בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

תאים סרטניים החלב להביע בלוציפראז מושתלים תת עורי בעכברים דמיינו באמצעות דימות אופטי כדי לפקח על גדילה והתפתחות הגידול הלא פולשני במחקר האורך.

כדי להתחיל בהליך זה, קו תאי גידול החלב המבטא לוציפראז מופשר מגבעולים קפואים ולאחר מכן מורחב בתרבית לשטף COF של 90%. דילול סדרתי של תאים מרחפים נזרעים לאחר מכן ב-96. ובכן לוחות שנחשפו ללוציפרי ואז מספר התאים האופטימלי המייצרים פליטות פלואורסצנטיות מעל 500 פוטונים נקבע באמצעות צלחת לאחר מכן מוזרקים תאי קורא, תת עורית לאגף של בעל חיים, ולאחר מכן מוזרק לוציפראז.

ניתן לדמות תאים תוך-צפקיים כבר 10 דקות לאחר מתן לוציפר, וניתן לדמיין את מסת הגידול עד חודש in vivo עד להופעת הנמק. היי, אני אד לים ממעבדת ההדמיה בקליפר מדעי החיים באלמדה, קליפורניה. היום נראה לכם הליך לניטור צמיחת גידול בעכברים באופן לא פולשני באמצעות ביולומינסנציה.

הליך זה משמש במעבדה שלנו ובמעבדת IVUS, ברחבי העולם לחקר צמיחה והתפתחות של גידולים, במיוחד לאחר טיפול בתרכובות תרופות. אז בואו נתחיל. הליך זה מתחיל בהכנת קו תאי הגידול להזרקה לעכבר.

ניתן להשתמש במגוון רחב של קווי תאים סרטניים המבטאים לוציפראז לניסויים פרה-קליניים ביולומינסנטים. תאים אלה מסופקים כתרבית קפואה נטולת פתוגנים, שתגדל בקלות במדיה סטנדרטית ללא צורך בסמני בחירה. לצורך הניסוי שלנו, נשתמש בקו תאי גידול החלב של לוק 2 עכברים, המבטא את גן הלוציפראז המשמש כאינדיקטור אופטי לביטוי גנים או גידולים.

in vivo, נשתמש בביטוי לוציפראז כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול הראשוני באופן לא פולשני, אך ניתן להשתמש בו גם לאיתור ולניטור נגעים גרורתיים. יש לוודא את פעילות הלוציפראז לפני ההזרקה, וכדי לעשות זאת, בקבוק משולב של 90% נקצר על ידי טריפסין ולאחר מכן נספר. לאחר מכן מחולקים 50,000 תאים בבאר אחת של צלחת מיקרוטיטר ומתבצע דילול סדרתי.

לוציפר מתווסף לבארות ב-150 מיקרוגרם למיליליטר ומודגר במשך שתי דקות. ניתן לדמות את המיקרו-פלטה ב-ivus או בקורא לוחות זוהר כדי לקבוע את רמות הביטוי. קו תאים זה מבטא עד 6,500 פוטונים לשנייה לתא, אך ניתן לדמות בהצלחה כל רמת ביטוי מעל 30 פוטונים לשנייה לתא in vivo.

כעת, כשיש לנו תאים בעלי פעילות אופטימלית, נוכל להמשיך לשלב ההזרקה התת עורית. על מנת להקל על זיהוי אופטימלי של הגידול, אנו משתמשים בזן עכבר עירום מדוכא חיסון Amymic. לפני ההזרקה, בעלי חיים מורדמים באמצעות 3% ISO פלואור למשך חמש דקות להרדמה עמוקה.

לאחר מכן, נזריק 250,000 תאים במאה מיקרוליטר PBS תת עורי לאגף. טען את התאים במזרק מיליליטר אחד והצמד מחט בגודל 26. הרם את העור בעדינות בעזרת מלקחיים כדי ליצור אוהל ולהזריק את התאים בבסיס.

ניתן לדמות את התאים החדשים שהוזרקו באופן מיידי. סך הכל 150 מיליגרם של לוציפר לק"ג משקל גוף ניתן לאחר מכן באמצעות שתי זריקות לחלל הצפק. במחקר זה, בעלי חיים מצולמים 10 דקות לאחר הזרקת לוציפריאן כדי להבטיח שטף פוטונים עקבי.

