6: הדמיית פלואורסצנטיות כמעט אינפרא אדום של מפרצות באבי העורקים בבטן

ההליך הבא מספק שלבים מפורטים הדרושים לאיסוף תמונות VIVO ו- ex vivo NIRF מבעלי חיים קטנים:

1. התקנה ניסיונית

1. חבר מקור אור סיב אופטי למערכת הדמיית הפלואורסצנטיות באמצעות מדריך אור סיבים אופטיים.
2. בחר את מסנן העירור המתאים עבור הניסוי. מסנן העירור קובע את אורך הגל של האור שיש להעביר למדגם ויש לבחור אותו כדי להתאים את ספקטרום העירור של הפלורופור שהוכנס לדגימה.
3. בחר את מסנן הפליטה המתאים. מסנן הפליטה חוסם רכיבים ספקטרליים לא רצויים, אשר עשויים להיות מיוחסים autofluorescence, ויש לבחור כדי להתאים את ספקטרום הפליטה של הפלורופור.

2. הכנת מדגם

1. ב-Vivo
   1. מרדים את החיה בתא אינדוקציה באמצעות איזופלוראן בריכוז של 3-4% בחיוג מד הזרימה.
   2. מעבירים את החיה לקונוס אף קבוע בשלב ההדמיה, ושומרים על איזופלוראן בריכוז של 1-2%. מקור חום אינו נחוץ מכיוון שבעלי החיים בדרך כלל מצפים רק לפרק זמן קצר (> 5 דקות), וטמפרטורת הגוף שלהם אינה יורדת באופן משמעותי.
   3. אבטחו את כפותיו של בעל החיים כדי למזער את חפצי התנועה. הסר את השיער מאזור העניין על ידי החלת קרם depilatory.
   4. יש למרוח קרם דפילטורי על האזור הקטן ביותר הדרוש. אחרי 30, לנגב אותו עם כרית גזה. לנגב את האזור בפעם השנייה עם כרית גזה לחה אתיל אלכוהול כדי להסיר לחלוטין את קרם depilatory.
   5. יש למרוח משחה עיניים על העיניים כדי למנוע ייבוש הקרניות.
   6. הזריקו את הגשושית המולקולרית הפלואורסצנטית להחיות. עבור יישום ספציפי זה, בדיקות MMP2 הפעלה הוזרקו תוך ורידי לתוך הווריד הזנב. בשלב זה, ניתן לדמיין את העכבר. המשך ל"זיכוי תמונה " של פרוטוקול זה כדי להמשיך. לעקוב אחר החיה לנשימה סדירה לאורך כל ההליך הקצר.
2. אקס ויוו
   1. לאחר הזרקת הגשושית הפלואורסצנטית, המת חסד את החיה בצורה הומאנית על פי הנחיות AVMA לשנת 2013 לאותניה של בעלי חיים. פחמן דו חמצני (CO₂₎מנת יתר היא נוהג מקובל להרדים בעלי חיים קטנים.
   2. לחלץ בניתוח את הרקמה או איבר עניין בזהירות להסיר רקמת שומן עודף עם מלקחיים.
   3. לשטוף את הרקמה מלוחים חוצץ פוספט כדי להסיר את שאריות הדם ומניחים את המדגם ישירות על שלב ההדמיה.

3. רכישת תמונות

1. פתח את תוכנת ההדמיה המולקולרית והדליק הן את מקור האור הסיבים האופטיים והן את מערכת הדמיית הפלואורסצנטיות.
2. פתח את חלון הרכישה וציין את סוג החשיפה המתאימה למחקר. החשיפות הזמינות כוללות: חשיפה סטנדרטית ללכידת תמונה בודדת, חשיפה לשקיעת זמן ללכידת סדרה של תמונות לאורך מרווח זמן קבוע וחשיפה מתקדמת ללכידת רצף רציף של חשיפות בזמני חשיפה שונים.
3. בחר UV-Transillumination כמקור התאורה.
4. באמצעות התמונה בתצוגה מקדימה כהפניה, התאם את מוקד העדשה, את שדה הראייה ואת f-stop/צמצם בתא מערכת הלכידה כדי למטב את איכות התמונה שנדגמה. התאם את זמן החשיפה ואת המיקום של המדגם.
5. סגור את חלון התצוגה המקדימה וודא שכל הפרמטרים בחלון הרכישה תואמים להגדרות המצלמה והסינון.
6. לחץ על 'חשוף' כדי לרכוש ולשמור את התמונה.
7. תוכנת הדמיה מולקולרית סטנדרטית מספקת בדרך כלל מגוון כלים אנליטיים, מדידה ותיקון תמונה כדי לכמת אותות פלואורסצנטיים לניתוח תמונה.
8. בסוף מפגש ההדמיה, הסר את הדגימה/החיה, כבה את המערכת ונקה את שלב ההדמיה כדי למזער את הנזק למערכת.

הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום היא טכניקה אופטית המשתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות כדי לדמיין מכלולים ביומולקולריים מורכבים ברקמות. טכניקת הדמיה לא פולשנית זו, הידועה גם בשם NIRF, היא מהירה ואינה דורשת קרינה מייננת.

ב-NIRF, ניתן להצמיד בדיקות פלואורסצנטיות עם מולקולות קטנות לספציפיות גבוהה יותר לחקר התקדמות סרטן ומחלות לב וכלי דם. הם מעוררים על ידי אור אינפרא אדום קרוב החודר עמוק לתוך הרקמה ועשוי לשמש לתיחום רקמה בריאה מרקמה חולה המשנה את ריכוז מולקולות המטרה הללו.

סרטון זה ימחיש את העקרונות מאחורי הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום, כמו גם כיצד לבצע ניסויים in vivo ו-ex vivo בבעלי חיים קטנים כדי לחקור מגוון מחלות.

כפי שהשם מרמז, הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום משתמשת באור בתוך החלון הקרוב לאינפרא אדום הראשון שנע בין 650 ננומטר ל-900 ננומטר כדי להעביר פוטונים לרקמה. מולקולות פלואורסצנטיות ספציפיות למטרה הנקראות פלואורופורים מוחדרות בדרך כלל לבעל חיים באמצעות הנדסה גנטית או הזרקה לפני ההדמיה.

פלואורופורים אלה סופגים אנרגיית פוטון המעלה את האנרגיה של המולקולות ממצב הקרקע S0 למצב הנרגש הבלתי יציב S1 ראשוני. מכיוון שמצב זה אינו יציב, המולקולות יירגעו לרמת אנרגיית הרטט הנמוכה ביותר במצב הנרגש וישחררו את האנרגיה שלהן בצורה של חום. הפלואורופורים, כעת במצב נרגש רגוע S1, חוזרים למצב הקרקע, ופולטים אור באורך גל מסוים.

לאור זה אורך גל ארוך יותר מהאור שהוכנס במקור לפלואורופור בשל האנרגיה שמתפזרת בצורה של חום כאשר המולקולה נרגעת לרמת אנרגיית הרטט הנמוכה ביותר. לאחר מכן האור הנפלט נלכד ומוקלט באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית.

גרף של ספקטרום הבליעה והפליטה של הפלואורופור מראה את טווח אורכי הגל שהפלואורופור יכול לספוג ולפלוט בהתאמה. השינוי הבסיסי הזה, שהוא ההפרש בננומטר בין שיא הספיגה לאורכי הגל של שיא הפליטה, נקרא הסטת סטוקס. לכל פלואורופור יש היסט סטוקס מובהק המאפשר להבחין בין אור הפליטה לאור המרגש ומאפשר טכניקות הדמיה כגון NIRF.

לאחר שסקרנו את העקרונות העיקריים של הדמיית פלואורסצנציה קרובה לאינפרא אדום, בואו נעבור כעת על ההליך שלב אחר שלב להכנה והדמיה של בעל חיים.

ראשית, השתמש במוביל אור סיב אופטי כדי לחבר מקור אור סיב אופטי למערכת ההדמיה הקרינה. בחר את מסנן העירור התואם את ספקטרום העירור של הקרינה שתוכנס לדגימה כדי להבטיח שאורך הגל הנכון של האור מועבר.

לאחר מכן, בחר את מסנן הפליטה המתאים שיתאים לספקטרום הפליטה של הפלואורופור אשר יחסום רכיבים ספקטרליים לא רצויים שעשויים להיות מיוחסים לאוטופלואורסצנטיות.

כדי להתחיל להתכונן להדמיה in vivo, השתמש באיזופלורן כדי להרדים את החיה בתא נוקדאון. העבירו את החיה לחרוט אף המקובע בשלב ההדמיה. אבטח את כפות החיה כדי למזער חפצי תנועה. מרחו קרם אפילציה כדי להסיר את השיער מאזור העניין. לאחר מכן, מרחו משחה עיניים על עיני החיה כדי למנוע התייבשות הקרניות.

לאחר מכן, הזרקו את הגשושית המולקולרית הפלואורסצנטית הניתנת להפעלה לתוך החיה. כדי להתחיל ברכישת תמונה, פתח את תוכנת ההדמיה המולקולרית. הפעל גם את מקור האור של הסיבים האופטיים וגם את מערכת ההדמיה הקרינה.

לאחר מכן, פתח את חלון הרכישה וציין את סוג החשיפה המתאים למחקר. החשיפות הזמינות כוללות חשיפה סטנדרטית לצילום תמונה בודדת, חשיפה לדלג זמן לצילום סדרת תמונות במרווח זמן קבוע וחשיפה מתקדמת ללכידת רצף רציף של חשיפות בזמני חשיפה שונים.

