חשיפת המורכבויות של שנאת זרים: שיעורים מלגיונלה פנאומופילה

השכיחות של זני חיידקים עמידים לתרופות חייבה לחפש גישות אנטיבקטריאליות חדשות כדי להילחם במחלות זיהומיות. אוטופגיה, תהליך אוקריוטי בסיסי שבאמצעותו תאים מפתחים שלפוחיות פגוציטיות המכילות חלבונים תאיים או אברונים, ממלא תפקיד חיוני בוויסות הומאוסטזיס תאי ותהליכים מטבוליים שונים¹. ככל שהידע על אוטופאגיה מעמיק, חוקרים גילו כי שלפוחיות אוטופאגיות יכולות לכוון באופן סלקטיבי לאברונים, חלבונים או פתוגנים ספציפיים². קסנופגיה מתייחסת לתהליך שבו תאים מזהים באופן סלקטיבי פתוגנים תוך-תאיים באמצעות אוטופגיה ומעבירים אותם לליזוזומים לפינוי³. תהליך זה קריטי למנגנון ההגנה של מערכת החיסון המולדת באורגניזמים אוקריוטיים⁴. כתוצאה מכך, הבהרת המנגנונים והוויסות שלה היא תחום מחקר חיוני, עם השלכות משמעותיות על פיתוח אסטרטגיות אנטי-זיהומיות חדשות.

Legionella pneumophila הוא פתוגן תוך-תאי גרם שלילי שבדרך כלל מדביק פרוטיסטים חד-תאיים מימיים. עם זאת, בני אדם יכולים לפתח זיהומים אופורטוניסטיים ממגע עם מים מזוהמים, מה שמוביל למחלת הלגיונרים, צורה חמורה של דלקת ריאות⁵. עם כניסתה לתא המארח, לגיונלה משתמשת במערכת הפרשה מסוג IV (T4SS) כדי להעביר כ-330 חלבוני אפקטור, המסייעים בהתחמקות מהתגובה החיסונית של המארח ומבטיחים הישרדות ושגשוג חיידקים בתוך התאים. לגיונלה, כמו סלמונלה, מעכבת קסנופגיה מארחת באמצעות חלבוני אפקטור, אם כי המנגנון המולקולרי המדויק עדיין לא נקבע⁶. לדוגמה, סלמונלה טיפימוריום מספקת אפקטורים להפרשה מסוג III (למשל, SopF) ש-ADP-ריבוסילאט את הוואקואולר V-ATPase וחוסמים את התחלת האוטופגיה⁷, בעוד ש-L. pneumophila משתמש ב-T4SS ובאפקטורים כמו RavZ ו-SidE כדי להפריע לשלבים מאוחרים יותר של קסנופגיה ^6,8. למרות הטקטיקות השונות הללו, שני הפתוגנים מתחמקים בסופו של דבר מפינוי קסנופגים, ומדגישים אסטרטגיות מתכנסות בהתחמקות מאוטופגיה. לפיכך, חקירת חלבוני האלימות הללו לא רק תורמת לפיתוח טיפולים אנטי-זיהומיים ספציפיים, אלא גם בעלת פוטנציאל לשפוך אור על המורכבויות המולקולריות של שנאת זרים.

מנגנוני שנאת זרים בפינוי פתוגנים

בשנת 1984, Rikihisa ואחרים גילו תגלית משמעותית שנויטרופילים נגועים בריקטסיה מייצרים אוטופאגוזומים, מה שסימן את המקרה הראשון של מעורבות של אוטופגיה בזיהומים חיידקיים⁹. מחקר נוסף מצא כי השראת אוטופגיה במקרופאגים באמצעות רפמיצין מביאה ללוקליזציה משותפת של חלבונים הקשורים לאוטופגיה LC-3 ו-Beclin-1 עם שלפוחיות המכילות Mycobacterium tuberculosis, ומונעת התפשטות חיידקים בתוך תאים¹⁰. בנוסף, ידוע כי פתוגנים תוך-תאיים כגון סלמונלה טיפי, ליסטריה, שיגלה פלקסנרי ובורקהולדריה מאלי גורמים לאוטופגיה, אשר לאחר מכן שולטת בצמיחתם בתוך תאי המארח¹¹.

