטראקציות הבין-מולקולריות שלהם. שימו לב ש-Pb ב-NHpbδ+ מציין קשר פפטידי. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

קובץ משלים 1: זרימת עבודה של עגינה מולקולרית. סקירה כללית של הליך העגינה המולקולרית באמצעות AutoDock, כולל בניית ליגנד, הכנת קולטנים, הגדרת תיבת רשת וביצוע סימולציות עגינה לחיזוי אינטראקציות PI-HDP-2P. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.