לאחר מכן, בחר תאורת UV כמקור התאורה. השתמש בתצוגה המקדימה של התמונה כהפניה, כוונן את המיקוד, שדה הראייה ונקודת ה-F בתא מערכת הלכידה כדי למטב את איכות התמונה שנדגמה. התאם את זמן החשיפה והמיקום של הדגימה לפי הצורך. לאחר מכן, סגור את חלון התצוגה המקדימה. ודא שכל הפרמטרים בחלון הרכישה תואמים להגדרות המצלמה והמסנן. לחץ על "חשיפה" כדי לרכוש ולשמור את התמונה.

כדי להתכונן להדמיה ex vivo, המתת חסד של החיה בצורה אנושית לאחר הזרקת הגשושית הפלואורסצנטית. בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות את כל עודפי השומן סביב אבי העורקים. לאחר מכן, יש לחלץ בניתוח את הרקמה או האיבר המעניין. שטפו את הרקמה במי מלח עם פוספט כדי להסיר שאריות דם. לאחר מכן, הנח את הדגימה ישירות על שלב ההדמיה.

דמיין את רקמת ex vivo לפי אותו פרוטוקול המתואר עבור הדמיה in vivo. בסיום, הסר את הדגימה מהבמה. כבה את המערכת ונקה את ההדמיהtagה.

כעת, לאחר שהשלמנו את הפרוטוקול להשגת תמונות שדה קרוב לאינפרא אדום, בואו נסקור את תוצאות הסריקות הללו.

בתמונות מייצגות אלה, בדיקה פלואורסצנטית ניתנת להפעלה מוזרקת באופן מערכתי דרך וריד הזנב כדי לדמיין את המטריצה מטאלופרוטאינאז או MMP2. כאן אנו רואים תמונת NIRF in vivo של עכבר חסר אפוליפופרוטאין-E שפיתח מפרצת באבי העורקים הבטני בעקבות עירוי של אנגיוטנסין II. בעוד שרוב כתמי האות הגבוהים הקטנים הם מאוטופלואורסצנטיות של העור, כלי הדם מוצגים חזותית כמבנים צינוריים עם אותות פלואורסצנטיים גבוהים.

התמונה המייצגת השנייה משווה תמונות NIRF של מפרצת אבי העורקים הבטני משני מודלים שונים של בעלי חיים. האחד, מפרצת אבי העורקים הבטני העל-רנלי בעכבר חסר אפוליפופרוטאין-E עם אנגיוטנסין II. ושתיים, מפרצת באבי העורקים הבטני בחולדה שהוחדרה באלסטאז לבלב חזיר.

בכל אחד מהם, אנו רואים עלייה בפעילות MMP2 באזור המפרצת של אבי העורקים הבטני. עודפי בדיקות פלואורסצנטיות מסוננים ומצטברים בכליות, מה שמסביר את האותות הפלואורסצנטיים הבהירים שנצפו שם.

הבה נסתכל כעת על כמה יישומים אחרים של דימות שדה קרוב לאינפרא אדום. ראשית, ניתן להשתמש בהדמיית NIRF כדי לחקור מחלות לב וכלי דם במודלים של עכברים.

במחקר זה, עכברי נוקאאוט מוזרקים עם שתי בדיקות פלואורסצנטיות שונות באינפרא אדום קרוב. אבי העורקים נקצרים 24 שעות לאחר מכן ומוערכים באמצעות הדמיית NIRF. התוצאות מראות תגובת NIRF משמעותית, המצביעה על נוכחות של הסתיידות נרחבת הממוקמת במקביל להצטברות מקרופאגים.

ניתן להשתמש בהדמיית NIRF גם לאיתור והערכה של גידולים in vivo. במחקר זה נוצרים רקמות המדמות פנטומים בשד המכילים תכלילים המדמים גידול פלואורסצנטי. לאחר מכן מדמים את היישומים של הדמיית NIRF במהלך ניתוח שימור שד.

התוצאות מראות כי תכלילים דמויי גידול ניתנים לזיהוי על ידי NIRF עד לעומק של כשני סנטימטרים. תכלילים עמוקים יותר מזה ניתנים לזיהוי לאחר ביצוע חתכים ברקמת הפנטום העליונה. לאחר הסרת התכלילים, המנתח מעריך את תמונות ה-NIRF. כל פלואורסצנטיות שנותרה, המעידה על נוכחות גידולים, מעידה על הסרה לא מלאה ולאחר מכן נכרתת.

זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE להדמיה אינפרא אדום כמעט. כעת עליך להבין את העקרונות של עירור ופליטת פלואורופור, כיצד להכין בעל חיים להדמיית NIRF in vivo ו-ex vivo וכמה יישומים ביו-רפואיים. תודה שצפית!