קסנופגיה, צורה של אוטופגיה סלקטיבית, מורכבת משלושה תהליכים נפרדים: זיהוי מטען, גיוס קולטני אוטופגיה ופירוק בתיווך ליזוזום (כפי שמתואר באיור 1). עם זאת, המנגנון שבאמצעותו תאים מזהים פתוגנים פולשים (זיהוי מטען) ויוזמים אוטופגיה נותר לא ברור. מחקרים מצביעים על כך שכאשר חיידקים חודרים לציטופלזמה, יוביקוויטין ליגאז מחבר את היוביקוויטין לוואקואולים או לחלבונים נגועים בפתוגן הנמצאים על פני השטח של הפתוגנים 12,13,14. חלבונים מסומנים אלה מתאספים לאחר מכן למעטפת יוביקוויטין, עוטפת את הפתוגן ופועלת כפלטפורמת איתות לגיוס מתאמי אוטופגיה, בעיקר כולל p62/SQSTM1, NDP52, NBR1 ואופטינורין. מתאמי אוטופגיה מקלים על שנאת זרים על ידי אינטראקציה עם חלבונים דרך תחום האינטראקציה LC3 (LIR), מלבד תחום קשירת היוביקוויטין (UBD) המתווך את הקישור של חלבונים בכל מקום¹⁵. לדוגמה, ליגאזות E3 מארחות כמו LRSAM1 ופרקין מצמידות יוביקוויטין לחיידקים פולשים, ובכך מייצרות את אות מעטפת היוביקוויטין שמסמן אותם לפינוי קסנופגי^16,17. יתר על כן, קולטני קסנופגיה יכולים גם ליזום קסנופגיה על ידי קשירה לגלקטין על פני השטח של הפגוזום החיידקי או על ידי אינטראקציה ישירה עם חלבוני פני השטח של חיידקים^18,19. נקודת מבט אחרת מציעה כי חיידקים בתוך הפאגוזום עשויים לשנות את שיפועי היונים של השלפוחית באמצעות פגיעה בקרום, מה שמוביל לשינויים קונפורמטיביים ב-V-ATPases על הממברנה הפגוזומלית, המגייסים את קומפלקס Atg5-Atg12-Atg16L1 באמצעות קשירה לתחום WD40 של^{ATG16L1 7,20}. ATG16L1 יכול גם להיקשר להשלמת C3 המצפה את החיידקים הנבלעים דרך תחום WD40 שלו, ומגייס את קומפלקס Atg5-Atg12-Atg16L1 לפאגוזום החיידקי²¹. עדיין לא ברור אם מנגנוני הזיהוי השונים הללו מכוונים למיני חיידקים שונים או שהם מתרחשים בשלבים שונים של הדבקה. יש צורך במחקר וחקירה נוספים כדי להבין את המנגנונים הללו במלואם.

