מאמר שיטה

בדיקת חדירות קרום ליפוזום לחקירת ההשפעות של קבוצות פוספטידילינוזיטול פוספט על הפעולה הממברנוטרופית של ארס PLA2

827 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68594

⸱

26 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שיטה חסכונית להערכת חדירות הממברנה הליפוזומלית עם רגישות ורזולוציה עדיפות על פני טכניקות קונבנציונליות. באמצעות תגובת החלפת ליגנד מכוסה חדשה, טכניקה זו מזהה שינויים המושרים על ידי פוספוליפאזA 2 בממברנות המודל. גישה נגישה זו, המשולבת בקלות עם ניתוחים סטנדרטיים, משפרת את הרזולוציה לחקר ביופיזיקה של ממברנות ואינטראקציות רעלים.

תקציר

פיתחנו בדיקה חדשנית, חסכונית ורגישה ביותר להערכת חדירות הממברנה הליפוזומלית המבוססת על תגובות החלפת ליגנד הכוללות ליגנדים עטופים בנפח הפנימי של ליפוזומים, ששילבנו עם בדיקת פעילות הידרוליטית (באמצעות אצילציה של קו-אנזים A) וסימולציה של מודלים מולקולאריים כדי לחקור אם פוספטים של טבעת האינוזיטול בפוספטידילינוזיטול מגנים על הממברנות מפני ההשפעות המזיקות של אנזימים המתבטאים באופן חריג. ביטוי חריג של פוספוליפאזות A2 (PLA2) מוביל לדמיאלינציה של אקסונים המעוררת התפתחות של טרשת נפוצה ומחלת אלצהיימר. כדי לחקות את ההשפעות של PLA₂ המתבטא באופן חריג, השתמשנו בתת-היחידה הבסיסית של ארס הצפע PLA₂, HDP-2P. ה-HDP-2P נבדק על ליפוזומים של פוספטידילכולין (PC) המועשרים בפוספטידילינוזיטול, פוספטידילינוזיטול-4-פוספט (PI-4-P), או פוספטידילינוזיטול-4,5-דיפוספט (PI-4,5-P2). בעוד ש-HDP-2P הראה פעילות הידרוליטית מינימלית וחדירות מוגברת רק במעט בליפוזומי PC, העשרה של ליפוזומי PC עם PI שיפרה הן את ההידרוליזה והן את החדירות. באופן מדהים, PI-4-P ו-PI-4,5-P₂ עיכבו באופן דרמטי את הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P והפחיתו לחלוטין את החדירות שלו. סימולציות מודלים מולקולריים גילו כי פוספטים של טבעת האינוזיטול בפוספטידילינוזיטול חוסמים באופן סטרילי את גישת הפוספוליפידים לאתר הפעיל של HDP-2P, ומונעים הידרוליזה. נתונים הן במבחנה והן בסיליקו מצביעים על כך שפוספטידילינוזיטולים זרחניים קשורים לפעילות מופחתת של PLA₂, מה שמצביע על מנגנון פוטנציאלי להפחתת פעילות מוגזמת של PLA2 - ככל הנראה כאמצעי להגנה על קרומי התאים מפני ניוון.

מבוא

פוספטידילינוזיטול (PI) הוא פוספוליפיד אניוני המורכב מעמוד שדרה של חומצה פוספטית המקושר לאינוזיטול, טבעת הקסהידרוקסית בעלת שישה פחמנים, באמצעות קבוצת פוספט. ניתן להמיר אינוזיטול באופן הפיך לפוספואינוזיטידים על ידי זרחון במיקומי פחמן2, 3, 4, 5 ו-6 1. PI ופוספואינוזיטידים נמצאים בממברנות פלזמה ובאברונים של תאים שונים על פני בעלי חיים, צמחים ומיקרואורגניזמים. שבעים שנה לאחר גילויים על ידי Mable ו-Lowell Hokin 2,3,4, PI ופוספואינוזיטידים נותרו נושא למחקר מקיף שמטרתו להבין את המנגנונים המולקולריים שלהם ואת הרלוונטיות שלהם לבריאות האדם 5,6,7.

מלבד רקמת המוח, פוספואינוזיטידים נמצאים בדרך כלל בריכוזים נמוכים, המהווים כ-0.5 עד 1% מסך השומנים בעלון הפנימי של קרום הפלזמה. הנתונים שפורסמו מצביעים על כך שסביר להניח ש-PI לא ימלא תפקיד מבני מרכזי בתנאים פיזיולוגיים1. עם זאת, במצבי מחלה, רמות ה-PI והפוספואינוזיטידים עולות, והם מתהפכים לעלון החיצוני של קרום הפלזמה, מה שמצביע על כך שפוספוליפידים אלה עשויים להיות קשורים לעמידות למחלות1. למרות שבמשך זמן רב חשבו ש-PI ממלא תפקיד פיזיולוגי פחות משמעותי בהשוואה לפוספואינוזיטידים, ראיות מתפתחות מדגישות את החשיבות של PI-4-P ו-PI-4,5-P2 בתהליכים פיזיולוגיים שונים1. תהליכים אלה כוללים איתות תוך-תאי, העברת אותות בין-תאיים 8,9,10, סחר בממברנה 11,12,13, אפנון ביטוי גנים1, כמו גם התפשטות תאים14 והישרדות1. למרות זאת, המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם PI ופוספואינוזיטידים מניעים תהליכים אלה נותרו לא מובנים היטב.

PI ופוספואינוזיטידים נמצאים בשפע בתאי רקמת המוח, שם הם מהווים כ-10% מכלל הפוספוליפידים, אם כי רמותיהם עשויות לעלות באופן זמני בשלבים המוקדמים של מחלות מוח, מה שמרמז על כך שפוספואינוזיטידים עשויים לנטרל את התפתחותן של פתולוגיות נוירולוגיות1 כגון טרשת נפוצה ומחלת אלצהיימר המופעלת על ידי דה-מיאלינציה אקסונלית הנגרמת על ידי פעילות חריגה של PLA2s 15, 16,17. אנזימים אלה שייכים למחלקות ולקבוצות השונות כולל פוספוליפאז מפריש מקבוצה IIA A2 (sPLA2)15. רמות גבוהות של קבוצת אנזימים זו נמצאות בנוזל המוח של חולים עם טרשת נפוצה ואלצהיימר, שם הם תורמים לפירוק ממברנות המיאלין, מה שמוביל לדמיאלינציה15. כמו כן, דווח כי sPLA2sמארס נחשים מעכב העברה בסינפסות עצביות-שריריות18,19, גורם להפרעות במערכת העצבים המרכזית ומשפיע לרעה על המערכת העצבית-שרירית ההיקפית20.

במחקר זה, חקרנו האם PI ופוספואינוזיטידים יכולים להגן על ממברנות פוספוליפידים מודל מפני ההשפעות של אנזימי sPLA2 המתבטאים באופן חריג. ממברנות המודל היו עשויות מפוספטידילכולין (PC), הפוספוליפיד הנפוץ ביותר בכל ממברנות תאי היונקים21, מועשר ביחס מולארי של 20% של PI, PI-4-P או PI-4,5-P2. כדי לחקות את ההשפעות של אנזימי sPLA2 המתבטאים באופן חריג על ממברנות המודל, השתמשנו בתת-היחידה הבסיסית HDP-2P של אנזים PLA2 מפריש ארס צפעמקבוצה IIA, שפעילותו ההידרוליטית נחקרה בעבר על ממברנות מיאלין מודל23.

לצורך עבודה זו, פיתחנו גישה חדשה לחקירת שינויים בחדירות של ממברנות ליפוזומליות המושפעות מ-HDP-2P. השיטה החדשנית מבוססת על תגובת החלפת ליגנד בתמיסת CuSO4 מחוץ לליפוזומים, הכוללת ליגנד NH3 הכלוא בתוך הליפוזומים. אם חדירות הממברנה המושרה על ידי HDP-2P מאפשרת דליפת NH3 מליפוזומים, האמוניה המשתחררת תחליף כמותית ארבע מולקולות מים ביוני נחושת מיובשות באמצעות התגובה: [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l). חילופי ליגנד אלה מייצרים עלייה אופיינית בצפיפות האופטית של התמיסה הניתנת למדידה על ידי ספקטרופוטומטריה (λ = 600 ננומטר), המשמשת כקריאה הכמותית שלנו לשינויים בחדירות הממברנה. הגישה שלנו המבוססת על החלפת ליגנד מדגימה רגישות מעולה להערכת חדירות הממברנה בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות כמו 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 ומבחני הובלת יונים29, תוך שהיא מציעה את היתרון הנוסף של אי דרישת מכשור יקר. שיטה פשוטה וחסכונית זו, המיושמת בשילוב עם מדידות פעילות הידרוליטית HDP-2P וסימולציה בסיליקו של קשירת PI, PI-4-P ו-PI-4,5-P2 למשטח המולקולרי של HDP-2P, אפשרה לנו להסיק כי הפוספטים של טבעת האינוזיטול ב-PI מבטלים את ההשפעות המשבשות של HDP-2P על ממברנות PC המועשרות ב-PI-4-P או PI-4, 5-עמ'2. אם ממצא זה יאושר במחקרים נוספים, היכולת של פוספטים טבעתיים אינוזיטול ב-PI להגן מפני ההשפעות המזיקות של חלבונים תאיים הפועלים באופן חריג, מה שעלול לתרום ליציבות הממברנה במצבי מחלה הכוללים פעילות חלבון חריגה, עשויה לסלול את הדרך לפיתוח תרופות חדשות לטיפול בהפרעות נוירולוגיות כגון מחלת אלצהיימר וטרשת נפוצה.

פרוטוקול

1. סימולציה בסיליקו של אינטראקציה HDP-2P עם PI ופוספואינוזיטידים באמצעות תוכנת מידול מולקולרי

  1. התקנה והכנה של תוכנה
    1. התקן את עורך השרטוט הכימי המוזכר לבניית מולקולות ליגנד כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S1A.
    2. התקן את תוכנת המידול המולקולרי לעגינה מולקולרית של ליגנד לקולטן.
    3. התקן את כלי העגינה האוטומטיים להכנת ליגנד וקולטנים.
    4. מכיוון שתוכנת הדמיית המידול המולקולרי תלויה בסביבת Python, התקן את Python.
  2. הכנת ליגנד
    1. ראשית, השתמש בעורך השרטוט הכימי כדי לבנות את הקואורדינטות האטומיות עבור מבנים מולקולריים של PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, קרדיוליפין ופוספטידילסרין.
      הערה: הפרוטוקול לדוגמה בשלבים הבאים של הכנת הליגנד מתאר את השלבים עבור PI בלבד.
    2. בנה את המבנה המולקולרי של PI באמצעות עורך השרטוט הכימי כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S1B ושמור את הקובץ בפורמט PDB כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S2.
    3. פתח את ה-PDB file בתוכנת כלי העגינה האוטומטי כפי שמוצג ב-Supplemental File 1-Supplemental Figure S3A.
    4. הוסף אטומי מימן כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S3B ובחר אטומי מימן קוטביים או את כל אטומי המימן כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S4A.
      הערה: לאחר השלמת עגינת PI עם HDP-2P, בחר רק אטומי מימן קוטביים כדי לפשט את ההדמיה של קשרי קוטב או מימן.
    5. הגדר את מולקולת ה-PI כליגנד עבור תוכנת כלי העגינה האוטומטי כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S4B.
    6. שמור את הליגנד כקובץ PDBQT כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S5A. הקפד להפוך את כל אגרות החוב לניתנות לסיבוב.
  3. הכנת קולטנים
    1. הורד את קובץ ה-PDB של פוספוליפאז A2 HDP-2 (קוד PDB 2I0U), המורכב משני מונומרים, האחד חומצי, לא פעיל אנזימטית, A, והשני בסיסי, פעיל אנזימטית, E. כדי למחוק מונומר לא פעיל אנזימטית A, ייבא את קובץ 2I0U לתוכנת המידול המולקולרי (קובץ משלים 1 - איור משלים S5B), בחר את כל האטומים של מונומר A (קובץ משלים 1 - איור משלים S6A), ולאחר מכן עבור אל ערוך ומחק את כל האטומים של מונומר A (קובץ משלים 1 - איור משלים S6B). שמור על מונומר E פעיל אנזימטית, המוגדר כעת כקולטן.
    2. פתח את קולטן HDP-2P PDB file בתוכנת כלי העגינה האוטומטי כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S7.
    3. הסר את כל מולקולות המים כפי שמוצג בקובץ משלים 1 - איור משלים S8A.
    4. הוסף אטומי מימן כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S8B. שימו לב שלאחר השלמת עגינת HDP-2P עם PI, יש לבחור רק מימנים קוטביים כדי לפשט את ההדמיה של קשרים קוטביים ומימן.
    5. הגדר את ה-HDP-2P כקולטן, כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S9A, ושמור אותו כקובץ PDBQT. ודא שהקולטן מוגדר ללא קשרים הניתנים לסיבוב.
  4. הגדרת פרמטר עגינה
    1. פתח גם את הליגנד וגם את קבצי ה-PDBQT של הקולטן.
    2. היכנס לממשק הגדרת תיבת הרשת, כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S9B, והגדר את גודל תיבת הרשת (גודל x = 44.644; גודל y = 74.939; גודל z = 43.050) ואת המרכז (מרכז x = 25.626; מרכז y = 9.582; מרכז z = 41.825), הסוגרים באופן מלא את כל פני השטח של מולקולת הקולטן כפי שמוצג בקובץ משלים 1 - איור משלים S10A.
    3. סגור את ממשק ההתקנה של תיבת הרשת עם ההגדרות הנוכחיות כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S10B ושמור את פרמטרי העגינה בקובץ config.txt כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S11A.
  5. הפעלת תוכנת העגינה המולקולרית
    1. הפעל את תוכנת העגינה המולקולרית באמצעות קובץ config.txt כפי שמוצג בקובץ משלים 1-איור משלים S11B.
    2. בצע את חישוב העגינה (~30-90 דקות; קובץ משלים 1 - איור משלים S12).
    3. בדוק את קובץ docking_log.txt כדי לסקור את ציוני העגינה (זיקה מחייבת).
    4. בחר את תוצאת העגינה עם קונפורמציית האנרגיה הנמוכה ביותר.
  6. ניתוח נתוני עגינה
    1. השתמש בתוכנת כלי העגינה האוטומטי כדי לפתוח את תוצאת העגינה PDBQT file.
    2. לנתח את אתרי הקישור של ליגנד-קולטן, תוך התמקדות במרכז הפעיל של הקולטן ובאינטראקציות בין-מולקולריות, כולל אינטראקציות יוניות, יוניות-קוטביות, קוטביות ומימן. הכינו טבלה עבור PI ופוספואינוזיטיד, המקיימים אינטראקציה עם האתר הפעיל של הקולטן, כדי לתאר זיקות אתר קשירה ב-kcal/mol, חלקים טעונים וקוטביים בראש קוטבי PI/phosphoinositide, ושאריות HDP-2P המעורבות בקשרים בין-מולקולריים, וסוגי קשרים כפי שמוצג בטבלה 1 ובטבלה 2. חזור על העגינה עבור כל זוג קולטנים-ליגנד פי 3 כדי לוודא שאין סטייה באתרי הקשירה, זיקות קשירה, חלקים טעונים וקוטביים של שאריות PI/פוספואינוזיטיד ו-HDP-2P, וסוג הקשרים.

2. פעילות הידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC מועשרים ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS או CL המנוטרים באמצעות הקו-אנזים A עם חומצות שומן חופשיות

הערה: כלורופורם, מתנול, NH3 ו-CuSO4 מסוכנים. השתמש תמיד בכפפות ניטריל, משקפי מגן ומעיל מעבדה. טפל בכל הפרוטוקולים עם ריאגנטים אלה מתחת למכסה האדים. אחסן כלורופורם בבקבוק זכוכית ענבר. אחסן מתנול בארונות דליקים הרחק ממחמצנים. הרחק מתנול מלהבות וניצוצות. סמן את כל מיכלי הפסולת עבור ריאגנטים אלה והשליך בהתאם לתקנות פינוי הפסולת המסוכנת המקומיות.