אסטרטגיות של פתוגנים להתחמק משנואת זרים

במהלך האבולוציה המשותפת עם המארח שלהם, פתוגנים תוך-תאיים פיתחו מנגנונים שונים לעיכוב שנאת זרים 22,23,24. התוצאה היא תגובה קסנופגית חלשה במהלך זיהומים, מה שמקשה על התבוננות^ב-25. לדוגמה, סטרפטוקוקוס בטא-המוליטי מפריש פרוטאז ציסטאין הנקרא SpeB המכוון לפירוק p62, NDP52 ו-NBR1. מוטנטים עם מחיקת SpeB לא היו מסוגלים להתנגד לאוטופגיה, וצמיחתם בתוך התאים דוכאה. ממצאים אלה מאשרים את התפקיד החיוני של מתאמי האוטופגיה הללו בשנאת זרים. נמצא כי חלבון האלימות VirG של Shigella flexneri גורם לשנאת זרים על ידי גיוס Atg5 למשטח החיידקים¹⁹. עם זאת, החיידק משתמש גם במערכת הפרשה מסוג III כדי להעביר את חלבון האפקטור IcsB, המעכב את הקישור של ATG5 ל-VirG¹⁹. כתוצאה מכך, אוטופגיה נמנעת מלהתרחש¹⁹. תחרות זו בין חלבוני חיידקים למנגנון אוטופגיה מצביעה על כך שחלבוני Atg יכולים לזהות ישירות חלבוני פני שטח חיידקיים כדי ליזום שנאת זרים. באופן דומה, חלבון האלימות CpbC של Streptococcus pneumoniae גורם לפירוק אוטופאגי של Atg14 על ידי יצירת קומפלקס p62-CpbC-Atg14, אשר בתורו מוריד את רמת Atg14. זה משפיע על קומפלקס Atg14-STX17, המתווך אינטראקציה של ליזוזום, ובכך מעכב קסנופגיה²⁶.

במחקר שהשתמש בסלמונלה כחיידק מודל, שו ועמיתיו גילו כי הנזק לשלפוחית הממברנה שנגרם על ידי הזיהום מזוהה על ידי V-ATPase, מה שמוביל להפעלת קסנופגיה באמצעות קשירה לתחום WD40 של ATG16L1⁷. הפעלה זו אינה חלק ממסלול האוטופגיה האופייני. בנוסף, לחלבון האלימות SopF יש את היכולת לתווך את ה-ADP-ribosylation (ADPRylation) של V-ATPases ולעכב את יכולתם ליזום קסנופגיה⁷. זה ממחיש כיצד חיידקים וחלבוני האלימות המופרשים שלהם יכולים לשמש ככלים רבי ערך לחקירה והבנה של התופעות והמנגנונים המורכבים של אוטופגיה, שלעתים קרובות קשה לחקור בתנאים פיזיולוגיים רגילים.

לגיונלה ושנאת זרים

L. pneumophila מבסס נישה שכפולה הנקראת וקואול המכיל לגיונלה (LCV) על ידי מניפולציה של פעילויות ביולוגיות חיוניות כגון אוביקוויטינציה של מארח²⁷, הובלת שלפוחית²⁸, מטבוליזם אנרגיה²⁹ ותנועתיות תאים³⁰. למרות נוכחותם של חלבונים רבים הנמצאים בכל מקום בתוך החיידקים התוך-תאיים³¹, לגיונלה פיתחה מנגנונים שונים לנטרול אוטופגיה, ומונעת היתוך של LCV עם ליזוזומים ^6,8.

RavZ מעכב אוטופגיה על ידי פיצול LC3-II

חלבון אפקטור הלגיונלה הראשון שנמצא כמווסת אוטופגיה הוא RavZ (Lpg1683). כפרוטאז ציסטאין, RavZ מבקע את קשר האמיד בין הגליצין הטרמינלי של הפחמן לבין שאריות חומצות האמינו הקודמות של LC3, מה שמוביל לפגיעה בלתי הפיכה בשומן LC3⁸. בהשוואה ללגיונלה מסוג בר, הזן המוטנטי עם מחיקת RavZ (ΔravZ) הראה עלייה משמעותית ברמות LC3-II ובמספר הפונקטה LC3 בתאי המארח לאחר הדבקה⁸. זן ליסטריה מהונדס גנטית (ΔhlyΔprfAcLLO) יכול לעורר תגובה קסנופגית חזקה עם כניסתו לתאים. כאשר תאים מדביקים במשותף, לגיונלה מסוג בר יכולה לדכא את הצטברות ה-LC3 סביב הזן ΔhlyΔprfAcLLO, אך ΔravZ מאבד את יכולתו לעכב את השראת הזן של קסנופגיה⁶. יתר על כן, ביטוי חולף של RavZ בתאי מארח מעכב אוטופגיה 8 הנגרמת על ידי^רעב. תוצאות אלה מצביעות על כך ש-RavZ מפעיל אפקט טרנס-אקטיבי רחב (כלומר, פועל באופן מפוזר בציטוזול) כדי לעכב אוטופגיה. באופן מפתיע, השכפול של מוטנט ΔravZ לא הושפע בתאים המארחים, ולא היה גיוס לכאורה של LC3 על קרום ה-LCV המכיל את מוטנט ΔravZ ^6,8. ממצאים אלה מצביעים על כך שלגיונלה עשויה להשתמש בחלבוני אפקטור אחרים, בנוסף ל-RavZ, כדי להתחמק משנואת זרים של המארח.