  1. הכן 100 מ"ל של תמיסת חיץ עבור הידרוליזה פוספוליפידית מזורזת HDP-2P על ידי המסת 5.55 מ"ג של CaCl2 במאגר Tris-HCl של 0.10 M (pH 7.4).
  2. הכן 50 מ"ל של תמיסת מלאי EDTA של 1.0 M על ידי המסת 7.31 גרם EDTA במים מזוקקים דה-יונים (ddH20).
  3. הכן תמיסת מלאי HDP-2P של 0.54 מ"מ במאגר Tris-HCl 0.10 M (pH 7.4). המסה המולרית של HDP-2P היא 13.827 kDa.
  4. הכן את תמיסות המלאי הבאות של פוספוליפידים בריכוז 10.0 M בתערובת כלורופורם/מתנול (2 עד 1 בנפח): חלמון ביצה L-α-פוספטידילכולין (PC), קרדיוליפין לב בקר (CL), מוח בקר L-α-פוספטידיל-L-סרין (PS), PI, PI-4-P ו-PI-4,5-P2. המסות הטוחנות של PC, CL, PS, PI, PI-4-P ו-PI-4,5-P2 הן 768 Da, 1,466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da ו-1,057 Da, בהתאמה, כמתואר בהמשך.
  5. הכן חמש דוגמאות של ליפוזומי PC. להכנת דגימה של ליפוזומי PC, הוסף 75 מיקרוליטר של תמיסת מלאי כלורופורם/מתנול של PC למבחנה מזכוכית וייבש את השומנים ב-25 מעלות צלזיוס מתחת ל-10 Pa ואקום למשך שעה אחת עד שנוצר סרט שומנים. לחות את סרט השומנים למשך שעה אחת עם 15 מ"ל של תמיסת חיץ להידרוליזה של פוספוליפידים ב-25 מעלות צלזיוס בתרמוסטט. לאחר מכן, הכנס את אקדח הטיטניום של מתקן קולי של 100-150 וואט לתוך מתלה השומנים במבחנה הזכוכית המונחת באמבט קרח וסוניקציה של המתלה בתדר 22 קילו-הרץ למשך 10 דקות, לא יעלה על 50% מההספק המרבי. להסרת חלקיקי 'אבק' טיטניום, צנטריפוגה ליפוזומים ב-200 × גרם (1,270 סל"ד עם רוטור 10 ס"מ) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הכן דגימות של ליפוזומי PC מועשרים ב-CL, PS, PI, PI-4-P או PI-4,5-P2 ב-PC ויחס טוחנת שומנים אחר 4 ל-1 על ידי ערבוב תמיסות מלאי כלורופורם/מתנולפוספוליפידים -60 מיקרוליטר של PC עם 15 מיקרוליטר של CL, PS, PI, PI-4-P או PI-4,5-P2-בצינור זכוכית. לאחר מכן, יבש את השומנים בוואקום של 10 Pa או למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר, הרטיב את סרט השומנים בתמיסת חיץ להידרוליזה של פוספוליפידים, וסוניקט עם גלים קוליים כמתואר לעיל.
    הערה: עבור כל סוג של ליפוזומים, הכינו חמש דגימות.
  7. הנח 1.0 מ"ל מחמש דגימות מכל סוג של ליפוזומים שתוארו לעיל כדי להפריד צינורות והוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת קו-אנזים-A חסרת צבע מערכת NEFA לכל צינור ולאחר מכן הוסף 0.00, 0.93, 1.86, 2.79 או 3.72 מיקרוליטר של 0.54 מ"מ תמיסת מלאי HDP-2P כדי להפריד צינורות כדי להשיג בדגימות ליפוזום את היחס המולרי HDP-2P / פוספוליפיד של 0.000, 0.001, 0.002, 0.003 ו-0.004, בהתאמה.
  8. מיד לאחר הוספת HDP-2P לליפוזומים, דגרו דגימות ליפוזום למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמוסטט ולאחר מכן, עצרו הידרוליזה של פוספוליפידים הנגרמת על ידי HDP-2P על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת EDTA מלאי. לאחר מכן, מערבל את הדגימות למשך דקה.
  9. כמת את הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P על ידי מדידת הצפיפות האופטית של דגימות ליפוזומליות ב-550 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר, שימדוד את המידה שבה תמיסת קו-אנזים-A חסרת צבע הופכת לסגולה כאשר היא עוברת אצילציה עם חומצות שומן חופשיות.
  10. חזור על ההליך לעיל פעמיים נוספות כך שערכי הצפיפות האופטית הממוצעים נגזרים משלושה ניסויים בלתי תלויים.
    הערה: כל נקודת נתונים המתקבלת בניסוי ניסיוני זה היא הערך הממוצע של הצפיפות האופטית. באופן אידיאלי, סטיית התקן של נקודות נתונים ניסיוניות צריכה להיות בטווח של ±5% מהממוצע.

3. השפעות של HDP-2P על חדירות של ממברנות ליפוזומליות PC המועשרות ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS או CL שנמדדו על ידי תגובת החלפת ליגנד בתמיסת CuSO4 הכוללת ליגנד NH3 הכלוא בתוך הליפוזומים

הערה: כלורופורם, מתנול, NH3 ו-CuSO4 מסוכנים. השתמש תמיד בכפפות ניטריל, משקפי מגן ומעיל מעבדה. טפל בכל הפרוטוקולים עם ריאגנטים אלה מתחת למכסה האדים. אחסן כלורופורם בבקבוק זכוכית ענבר. אחסן מתנול בארונות דליקים הרחק ממחמצנים. הרחק מתנול מלהבות או ניצוצות. סמן את כל מיכלי הפסולת עבור ריאגנטים אלה והשליך בהתאם לתקנות פינוי הפסולת המסוכנת המקומיות.

  1. הכן 20 מ"ל של תמיסות מלאי של 0.03 M עבור כל אחד מששת הפוספוליפידים - PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- בכלורופורם/מתנול (נפח 2 עד 1). המסות המולקולריות של PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 הן 768, 1466, 792, 867, 962 ו-1057 Da, בהתאמה.
  2. הכן 100 מ"ל של מאגר Tris-HCl (pH 7.4) של 0.10 M עם ריכוז סופי של 0.05 M CuSO4.
  3. הכן 4 מ"ל של מלאי 1.5 × 10-3 M HDP-2P במאגר 0.05 M CuSO4, 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4). המסה המולרית של HDP-2P היא 13.827 kDa.
  4. להכנת 100 מ"ל של תמיסת NH3 של 0.5 מ', השתמש בתמיסת NH3 של 25% (צפיפות 905 גרם/ליטר30, שווה ל-13.30 מ' [905 גרם/ליטר ×-0.25 מ' ÷-17.00 גרם/ליטר = 13.30 מ']). לפיכך, כדי להכין 100 מ"ל של 0.5 מ"ל NH3, השתמש ב-3.76 מ"ל של תמיסה של 25% NH3 : (0.5 מ×1,000 מ"ל ÷ 13.30 מ') ÷ 10 = 3.76 מ"ל של תמיסה של 25% NH3 . הניחו 3.76 מ"ל של תמיסת NH3 25% בבקבוק נפחי של 100 מ"ל והביאו את הנפח ל-100 מ"ל עם מאגר של 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4).
  5. להכנת ליפוזומים עם NH3 בנפח הפנימי של הליפוזומים, יש להניח 12.5 מ"ל של תמיסת פוספוליפידים מלאי 0.03 M בכלורופורם/מתנול בשפופרת ולייבש פוספוליפידים בוואקום של 10 Pa או למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. לחות את סרט הפוספוליפיד למשך שעה אחת עם 12.5 מ"ל של 0.5 M NH3, 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4) ב-25 מעלות צלזיוס בתרמוסטט; לאחר מכן סוניקציה של תרחיף השומנים בתדר 22 קילו-הרץ כמתואר בשלב 2.5 כדי לייצר ליפוזומים סוניקטיביים.
    הערה: בתמיסה עם ליפוזומים סוניקטיביים, NH3 ממוקם בתוך ומחוץ לליפוזומים.
  6. כדי לחסל NH3 מחוץ לליפוזומים, יש לבצע דיאליזה של הליפוזומים באמצעות קרום דיאליזה (חתך מולקולרי 1.0 kDa) לטמפרטורת חדר של 5 כובעים כנגד 0.10 M Tris-HCl (pH 7.4) באמצעות מערבל מגנטי.
    הערה: דיאליזה במשך 5 שעות הספיקה כדי להסיר לחלוטין את NH3, שכן תוספת של 0.5 מ"ל של ליפוזומים שעברו דיאליזה ל-0.5 מ"ל של 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 buffer הניבה את אותה צפיפות אופטית ב-600 ננומטר כמו זו של ליפוזומים שהוכנו ללא NH3 ומעורבבים עם אותו מאגר.
  7. לאחר דיאליזה, צנטריפוגה של הליפוזומים ב-200 × גרם למשך 90 דקות כמתואר בשלב 2.5 כדי לגלול את הליפוזומים. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הליפוזומים עם 5.0 מ"ל של 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 (pH 7.4), וחלקו את הליפוזומים המרחפים לחמש דגימות של 1.0 מ"ל כל אחת. הוסף לחמש דגימות 1.0 מ"ל אלה בנפרד 60, 40, 20 ו-0 מיקרוליטר של 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 (pH 7.4) ולאחר מכן 0, 20, 40, 60, 80 מיקרוליטר של מאגר מלאי HDP-2P כדי להתאים בדגימות הליפוזום את היחסים המולאריים HDP-2P/פוספוליפידים 0.000, 0.001, 0.002, 0.003 ו-0.004, בהתאמה.
  8. לדגור את דגימות הליפוזום למשך 30 דקות בתרמוסטט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס; לאחר מכן, מדוד את הצפיפות האופטית של דגימות הליפוזום ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. בצע את השלבים המתוארים בסעיף 3 עבור כל שש דגימות הליפוזום וחזור על הפעולה פי 3 כדי להבטיח קריאות משולשות של צפיפות אופטית עבור כל נקודת נתונים.
    הערה: סטיית התקן של נקודות נתונים ניסיוניות צריכה להיות תמיד בטווח של ±5% מהממוצע.

תוצאות

סימולציה של מידול מולקולרי של אינטראקציה של HDP-2P עם PI ופוספואינוזיטידים
תוכנית המידול המולקולרי מחשבת את תשעת אתרי הקישור הטובים ביותר על פני השטח המולקולאריים של קולטן (מולקולה גדולה יותר), הממוקד על ידי ליגנד (מולקולה קטנה יותר). אתרים אלה נקבעים על ידי שחרור תשע האנטלפיות הגבוהות ביותר, המציינים את האתרים בעלי זיקות הקישור הטובות ביותר. זיקות הקישור באות לידי ביטוי כערכים שליליים, מה שמצביע על כך שהקישור הבין-מולקולרי הוא תהליך אקסותרמי. במקרה של אינטראקציה של HDP-2P עם PI, הסימולציה חזתה ארבעה אתרי קישור (#3, #6, #7 ו-#8) עבור PI על פני השטח המולקולרי של HDP-2P בתוך המרכז הפעיל (טבלה 1). בנוסף, חמשת אתרי הקישור ל-PI נמצאו מחוץ למרכז הפעיל של HDP-2P. הסימונים של החלקים הטעונים והקוטביים בראש הקוטב של PI מומחשים באיור 1.

המרכז הפעיל של HDP-2P מורכב מחמש שאריות חומצות אמינו מרכזיות: Gly30, Gly32, His48, Asp49 ו-Lys69, המאפשרים יישור נכון של מצע פוספוליפידים במרכז הפעיל כדי להבטיח הידרוליזה קטליטית. כמה מבנים מעוגנים מייצגים מראים את הקישור של PI לשאריות חומצות אמינו מסוימות של המרכז הפעיל, בעוד שבאתר קשירה #6, PI עוסק בכל חמשת שאריות חומצות האמינו העיקריות של המרכז הפעיל באמצעות קשרים יוניים, יונים-קוטביים ומימן (טבלה 1). איור 2 ממחיש כיצד PI מקיים אינטראקציה עם כל חמש שאריות חומצות האמינו העיקריות במרכז הפעיל של HDP-2P בתוך אתר הקישור #6.

סימולציית העגינה של האינטראקציה בין HDP-2P ל-PI-4-P, המכילה קבוצת פוספט במיקום 4 של טבעת האינוזיטול, ניבאה רק את אתר הקישור #1 כמיקום שבו PI-4-P נקשר למרכז הפעיל של HDP-2P. באופן ספציפי, באתר זה, PI-4-P מקיים אינטראקציה עם שלוש שאריות חומצות אמינו מרכזיות של המרכז הפעיל - Gly30, Gly32 ו- Lys69 - באמצעות קשרים יוניים, יונים קוטביים ומימן (טבלה 2). איור 3 ממחיש את האינטראקציה של PI-4-P עם המרכז הפעיל של HDP-2P. בשמונת אתרי הקישור הנותרים על פני השטח המולקולרי של HDP-2P, PI-4-P נקשר למקומות מחוץ למרכז הפעיל.

סימולציות העגינה המולקולרית של אינטראקציות HDP-2P עם PI-4,5-P₂ (המכילות קבוצות פוספט במיקומים 4 ו-5 של טבעת האינוזיטול) לא גילו שום קישור למרכז הפעיל של האנזים בכל תשעת אתרי הקישור החזוי. במקום זאת, PI-4,5-P₂ נקשר באופן עקבי לחלל דמוי חריץ הסמוך למרכז הפעיל (איור 4), ויוצר קשרי יונים קוטביים ומימן עם שלושת שאריות HDP-2P, Trp31, Gly33 ו-Gln34).

בעוד שהקשירה של PI-4,5-P₂ לחלל דמוי חריץ ליד המרכז הפעיל של PLA2s התא או הארס לא תועדה בעבר, מאפיינים אנלוגיים מבניים מבוססים היטב בתחומי הומולוגיה של pleckstrin31 (PH) ו-epsin N-terminal homology32 (ENTH). תחומי איתות אלה משתמשים בארכיטקטורות חריץ הידרופוביות-קוטביות-קטיוניות דומות לזיהוי PI-4,5-P2 ספציפי31,32, למרות אופיים הלא אנזימטי. נוכחותו של מוטיב מבני דומה ב-HDP-2P מעלה אפשרויות מסקרנות של חיקוי אבולוציוני או אבולוציה מתכנסת כדי להקל על זיהוי תחום הממברנה על ידי HDP-2P. אם יאומת עוד יותר בשיטות אחרות, מחקר זה עשוי לייצג את המקרה המדווח הראשון של ארס PLA2 המשתמש במנגנון כזה לזיהוי פוספואינוזיטיד.

מעניין לציין שסימולציות עגינה מולקולרית של CL ו-PS באינטראקציה עם HDP-2P חזו את הקישור של שני הפוספוליפידים למרכז הפעיל של HDP-2P בשמונה מתוך תשעה אתרי קשירה, בעוד שאתר הקישור היחיד של CL ו-PS מחוץ למרכז הפעיל לא היה ממוקם בחלל דמוי החריץ (הנתונים לא הוצגו). ראוי גם לציין שכמו PI, PC נקשר למרכז הפעיל של HDP-2P בארבעה מתוך תשעה אתרי קשירה, וגם PI וגם PC, כמו CL ו-PS, אינם נקשרים לחלל דמוי החריץ (הנתונים אינם מוצגים). ממצאים אלה מצביעים על כך שלקבוצות הפוספט בטבעת האינוזיטול של PI יש זיקה גבוהה לחלל דמוי החריץ הממוקם בסמוך למרכז הפעיל. ניתוחים מבניים זיהו חללים אנלוגיים דמויי חריץ עם כתמי משטח הידרופוביים-קוטביים-קטיוניים ליד המרכז הקטליטי הן באנזימי תא33 והן באנזימי ארס34 PLA2 . הקישור של פוספואינוזיטידים לחללים אלה עשוי לגרום לשינויים קונפורמטיביים משמעותיים מבחינה פיזיולוגית, מה שעלול לעכב פעילות אנזימטית. יש לציין כי בקרב פוספואינוזיטידים, PI-4,5-P2 מפגין מאפייני סובסטרט גרועים במיוחד - איזופורמים אנושיים של PLA2 (סוגים ציטוזוליים, בלתי תלויים בסידן ומופרשים) מראים פעילות הידרוליטית מינימלית עד בלתי ניתנת לזיהוי כלפי PI-4,5-P235. זה מצביע על כך שקשירת פוספואינוזיטיד לתכונות מבניות שמורות אלה עשויה לשרת פונקציה פיזיולוגית מובהקת (למשל, עיכוב אלוסטרי) ולא פונקציות קטליטיות על פני משפחת העל PLA2 , הדורשת אימות ניסיוני עתידי.

פעילות הידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC מועשרים ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS או CL המנוטרים באמצעות קו-אנזים A עם חומצות שומן חופשיות
הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P בדגימות ליפוזומליות הוערכה על ידי שימוש בתמיסת קו-אנזים A. תמיסת הקו-אנזים A היא חסרת צבע אך הופכת לסגולה עם אצילציה על ידי חומצות שומן חופשיות המשתחררות במהלך הידרוליזה של פוספוליפידים המזרזת על ידי HDP-2P. העלייה שנוצרה בצפיפות האופטית, המתאימה למידת האצילציה של קואנזים A, נמדדה באופן ספקטרופוטומטרי ב-550 ננומטר. לכן, העלייה בצפיפות האופטית בדגימות ליפוזומליות שטופלו בקו-אנזים A ו-HDP-2P עומדת ביחס ישר לפעילות ההידרוליטית של HDP-2P.

איור 5 מציג את עקומות הפעילות ההידרוליטית כפונקציה של היחס המולרי HDP-2P/פוספוליפיד בדגימות ליפוזומליות שונות. הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P מתבטאת ביחידות שרירותיות (a.u.) של צפיפות אופטית (OD) הנמדדת ב-550 ננומטר. לא בנינו עקומת כיול כדי לקשר את ערכי ה-a.u. לריכוזים המולאריים של חומצות שומן חופשיות, שכן הניסויים הניסיוניים שלנו הראו כי חומצות שומן בממיסים אורגניים, כאשר הן מתווספות לתמיסות מימיות המכילות קו-אנזים A ואציל-קואנזים A סינתטאז, לא יצרו שינוי OD שניתן לזהות ב-550 ננומטר. זה מצביע על כך שחומצות שומן כאלה יוצרות מיצלות במקום להיקשר לקו-אנזים A. לעומת זאת, רק חומצות שומן שנוצרו על ידי ממברנה (המיוצרות על ידי פעילות PLA2 ) נקשרות לקו-אנזים A הקשור לממברנה, וכתוצאה מכך שינוי OD מדיד. האופי האמפיפתי של קו-אנזים A - בעל אזורים הידרופוביים והידרופיליים על פני השטח המולקולריים שלו - ממקם אותו באופן מועדף בממשק הממברנה-מים, מה שמקל על קשירת חומצות שומן המיוצרות על ידי פעילות PLA2 לקו-אנזים A. עם זאת, בתנאי בדיקה אלה, קביעת הריכוז המולרי של חומצות שומן אינה אפשרית. מסיבה זו, חוקרים המשתמשים בבדיקת קואנזים A מבטאים את הפעילות ההידרוליטית של PLA2 ביחידות שרירותיות של OD הנמדדות ב-550 ננומטר20.

העלייה הגבוהה ביותר בצפיפות האופטית, המקבילה לפעילות ההידרוליטית הגדולה ביותר של HDP-2P, נצפתה בליפוזומי PC מועשרים ב-CL או PS. ממצא זה מתיישב היטב עם המספר הגבוה ביותר של אתרי קישור ל-CL ו-PS במרכז הפעיל של HDP-2P. הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC מועשרים ב-PI הייתה נמוכה פי 3.0 ו-2.5 מאשר בליפוזומים מועשרים ב-CL או PS, בהתאמה, אך גבוהה יותר מאשר בליפוזומים טהורים של PC. זה מצביע על כך שהזיקה למרכז הפעיל של HDP-2P של PI גבוהה מזו של PC, למרות שלשני השומנים יש אותו מספר של אתרי קישור במרכז הפעיל.