משפחת SidE ושנאת זרים

משפחת SidE מורכבת מארבעה חלבונים הומולוגיים בגודל של יותר מ-170 kDa, הנקראים SdeA, SdeB, SdeC ו-SidE³². חלבוני אלימות אלה דומים מבחינה מבנית עם יתירות תפקודית, כולם מכילים תחום מונו ADP-ribosyltransferase (mART) ותחום פוספודיאסטראז (PDE). מחקרים מצאו כי בהיעדר אנזים מפעיל יוביקוויטין (E1) ואנזים מצומד יוביקוויטין (E2), משפחת SidE מתפקדת כיוביקוויטין ליגאז עצמאי (E3), המזרזת שינוי ייחודי של פוספוריבוזיל אוביקוויטינציה (PR-Ub) של סובסטרטים 33,34,35. תהליך זה מתרחש בשני שלבים. אם ניקח את SdeA כדוגמה, ראשית, SdeA משנה את שאריות Arg42 של יוביקוויטין (Ub) עם קבוצת אדנוזין דיפוספט ריבוז (ADPR) הנגזרת מ-NAD+ באמצעות תחום ה-mART שלה, ויוצרת תוצר ביניים של ADPR-Ub^33,36. לאחר מכן, הקשר הפוספודיאסטר של ADPR-Ub נחתך על ידי תחום ה-PDE הפונקציונלי של SdeA, וכתוצאה מכך שחרור AMP וחיבור של PR-Ub עם שאריות הסרין של חלבון הסובסטרט³⁶.

למשפחת SidE יש מצעי חלבון אוקריוטיים רבים. בנוסף לתיווך פוספוריבוזיל בכל מקום של GTPases כגון Rab1A, Rab6A ו-Rab33B כדי להפריע להובלה שלפוחית^33,37, מחקרים אחרונים מצאו כי למשפחת SidE יש גם פונקציות אנטגוניסטיות נגד קסנופגיה ^6,38,39,40. בהשוואה ללגיונלה מסוג בר, זנים מוטנטיים חסרי גנים מקודדים ממשפחת SidE (ΔsidEs) מראים עלייה משמעותית בגיוס p62 ב-LCV⁶. בניגוד ל-RavZ, שפועל בטרנס, משפחת SidE עובדת ב-cis (פועלת באופן מקומי ב-LCV) כדי להגן על הוואקואול של לגיונלה עצמה מפני שנאת זרים. לגיונלה המעבירה חלבונים ממשפחת SidE אינה יכולה לדכא את הגיוס של p62^{סביב זני} ΔhlyΔprfAcLLO Listeria 6 נגועים במשותף. בדומה לזן ΔravZ, המוטציה ΔsidEs יכולה גם להתחמק משנאת הקסנופגיה המארח. המנגנון שבאמצעותו SidE נוגד קסנופגיה אינו ברור ועשוי להיות קשור להפרעתו למערכת ה-ubiquitination של המארח המתווכת על ידי ubiquitination של זרחן. לדוגמה, זרחון של יוביקוויטין על ידי SidE יכול למנוע זיהוי של LCV על ידי קולטנים קושרים יוביקוויטין, ובכך לחסום גיוס של מתאמים כמו NDP52 או optineurin לוואקואול.