ניתן להסביר את הפער לכאורה הזה על ידי הבדלים מבניים בקבוצות הראש הקוטביות של PI ו-PC. בעוד ש-PC היא מולקולה ניטרלית, קבוצת הטרימתילאמוניום הקטיוני שלה משתרעת החוצה לתוך התמיסה, בעוד שקבוצת הפוספט האניונית שלה ממוקמת קרוב יותר לאזור ההידרופובי של הממברנה. התפלגות מטען זו בקבוצת ה-PC עשויה ליצור דחייה אלקטרוסטטית כנגד ה-HDP-2P הבסיסי, ולהפחית את זיקת הקישור שלו. לעומת זאת, האופי החומצי של PI הופך אותו לזן שומנים אטרקטיבי יותר לאינטראקציה עם HDP-2P הבסיסי, מה שיכול להסביר את הפעילות ההידרוליטית הגבוהה יותר שלו בהשוואה לליפוזומים טהורים של PC.

הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC המועשרים ב-PI-4-P, כפי שמוצג באיור 5, מצביעה על הידרוליזה קטליטית מינימלית של פוספוליפידים. למרבה הפלא, עקומת הצפיפות האופטית המתקבלת מליפוזומי PC המועשרים ב-PI-4,5-P מצביעה על ביטול מוחלט של הפעילות ההידרוליטית על ידי HDP-2P בדגימת ליפוזום זו. ממצאים אלה מתיישבים היטב עם סימולציות העגינה, המנבאות אתר קישור אחד ל-PI-4-P במרכז הפעיל של HDP-2P, בעוד ש-PI-4,5-P2 אינו מראה זיקה קשירה למרכז הפעיל כלל. זה מצביע על כך שקבוצות הפוספט הקשורות לטבעת האינוזיטול מעכבות את קשירת הפוספוליפיד למרכז הפעיל של HDP-2P. אנו מציעים שקבוצות הפוספט על טבעת האינוזיטול משתרעות החוצה לתוך התמיסה, ועל ידי קשירה ל-HDP-2P באמצעות אינטראקציות בין-מולקולריות יוניות ויונים-קוטביות, הן שומרות על HDP-2P במרחק מפני הממברנה, ובכך מגנות על הממברנה מפני הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P. זה עולה בקנה אחד עם הממצאים האחרונים שחשפו כי אנזימי PLA2 ציטוזוליים, בלתי תלויים בסידן ומופרשים הראו פעילות הידרוליטית בקושי ניתנת לזיהוי או ללא פעילות הידרוליטית כלפי מצעי PI-4-P ו-PI-4,5-P2 35.

שינויי חדירות המושרים על ידי HDP-2P בממברנות ליפוזומליות PC מועשרות ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS או CL: הערכה באמצעות תגובת החלפת ליגנד בתמיסת CuSO4 עם NH₃ עטוף

ההשפעה של פעילות הידרוליטית HDP-2P על חדירות הממברנה של ליפוזומי PC המועשרים ב-PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS או CL נחקרה באמצעות תגובת החלפת ליגנד במערכת יונים מורכבת, שבה הליגנד המחליף היה עטוף בנפח הפנימי של הליפוזומים. שיטה פשוטה ואמינה זו מבוססת על תזוזה של ארבע מולקולות מים הפועלות כליגנדים ביון המורכב [Cu(H2O)6]2+ על ידי NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

במהלך התהליך של החלפת מולקולות מים ב-NH3 ביון הקומפלקס [Cu(H2O)6]2+, הצבע הכחול החיוור של [Cu(H2O)6]2+ עובר לצבע הכחול הכהה של [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. במערכת שבה NH3 עטוף בנפח הפנימי של הליפוזומים ו-[Cu(H2O)6]2+ קיים בתמיסה החיצונית, שינוי צבע זה - המנוטר באופן ספקטרופוטומטרי - מצביע על עלייה בחדירות הממברנה הליפוזומלית ל-NH3.

כדי להקים מערכת כזו, ביצענו פיזור פוספוליפידים במאגר Tris-HCl המכיל NH3, ויצרנו ליפוזומים סוניקטיביים עם NH₃ בתוך ומחוץ לליפוזומים. NH3 חיצוני הוסר על ידי דיאליזה, ולאחר מכן נוספה תמיסת CuSO4 לדגימת הליפוזום המכילה NH3 בנפח הפנימי שלה. לאחר מכן טיפלנו בליפוזומים ב-HDP-2P ועקבנו אחר שינויים בצפיפות האופטית באופן ספקטרופוטומטרי.

כדי לקבוע את אורך הגל האופטימלי למדידת שינויי צפיפות אופטית, רשמנו את ספקטרום הספיגה של [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ בתמיסת CuSO4 של 0.025 M, 0.100 M NH3 ו-[Cu(H2O)6]2+ בתמיסת CuSO4 של 0.025 M, תוך שימוש באור נראה בטווח של 500 ננומטר עד 900 ננומטר. כפי שמוצג באיור 6, הקרנה ב-600 ננומטר הניבה ספיגה מקסימלית עבור [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ וספיגה מינימלית עבור [Cu(H2O)6]2+, מה שהוביל אותנו לבחור 600 ננומטר כאורך הגל האופטימלי עבור ניסויי חדירות הממברנה שלנו.

איור 7 מראה כי חדירות הממברנה ל-NH₃ היא הגבוהה ביותר בליפוזומי PC המועשרים ב-CL ו-PS אניוניים. תצפית זו עולה בקנה אחד עם הנתונים שדווחו בעבר המראים כי HDP-2P, קבוצה IIA PLA2, מקיים אינטראקציה יעילה עם הפוספוליפיד האניוני פלמיטואילולויל-גליצרופוספוגליצרול, מה שמוביל להידרוליזה של סובסטרט - השפעה שלא נצפתה עם הפוספוליפיד הנייטרלי פלמיטואילולוילגליצרופוספוכולין36. באופן כללי, רוב האנזימים מקבוצה IIA PLA2 מציגים פעילות הידרוליטית גבוהה משמעותית כלפי פוספוליפידים אניונים 33,37,38. החדירות של ליפוזומי PC+PI נמוכה מזו של ליפוזומי PC+CL ו-PC+PS אך נשארת גבוהה מזו של ליפוזומי PC טהורים. ממצאים אלה מתיישבים היטב עם התוצאות של סימולציות עגינה ומבחני פעילות הידרוליטית HDP-2P. במילים אחרות, דגימות ליפוסומליות המציגות חדירות נמוכה צפויות להיות יציבות מבנית בשל חוסר היכולת של HDP-2P להידרוליפידים ובשל זיקה נמוכה יותר של HDP-2 להיקשר ל-PI ופוספואינוזיטידים, כפי שנחזה על ידי נתוני העגינה המולקולרית (איור 2, איור 3 ואיור 4). לכן, פעילות הידרוליטית של אנזים על ידי HDP-2P (איור 5) וחדירות הממברנה, כפי שמוצג באיור 7, צריכות להיות בקורלציה חיובית.

עם זאת, בליפוזומים PC+PI-4-P ו-PC+PI-4,5-P2 , החדירות לא עלתה עם טיפול ב-HDP-2P. בעוד שתוצאות החדירות של ליפוזומי PC+PI-4,5-P2 מתואמות היטב עם סימולציות עגינה ונתוני פעילות הידרוליטית HDP-2P עבור אותם ליפוזומים, היעדר חדירות מוגברת בליפוזומים PC+PI-4-P אינו מתיישב לחלוטין עם תוצאות הפעילות ההידרוליטית, שכן נרשמה מידה קטנה של פעילות הידרוליטית בליפוזומים אלה. ממצאים אלה מצביעים על כך שעלייה מקומית קלה בפעילות ההידרוליטית בליפוזומים PC+PI-4-P אינה מפריעה לאריזה דו-שכבתית של פוספוליפידים במידה שתשנה את חדירות הממברנה ל-NH3.

figure-results-2
איור 1: סימונים של חלקים טעונים וקוטביים של הראש הקוטבי של פוספטידילינוזיטול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 2: אינטראקציה של PI עם המרכז הפעיל של HDP-2P הצפוי עבור אתר קשירה #6 על ידי תוכנת עגינה מולקולרית. PI ניתן בייצוג מקל ו-HDP-2P ניתן בייצוג קו (תרשים משמאל) ומשטח מולקולרי (דיאגרמה מימין). עבור ייצוגי המקל, אמרלד מייצג פחמן, כתום הוא זרחן, אדום הוא חמצן ולבן הוא מימן. עבור פני השטח והקווים המולקולריים, ירוק מייצג פחמן, כחול הוא חנקן, אדום הוא חמצן, לבן הוא מימן וצהוב הוא גופרית. קווים שבורים צהובים מזהים קשרים בין-מולקולריים. חיצים מצביעים על שאריות חומצות אמינו במרכז הפעיל. קיצורים: PI = פוספטידילינוזיטול; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 3: אינטראקציה של PI-4-P עם המרכז הפעיל של HDP-2P הצפוי עבור אתר קשירה #1 על ידי תוכנת עגינה מולקולרית. PI-4-P ניתן בייצוג מקל ו-HDP-2P ניתן בייצוגי קווים (תרשים משמאל) ומשטח מולקולרי (תרשים מימין). עבור המקלות, אמרלד מייצג פחמן, כתום הוא זרחן, אדום הוא חמצן ולבן הוא מימן. עבור פני השטח והקווים המולקולריים, ירוק מייצג פחמן, כחול הוא חנקן, אדום הוא חמצן, לבן הוא מימן וצהוב הוא גופרית. קווים שבורים צהובים מזהים קשרים בין-מולקולריים. חיצים מצביעים על שאריות חומצות אמינו במרכז הפעיל. קיצורים: PI-4-P = פוספטידילינוזיטול-4-פוספט; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 4: אינטראקציה של PI-4,5-P2 עם המשטח המולקולרי של HDP-2P הצפוי עבור אתר קשירה #6 על ידי תוכנת עגינה מולקולרית. PI-4,5-P2 נקשר למערה דמוית חריץ הממוקמת מתחת למרכז הפעיל של HDP-2P. חמש שאריות חומצות האמינו העיקריות במרכז הפעיל ניתנות בסימון בן שלוש האותיות. PI-4,5-P2 ניתן בייצוג מקל ו-HDP-2P ניתן בייצוג קו (תרשים משמאל) ומשטח מולקולרי (תרשים מימין). עבור המקלות, אמרלד מייצג פחמן, כתום הוא זרחן, אדום הוא חמצן ולבן הוא מימן. עבור פני השטח והקווים המולקולריים, ירוק מייצג פחמן, כחול הוא חנקן, אדום הוא חמצן, לבן הוא מימן וצהוב הוא גופרית. קיצורים: PI-4,5-P2 = פוספטידילינוזיטול-4,5-דיפוספט; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 5: עקומות פעילות הידרוליטית מדגימות של ליפוזומים ביחסים טוחנים שונים של HDP-2P/פוספוליפידים. ליפוזומים עשויים PC+CL (ירוק כהה), PC+PS (כתום), PC+PI (כחול כהה), PC+PI-4-P (כחול), PC+PI-4,5-P2 (ירוק) ו-PC (סגול). ערכי הצפיפות האופטית ביחידות שרירותיות מייצגים את האמצעים של קריאות משולשות ב-550 ננומטר. קווי שגיאה מציינים את ה-SD של הקריאות המשולשות. המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בערכי הצפיפות האופטית בין דגימות הליפוזום הוערכה באמצעות ANOVA, כאשר כל ערכי ה-p נמצאו הרבה מתחת ל-0.05. קיצורים: PC = פוספטידילכולין; CL = קרדיוליפין לב בקר ; PS = פוספטידילסרין; PI = פוספטידילינוזיטול; PI-4-P = פוספטידילינוזיטול-4-פוספט; PI-4,5-P2 = פוספטידילינוזיטול-4,5-דיפוספט; a.u. = יחידות שרירותיות; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 6: ספקטרום ספיגה של תמיסות מימיות של קומפלקסים נחושת. קומפלקסים של נחושת [Cu(H2O)6]2+ (קו כתום) ו-[Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (קו כחול), המוקרנים על ידי אור נראה בטווח שבין 500 ננומטר ל-900 ננומטר. קומפלקס נחושת [Cu(H2O)6]2+ נוצר בתמיסה של 0.025 M CuSO4 וקומפלקס נחושת [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ נוצר בתמיסה של 0.025 M CuSO4 המכילה 0.100 M NH3. ערכי הספיגה באיור זה עבור כל נקודת נתונים הם האמצעים לקריאות הספיגה שנעשו בשלוש עותקים. קווי שגיאה מייצגים את ה-SD מהקריאות המשולשות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 7: עקומות חדירות הממברנה מדגימות של ליפוזומים. ליפוזומים עשויים PC+CL (סגול), PC+PS (כחול), PC+PI (כחול כהה), PC+PI-4-P (ירוק כהה), PC+PI-4,5-P2 (כתום) ו-PC (ירוק) ביחסים טוחנים שונים של HDP-2P/פוספוליפידים. ערכי חדירות הממברנה מבוטאים כערכי צפיפות אופטית ביחידות שרירותיות (a.u.) הנמדדות ב-600 ננומטר. כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של קריאות משולשות. קווי שגיאה מציינים את ה-SD של הקריאות המשולשות. המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בערכי הצפיפות האופטית בין דגימות הליפוזום הוערכה באמצעות ANOVA, כאשר כל ערכי ה-p נמצאו הרבה מתחת ל-0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: אנרגיות קשירת זיקה חזויות עבור קומפלקסים מולקולריים מועמדים של HDP-2P עם PI. סימולציות מודלים מולקולריים שימשו לחיזוי סוגי הקשרים וזיקות אתר הקשירה, כמו גם את החלקים הטעונים והקוטביים של קבוצת הראש של פוספטידילינוזיטול ושאריות חומצות האמינו HDP2P המשתתפות באינטראקציות הבין-מולקולריות שלהם. הקבוצות הטעונות והקוטביות של פוספטידילינוזיטול מודגשות באיור 1. שימו לב ש-Pb ב-NHpbδ+ מציין קשר פפטידי. קיצורים: PI = פוספטידילינוזיטול; HDP-2P = תת-יחידה בסיסית של פוספוליפאז ארס הצפע. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: אנרגיות קשירת זיקה חזויות עבור קומפלקסים מולקולריים מועמדים של HDP-2P עם PI-4-P. סימולציות מודלים מולקולריים שימשו כדי לחזות את סוגי הקשרים וזיקות אתר הקשירה, כמו גם את החלקים הטעונים והקוטביים הן של קבוצת הראש פוספטידיל-אינוזיטול-4-פוספט (PI-4-P) והן של שאריות חומצות האמינו HDP2P המשתתפות באינטראקציות הבין-מולקולריות שלהם. שימו לב ש-Pb ב-NHpbδ+ מציין קשר פפטידי. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

קובץ משלים 1: זרימת עבודה של עגינה מולקולרית. סקירה כללית של הליך העגינה המולקולרית באמצעות AutoDock, כולל בניית ליגנד, הכנת קולטנים, הגדרת תיבת רשת וביצוע סימולציות עגינה לחיזוי אינטראקציות PI-HDP-2P. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

במחקר זה, חקרנו האם קבוצות פוספט הקשורות קוולנטית לטבעת האינוזיטול בפוספטידילינוזיטול (PI) יכולות למנוע פירוק של ממברנות פוספוליפידים על ידי אנזים פוספוליפאזA 2 (PLA2). כדי להעריך את התקדמות פירוק ממברנת הפוספוליפידים הנגרמת על ידי הפעילות ההידרוליטית של PLA2, עיצבנו שיטה פשוטה אך רגישה ומדויקת ביותר למדידת שינויים בחדירות הממברנה, שאמורה לגדול ככל שההידרדרות המבנית מתקדמת.

השיטה מבוססת על תגובת החלפת ליגנד הכוללת את קומפלקס hexaaquacopper(II), [Cu(H2O)6]2+, תלוי בסביבה המימית מחוץ לליפוזומים פוספוליפידים, בעוד אמוניה (NH3) עטופה בתוך הליפוזומים. לאמוניה יש זיקה גבוהה יותר ל-Cu2+ מאשר למולקולות מים, אך NH3 חייב לחלחל דרך הממברנה הליפוזומלית כדי לגשת לשלב המימי החיצוני, שם הוא מחליף מולקולות H2O ב-[Cu(H2O)6]2+. אם השלמות המבנית של הממברנה הליפוזומלית נפגעת עקב הידרוליזה של פוספוליפידים מזורזים PLA2, חדירות מוגברת של הממברנה ל-NH3 תקל על החלפת ליגנד, מה שיוביל לשינוי צבע מהכחול החיוור של [Cu(H2O)6]2+ לכחול הכהה של [Cu(H2O)2(NH3)4]2+. ניטרנו את הטרנספורמציה הזו באופן כמותי על ידי שימוש בספקטרופוטומטריה כדי לתעד את השינוי בצפיפות האופטית ב-600 ננומטר.

השתמשנו בעבר ב-1H-NMR עם פרוציאניד יון פרמגנטי, [Fe(CN)6]3-, כדי לחקור שינויים בחדירות הממברנה המושפעים מ-HDP-2P24 ומקרדיוטוקסינים של ארס קוברה 24,25,26,27,28,39. השתמשנו גם במגוון בדיקות פלואורסצנטיות וזרחניות כדי לחקור את ההשפעות של קרדיוטוקסינים של ארס קוברה על חדירות הממברנות הליפוזומליות 20,23,40. עם זאת, בדיקות פרוציאניד ופלואורסצנט/זרחן הן ישויות מולקולריות גדולות שאינן פיזיולוגיות החודרות לממברנות השומנים כאשר שלמות הממברנה נפגעת משמעותית. לעומת זאת, בדיקת החלפת הליגנד החדשה שלנו משתמשת ב-NH₃ - מטבוליט תאי קטן וטבעי המסוגל לחלחל לממברנות השומנים בהפרעות עדינות של אריזת שומנים. רגישות משופרת זו של שיטת חדירות הממברנה החדשנית שלנו מעידה על יכולתה לזהות שינויים בחדירות הממברנה ביחס HDP-2P/ליפיד טוחנת של 0.001, בהשוואה ל-0.004 הנדרש לזיהוי ¹H-NMR/פרוציאניד23.