אפקטורים אחרים העוסקים בשנאת זרים

בנוסף ל-RavZ ו-SidE, L. pneumophila מקודד אפקטורים אחרים - כולל LpSpl, Lpg1137 ו-Lpg2936 - המכוונים לשלבים שונים של מסלול האוטופגיה. LpSpl הוא אנזים מופרש המחקה ליז ספינגוזין-1-פוספט, ומבקע ספינגוזין-1-פוספט (S1P) למטבוליטים⁴¹. דלדול זה של S1P על ידי LpSpl מונע הצטברות ספינגוזין ומביא להפעלת mTORC1, ובכך מעכב את התחלת האוטופגיה⁴¹. Lpg1137 הוא פרוטאז המבקע את חלבון SNARE Syntaxin 17 (Stx17), הנדרש לאיחוי אוטופאגוזום-ליזוזום⁴². על ידי השפלה של Stx17, Lpg1137 מפריע להתבגרות האוטופאגוזום וחוסם את שלב ההיתוך הסופי של קסנופגיה⁴². Lpg2936 הוא אפקטור גרעיני הגורם לשינויים אפיגנטיים של גנים הקשורים לאוטופגיה (כגון ATG7 ו-LC3B), מה שמוביל לביטוי מופחת שלהם⁴³. ויסות נמוך זה של רכיבי הליבה של אוטופגיה מעכב את הביוגנזה של אוטופאגוזומים ברמת השעתוק⁴³. עם זאת, מעט ידוע על התפקידים של LpSpl, Lpg1137 ו-Lpg2936 בזיהום לגיונלה ; תרומתם להתחמקות קסנופגיה in vivo עדיין לא הובהר במלואה.

טבלה 1 מסכמת את האפקטורים העיקריים של L. pneumophila המעורבים בדיכוי שנאת זרים, את המטרות והתפקודים שלהם, ואת שלבי שנאת הקסנופגיה שהם משפיעים עליהם.

פרספקטיבה לעתיד

אי הוודאות העיקרית נותרה ומציעה צעדים קונקרטיים הבאים. ראשית, ההיררכיה הזמנית של אפקטורי הלגיונלה הפועלים על קסנופגיה אינה פתורה (LpSpl/mTORC1 מוקדם לעומת אמצע/סוף RavZ, SidE); שנית, מספר אפקטורים מווסתים אוטופגיה (למשל, LpSpl, Lpg2936) חסרים אימות in vivo ; שלישית, ההטרוגניות של תגובות קסנופגיות מסוג התא על פני תת-קבוצות מקרופאגים, אפיתל ונויטרופילים ממופה בצורה גרועה. אנו מציעים אטלסים של זיהומים שנפתרו בזמן (דופק-מרדף אחרי, ליפידומיקה LC3, פרוטאומיקה PR-ubiquitin, מדווחים חיים) כדי להורות על פעולות אפקטור; זני מחיקת אפקטור מזווגים (ΔravZ/ΔsidE/ΔlpSpl/Δlpg2936) במודלים של עכברים ספציפיים לסוג התא כדי לבסס סיבתיות; ומולטי-אומיקה חד-תאית/מרחבית בתוספת CRISPR/perturb-seq המתמקדת בציר V-ATPase-ATG16L1, תיוג LRSAM1/Parkin ומודולי מתאם (OPTN/NDP52/p62). באופן תרגומי, אנו מדמיינים מעכבים מכווני אפקטור החוסמים את RavZ (אתר פעיל של פרוטאז ציסטאין) או SidE (mART/PDE PR-ubiquitination) כדי לשחזר מאגרי LC3-II וגיוס מתאמים ב-LCV, לצד מאיצים מכווני מארח המשפרים את תיוג המטען (מפעילים LRSAM1/Parkin), מייצבים את מעורבות המתאם-LC3 ומכווננים את השטף באופן חולף (הפעלת TFEB, mTORC1 מבוקר). אספקה ממוקדת ריאות (למשל, ננו-חלקיקים בשאיפה המשלבים חומר אנטי-RavZ/SidE עם אגוניסט TFEB) צריכה להיבחן על ידי קריאות עם חותמת זמן, שנפתרו על ידי סוג התא (שטף LC3, תפוסת PR-Ub, גיוס מתאם, מדדי היתוך) ויעילות in vivo (עומס חיידקים, פתולוגיה, הישרדות).