באותו מחקר, השתמשנו בכיבוי זרחן אריתרוזין על ידי פרוקן כדי לבחון את ההשפעות של HDP-2P על חילופי שומנים בין-ממברניים, המוערך על ידי השינוי ביחס בין אורך החיים של אריתרוזין בדגימות בדיקה (τn) לזה של דגימת הבקרה (τ0)23. ביחס מולארי HDP-2P/ליפיד של 0.004, ערך τn/τ0 ירד ל-0.423, מה שמצביע על מצב של נזילות ממברנה חדירה לקטיונים דו-ערכיים24. לפיכך, בדיקת החלפת הליגנד מבוססת NH₃ שלנו מזהה חדירות ממברנה ביחס מולרי HDP-2P/ליפיד של 0.001, בעוד שבדיקות קונבנציונליות (1H-NMR/פרוציאניד ומרווה בדיקה זרחנית) מזהות חדירות ממברנה רק ביחס מולרי של 0.004. זה מוכיח שהבדיקה מבוססת NH3 שלנו רגישה פי ארבעה מהבדיקות הקונבנציונליות.

הרגישות יוצאת הדופן של הבדיקה מבוססת NH3 שלנו הניבה נתוני חדירות שהיו בקורלציה הדוקה עם מדידות פעילות הידרוליטית, עם פער אחד לכאורה בלבד: ליפוזומי PC+PI-4-P הראו הידרוליזה לא משמעותית ללא שינויי חדירות, מה שמצביע על כך שייצור מינימלי של ליזופוספוליפידים/חומצות שומן מקומי אינו משפיע על אריזת השומנים העולמית, מה שאינו משפיע על שלמות מבנית הממברנה וחדירות הממברנה. לפיכך, מחקר זה הראה כי תגובת החלפת הליגנד במערכת יונים מורכבת, הכוללת ליגנד עטוף בנפח הפנימי של הליפוזומים, הניבה תוצאות שהתאימו בצורה מצוינת לנתוני הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P. ממצאים אלה, בתורם, היו בהסכמה חזקה עם מחקרים בסיליקו על קשירת PI ופוספואינוזיטידים למשטח המולקולרי של HDP-2P.

בסך הכל, סימולציית AutoDock במחקר הנוכחי גילתה כי PI נקשר למרכז הפעיל בארבעה מתוך תשעה אתרי קישור שזוהו, בעוד ש-PI-4-P נקשר למרכז הפעיל רק באחד מתשעת האתרים החזויים. הפעילות ההידרוליטית של HDP-2P בליפוזומי PC+PI-4-P הייתה נמוכה פי 5 מאשר בליפוזומי PC+PI. יתר על כן, מחקרים בתוך הסיליקו לא חזו קשירה של PI-4,5-P2 למרכז הפעיל של HDP-2P. באופן עקבי, מבחני פעילות PLA2 וניסויי תגובת החלפת ליגנד הראו כי PI-4,5-P2 עיכב לחלוטין הן את הידרוליזה של פוספוליפידים והן את העלייה בחדירות הממברנה, בעוד ש-PI-4-P הראה פעילות הידרוליטית פחותה ולא משמעותית ומנע לחלוטין שינויים בחדירות הממברנה. תצפיות אלה תואמות היטב את מחקרי הפעילות במבחנה של אנזימי PLA2 ציטוזוליים, בלתי תלויים בסידן ומופרשים בבני אדם כלפי PI, PI-4-P ו-PI-4,5-P235. מחקרים אלה הראו שרק PLA2 ציטוזולי מקבוצה IVA הראה פעילות קטליטית גבוהה יחסית כלפי PI ו-PI-4-P, בעוד שפעילותו כלפי PI-4,5-P2 בקושי ניתנת לזיהוי. כל שאר אנזימי PLA2 שנבדקו לא הראו פעילות כלפי PI-4,5-P235. חוסר פעילות זה מיוחס לקבוצות הפוספט ההידרופיליות ביותר בטבעת האינוזיטול, המפריעות לאינטראקציות פרודוקטיביות בין פני הממברנה לאנזימי PLA2 35. אנו מציעים כי ההתרחבות החוצה של קבוצות פוספט על טבעת האינוזיטול לתוך התמיסה ויכולתן ליצור קשרי יונים קוטביים ומימן עם שאריות של חלל דמוי החריץ של HDP-2P ככל הנראה מונעת מ-HDP-2P להתקרב לפני הממברנה מספיק קרוב כדי להפעיל את פעילותו ההידרוליטית, ובכך לייצב את הממברנה ולהפחית את הפירוק של ממברנות פוספוליפידים על ידי HDP-2P שעלול להזיק לתאים על ידי הפעלת מסלולי מוות תאי. נראה שמנגנון זה מתיישב עם תפקיד ההגנה הפוטנציאלי של פוספואינוזיטידים במצבי מחלה הכוללים פעילות אנזימים חריגה.

המתאם החזק בין תוצאות המתקבלות ממבחני חדירות ממברנה, מדידות פעילות הידרוליטית ובמחקרי עגינה מולקולרית בסיליקו מדגיש את האמינות של שיטת תגובת החלפת הליגנד. גישה זו, המשתמשת בליגנד עטוף בתוך ליפוזומים, מוכיחה את עצמה ככלי מדויק ויעיל להערכת שינויים בחדירות הממברנה הנגרמים על ידי הפרעות מבניות בארגון הדו-שכבתי היציב של פוספוליפידים. בעוד שאנו מכירים בכך שמחקרי עגינה מולקולרית המשתמשים ב-AutoDock המוצגים במאמר זה אינם מספקים הבנה מעמיקה של האופן שבו פוספוליפידים יכולים לקיים אינטראקציה עם HDP-2P בצורה דינמית ואורכית, יש לבצע מחקרי דינמיקה מולקולרית בעתיד כדי לזהות מנגנונים מולקולריים נוספים של האופן שבו HDP-2 יכול לחדור לשכבות פוספוליפידים המורכבות מפוספוליפידים שונים. חשוב לציין כי ביצוע מחקרי דינמיקה מולקולרית דורש משאבים חישוביים גבוהים, כגון מחשבים ואשכולות בעלי ביצועים גבוהים, שאינם זמינים במוסדות אקדמיים רבים שיש להם משאבים ומימון מחקר מוגבלים. לבסוף, אנו מכירים בשימוש בקולטן קשיח (HDP-2P) במאמר הטכניקות הנוכחי ובהיעדר סביבת ממס/ממברנה. עם זאת, אנו רוצים להדגיש כי ביצוע עגינה מולקולרית של HDP-2P עם פוספוליפידים שונים באמצעות קולטן קשיח היא הגישה המקובלת לבצע מחקרי עגינה ראשוניים לזיהוי מעבר ראשון של מבנים מועמדים מעוגנים שניתן לעקוב אחריהם בעתיד עם קולטן גמיש לאחר זיהוי שאריות חומצות האמינו הקריטיות בתוך הצד הקטליטי הנקשרות למצעים כדי להתמקד באזורים מולקולריים שניתן להפוך לגמישים ב לעקוב אחר מחקרי עגינה מולקולרית ובסביבה מומסת. לפיכך, מינוף שיתופי פעולה עם מוסדות אחרים שיש להם יותר משאבים יכול להיות דרך לעזור לאשש חלק מהממצאים הראשוניים שסופקו על ידי AutoDock ולזהות מנגנונים מולקולריים נוספים של אינטראקציות סובסטרט-אנזים.

לסיכום, ממצאי מחקר זה מראים כי ניתן ליישם ביעילות את שיטת תגובת החלפת הליגנד, המשתמשת בליגנד עטוף בתוך ליפוזומים, במחקרים על חדירות הממברנה בתהליכים שונים בתיווך ממברנה. אלה כוללים אינטראקציות ליגנד-קולטן, אינטראקציות שומנים-חלבון, חילופי ממברנות, היתוך וביקוע ממברנה והתכווצויות עצביות-שריריות, בין היתר. יתר על כן, גישה זו טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי לחקר תרופות ממברנוטרופיות. יחד עם זאת, אנו מכירים בכך שבעוד ששיטות חדשות בממברנות מודל הן יקרות ערך לניתוח מנגנונים ספציפיים של אינטראקציות ממברנה, הפשטות הטבועות בהן מגבילות את יכולתן לשכפל באופן מלא את המורכבות המבנית, הקומפוזיציונית והתפקודית של ממברנות ביולוגיות in vivo. לכן חיוני לפרש נתונים ממערכות מודלים בזהירות ולאמת ממצאים באמצעות מודלים תאיים או אורגניזמים במידת האפשר.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחקרים במאמר זה נתמכו על ידי מענק הסטארט-אפ מאקדמיית בייג'ינג צ'אויאנג קאי-וון (E.S.G.) ועל ידי פרס SEPA, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D). העבודה הנוגעת להכנת HDP-2 נתמכה על ידי מענק מקרן המדע הרוסית מס' 24-15-00280 (Y.N.U). המחברים מבקשים להודות לד"ר מרים ברנשמה על כתיבת התסריט ופיתוח הסרטון על היישום של סימולציית עגינה מולקולרית, שהוכן לאחר פרסום מאמר מחקר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תת-יחידה בסיסית HDP-2P של ארס הצפע V. nikolskii PLA2, HDP-2, טוהר 98.5%  המכון לכימיה ביואורגנית, מוסקבהHDP-2 מבודד לפי פוטוקול ב-PMID:18083205. HDP-2P טוהר מ-HDP-2 על ידי DEAE Sephadex A-50   
קרדיוליפין (לב, בקר) (מלח נתרן), >99%מקליןC916138
קואנזים A, FUJIFILM Wako' ערכת NEFA ו-nbsp;לקסינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב
צינור דיאליזה עם קרום תאית, חיתוך משקל מולקולרי של 1.0 קילודאלטוןSigma Aldrich Trading Co. Ltd., שנגחאי, סין  
תרמוסטט מיכל מים מבוקר דיגיטלית חברת YoungGuangMing Medical Instruments בע"מ, בייג'ינג, סין  
איזון אנליטי אלקטרוני מדויק FA2004 חברת Shanghai Maiyi Ltd., סין
ספקטרופוטומטר טווח UV-Visible JingHua 752שנגחאי ג'ינגחואה אינסטרומנטס בע"מ, שנגחאי, סין
L-α-פוספטידילכולין (ביצה, תרנגולת), ועוד; 95%מקליןL799415
L-α-פוספטידילינוזיטול (כבד, בקר) (מלח נתרן),> 99%מקליןL780292
L-α-פוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט (מוח, חזיר) (מלח אמוניום),> 99%מקליןL996223
L-α-פוספטידילינוזיטול-4-פוספט (מוח, חזיר) (מלח אמוניום), 99%מקליןL970250
L-α-פוספטידילסרין (מוח, חזיר) (מלח נתרן), >99%מקליןL864755
מערבב מגנטי JB-3 שנגחאי לייסי JB-3
מד pH PHS-3C Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., סין
מיקרוצנטריפוגה TGL-16B  חברת שנגחאי 3 אנטינג, שנגחאי, סין
מפזר אולטרסוני Yt-JY96-IIN שנחאי יטואו טכנולוגיה בע"מ, סין
משאבת ואקום TW-1Mטינגווי בע"מ, ונלינג, סין

מקורות

  1. De Matteis, A., De Camilli, P. Phosphoinositides. Biochim Biophys Acta Lipids. 1851 (6), 697-918 (2015).
  2. Hokin, M. R., Hokin, L. E. Enzyme secretion and the incorporation of P32 into phospholipids of pancreas slices. J Biol Chem. 203 (2), 967-977 (1953).
  3. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Effects of acetylcholine on the turnover of phosphoryl units in individual phospholipids of pancreas slices and brain cortex slices. Biochim Biophys Acta. 18, 102-110 (1955).
  4. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Phosphoinositides and protein secretion in pancreas slices. J Biol Chem. 233, 805-810 (1958).
  5. Lolicato, F., Nickel, W., Haucke, V., Ebner, M. Phosphoinositide switches in cell physiology: from molecular mechanisms to disease. J Biol Chem. 300, 105757(2024).
  6. Powis, G., et al. Pleckstrin homology (PH) domain, structure, mechanism, and contribution to human disease. Biomed Pharmacother. 165, 115024(2023).
  7. Burke, J. E., Triscott, J., Emerling, B. M., Hammond, G. R. V. Beyond PI3Ks: targeting phosphoinositide kinases in disease. Nat Rev Drug Discov. 22, 357-386 (2023).
  8. Palamiuc, L., Ravi, A., Emerling, B. M. Phosphoinositides in autophagy: current roles and future insights. FEBS J. 287, 222-238 (2020).
  9. Calvillo-Robledo, A., Cervantes-Villagrana, R. D., Morales, P., Marichal-Cancino, B. A. The oncogenic lysophosphatidylinositol (LPI)/GPR55 signaling. Life Sci. 301, 120596(2022).
  10. Madsen, R. R., Vanhaesebroeck, B. Cracking the context-specific PI3K signaling code. Sci Signal. 13, eaay2940(2020).
  11. Wills, R. C., Hammond, G. R. V. PI(4,5)P2: signaling the plasma membrane. Biochem J. 479, 2311-2325 (2022).
  12. Epand, R. M. Features of the phosphatidylinositol cycle and its role in signal transduction. J Membr Biol. 250, 353-366 (2017).
  13. De Craene, J. O., Bertazzi, D. L., Bär, S., Friant, S. Phosphoinositides, major actors in membrane trafficking and lipid signaling pathways. Int J Mol Sci. 18, E634(2017).
  14. Ivanova, A., Atakpa-Adaji, P. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and calcium at ER-PM junctions: complex interplay of simple messengers. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1870, 119475(2023).
  15. Premrajan, P., Abhithaj, J. A., Variyar, E. J. PLA2: implications in neurological disorders as a prospective therapeutic target. Phospholipases in Physiology and Pathology. 2, Academic Press. 139-158 (2023).
  16. André, S., et al. Modulation of cytosolic phospholipase A2 as a potential therapeutic strategy for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis Rep. 7 (1), 1395-1426 (2023).
  17. Trotter, A., et al. The role of phospholipase A2 in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Mult Scler Relat Disord. 27, 206-213 (2019).
  18. Schaloske, R. E., Dennis, E. A. The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system. Biochim Biophys Acta. 1761 (11), 1246-1259 (2006).
  19. Petrovic, U., et al. Ammodytoxin, a neurotoxic secreted phospholipase A2 can act in the cytosol of the nerve cell. Biochem Biophys Res Commun. 324 (3), 981-985 (2004).
  20. Gasanov, S. E., Dagda, R. K., Rael, E. D. Snake venom cytotoxins, phospholipase A2s, and Zn-dependent metalloproteinases: mechanisms of action and pharmacological relevance. J Clin Toxicol. 4 (1), 1000181(2014).
  21. Harris, J. B., Scott-Davey, T. Secreted phospholipases A2 of snake venoms: effects on the peripheral neuromuscular system with comments on the role of phospholipases A2 in disorders of the CNS and their uses in industry. Toxins (Basel). 5 (12), 2533-2571 (2013).
  22. Ramazanova, A. S., et al. Heterodimeric neurotoxic phospholipases A2: the first proteins from venom of recently established species Vipera nikolskii: implication of venom composition in viper systematics. Toxicon. 51 (4), 524-537 (2008).
  23. Chaudary, A. S., et al. Sphingomyelin inhibits hydrolytic activity of heterodimeric PLA2 in model myelin membranes: pharmacological relevance. J Membr Biol. 258, 29-46 (2025).
  24. Li, M., Gasanoff, S. E. Cationic proteins rich in lysine residue trigger formation of non-bilayer lipid phases in model and biological membranes: biophysical methods of study. J Membr Biol. 256 (4-6), 373-391 (2023).
  25. Gasanoff, E. S., Dagda, R. K. Cobra venom cytotoxins as a tool for probing mechanisms of mitochondrial energetics and understanding mitochondrial membrane structure. Toxins. 16, 287(2024).
  26. Li, F., Shrivastava, I. H., Hanlon, P., Dagda, R. K., Gasanoff, E. S. Molecular mechanism by which cobra venom cardiotoxins interact with the outer mitochondrial membrane. Toxins. 12 (7), 425(2020).
  27. Zhang, B., et al. Naja mosambica mossambica cobra cardiotoxin targets mitochondria to disrupt mitochondrial membrane structure and function. Toxins. 11, 152(2019).
  28. Gasanov, S. E., et al. Naja naja oxiana cobra venom cytotoxins CTI and CTII disrupt mitochondrial membrane integrity: implications for basic three-fingered cytotoxins. PLoS One. 10 (6), 1-28 (2015).
  29. Akosah, Y., Yang, J., Pavlov, E. Inorganic polyphosphate and ion transport across biological membranes. Biochem Soc Trans. 52 (2), 671-679 (2024).
  30. Weast, R. C. CRC Handbook of Chemistry and Physics. , 62nd ed, CRC Press. (1982).
  31. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M. Signal-dependent membrane targeting by pleckstrin homology (PH) domains. Biochem J. 350 (Pt 1), 1-18 (2000).
  32. Ford, M. G., et al. Curvature of clathrin-coated pits driven by epsin. Nature. 419 (6905), 361-366 (2002).
  33. Khan, S. A., Ilies, M. A. The phospholipase A2 superfamily: structure, isozymes, catalysis, physiologic and pathologic roles. Int J Mol Sci. 24 (2), 1353(2023).
  34. De Oliveira, A. L. N., Lacerda, M. T., Ramos, M. J., Pedro, A. F. Viper venom phospholipase A2 database: the structural and functional anatomy of a primary toxin in envenomation. Toxins. 16 (2), 71(2024).
  35. Hayashi, D., Dennis, E. A. Differentiating human phospholipase A2's activity toward phosphatidylinositol, phosphatidylinositol phosphate and phosphatidylinositol bisphosphate. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1869, 159527(2024).
  36. Alekseeva, A. S., et al. Heterodimeric V. nikolskii phospholipases A2 induce aggregation of the lipid bilayer. Toxicon. 133, 169-179 (2017).
  37. Burke, J. E., Dennis, E. A. Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling. J Lipid Res. 50, S237-S242 (2009).
  38. Dennis, E. A., et al. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chem Rev. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  39. Gasanov, S. E., Kim, A. A., Yaguzhinski, L. S., Dagda, R. K. Non-bilayer structures in mitochondrial membranes regulate ATP synthase activity. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1860, 586-599 (2018).
  40. Aripov, T. F., Gasanov, S. E., Salakhutdinov, B. A., Rozenshtein, I. A., Kamaev, F. G. Central Asian cobra venom cytotoxins-induced aggregation, permeability and fusion of liposomes. Gen Physiol Biophys. 8, 459-474 (1989).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת חדירות קרום ליפוזום לחקירת ההשפעות של קבוצות פוספטידילינוזיטול פוספט על הפעולה הממברנוטרופית של ארס PLA2
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.