L. pneumophila פיתחה מערך מרשים של אסטרטגיות להתחמק משנואת זרים, בעיקר באמצעות חלבוני האפקטור המגוונים שלה המפריעים לזיהוי מטען, אוביקוויטינציה, התבגרות אוטופאגוזום ואיחוי ליזוזומלי. מנגנונים אלה לא רק מאפשרים לפתוגן לשרוד ולהשתכפל בתוך תאי המארח, אלא גם חושפים היבטים חדשים של ויסות אוטופגיה. הבנת טקטיקות ההתחמקות הללו מספקת תובנות חשובות לגבי יחסי הגומלין המורכבים בין הגנת המארח להסתגלות מיקרוביאלית. מחקר עתידי צריך להתמקד בזיהוי אפקטורים נוספים, הבהרת המטרות המולקולריות שלהם והבהרת הוויסות הזמני שלהם במהלך ההדבקה. יתר על כן, מינוף תובנות מכניסטיות אלה יכול להנחות את הפיתוח של טיפולים מכווני מארח או חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים המשחזרים את תפקוד שנאת הזרים. המשך שילוב של גישות הדמיה מתקדמות, ביולוגיה מבנית ואומיקס יהיה חיוני לניתוח האינטראקציות הדינמיות בין L. pneumophila למנגנון האוטופגיה, מה שעשוי להוביל לאסטרטגיות חדשניות למאבק בפתוגנים תוך-תאיים.

לבסוף, אפקטורים רבים של לגיונלה הם רב תכליתיים, ומשפיעים על תהליכים מארחים מרובים מעבר לאוטופגיה. אותם אפקטורים המסייעים ל-L. pneumophila להתחמק מקסנופאגיה יכולים גם לווסת את מוות תאי המארח (אפופטוזיס) ומסלולי איתות חיסוניים, ולקדם עוד יותר את הישרדות החיידקים 23,30,35,44,45. הדיבור הזה בין התחמקות מאוטופגיה לבין מנגנוני הגנה אחרים של המארח מדגיש את הצורך ללמוד את טקטיקות האלימות של הלגיונלה באופן הוליסטי. חקירת האופן שבו אפקטורים מכווני אוטופגיה משפיעים בו זמנית על אפופטוזיס ודלקת תספק הבנה מקיפה יותר של אינטראקציות מארח-פתוגן ועשויה לחשוף יעדים חדשים להתערבות טיפולית.

איור 1: ייצוג סכמטי של מנגנון שנאת הזר. כאשר חיידקים פולשים לציטופלזמה, יוביקוויטין מצומד על ידי יוביקוויטין ליגאז לחלבונים הנמצאים על פני הפתוגן או לוואקואולים נגועים בפתוגן, ואחריו נוצרת מעטפת יוביקוויטין העוטפת את הפתוגן. מעיל יוביקוויטין זה משמש כפלטפורמת איתות לגיוס מתאמי אוטופגיה. בנוסף, קולטני האוטופגיה יכולים ליזום קסנופגיה על ידי קשירה לגלקטין פני השטח של הפגוזום החיידקי או אינטראקציה ישירה עם חלבוני פני השטח של החיידקים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: אסטרטגיות התחמקות קסנופגיה של אפקטורים של L. pneumophila. טבלה זו מפרטת חלבונים נבחרים של אפקטור L. pneumophila, המטרות או הפעילויות המולקולריות שלהם, והשלב במסלול הקסנופגיה שהם משבשים.