אנו נראה לך זאת בשלב הבא. לצורך הניסוי שלנו, נשתמש במערכת הדמיה של ספקטרום IVUS in vivo, המשתמשת במכשיר מצמד מטען דק אחורי מקורר ל-90 מעלות צלזיוס שליליות כדי להשיג רגישות מקסימלית. כדי לתמוך בכימות מוחלט, המערכת מודדת מטען כהה בזמן השבתה ומפעילה כיול עצמי במהלך האתחול.

כדי להתחיל בהדמיה, אתחל את מערכת ה-IVUS והגדר את פרמטרי ההדמיה לניסוי. בחר שדה ראייה. עבור מספר בעלי החיים המצולמים, ניתן להחזיק עד חמישה בעלי חיים במכשיר באמצעות סעפת ההרדמה האינטגרלית.

השלב הוא בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בבעלי החיים. יציאת א.ק.ג מסופקת לניטור בריאות בעלי החיים במהלך הליכים מלחיצים בחשיפה לתוכנת תמונה חיה, ניתן לבצע אופטימיזציה של זמן F-stop וקשירת פיקס על סמך רמת הביטוי של קו התאים. ניתן לשנות הגדרות אלה בכל עת במהלך ניסוי מבלי להשפיע על התוצאה הכמותית.

Ivus רוכש תמונה צילומית של החיה תחת אור לבן באות ביולומינסנט או פלואורסצנטי כמותי, המונח על התמונה, האות הביו-לומינסנט מתבטא בפוטונים לשנייה ומוצג כמפת עוצמה. תצוגת התמונה מותאמת כדי לספק ניגודיות ורזולוציה אופטימליים בתמונה מבלי להשפיע על הכמות. ניתן למדוד את הזוהר מהתאים באתר ההזרקה באמצעות אזור עניין. כלי.

נתוני המדידה מוצגים בטבלה יחד עם כל הפרמטרים הניסיוניים הקשורים לצילום התמונה, אותם ניתן לשמור או לייצא. לצורך ניתוח, ניתן לרכוש ולהשוות תמונות מרובות ומחקרי אורך המכסים שניות או חודשים בהתאם לאופי הניסוי. נמדוד את שטף הפוטונים מהגידול בזמן אפס ונעקוב במשך ארבעה שבועות.

בהדמיה במרווחים דו-שבועיים, שטף הפוטונים מהגידול הוא פרופורציונלי למספר התאים החיים המבטאים לוציפראז. אז ביולומינסנציה נמצאת בקורלציה ישירה עם גודל הגידול חמישה ימים לאחר ההשתלה. הגידול עדיין לא מוחשי, אך ניתן לכמת את התאים באמצעות ביולומינסנציה ונראה שהגידול גדל באופן פעיל.

בשלב זה, אות הביו-לומינסנציה חזק בהרבה. ניתן לכוונן את זמן החשיפה f-stop וסיבוב הפיקסלים כך שהתמונה תהיה ברורה והמצלמה לא תהיה רוויה. IVUS מפצה אוטומטית על השינויים באיסוף האור.

כך שניתן להשוות את המדידות הללו לאלו שנאספו מוקדם יותר ומאוחר יותר. בניסוי. 15 יום לאחר ההשתלה הגידולים מוחשיים ומדידת ביולומינסנציה כבר הפיקה 15 יום של נתונים.

לאחר 28 יום, גידולים לאחר ההשתלה הופכים לנמקיים ותאים מתחילים למות. גודל הגידול המוערך על ידי מדידת קליפר אינו משתנה באופן ניכר, אך הזוהר מהגידול יקטן. ניתן להמשיך בקליבר של מוות תאים ומדידת ביולומינסנציה עד להגעה לנקודת קצה הומאנית.

נמק גידול עקב היפוקסיה או משטרי טיפול יצוין על ידי ביולומינסנציה מופחתת גם אם הם אינם מפחיתים את מסת הגידול. זה עתה הראינו לך כיצד לעקוב אחר התפתחות גידול תת עורי, מודל עכבר קסנוגרפט פשוט באמצעות הדמיה ביולוגית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את רמת הביטוי של התאים שלך לפני ההשתלה.

שנית, לשחזור מקסימלי דמו את החיות בזמן האופטימלי לאחר הזרקת לוציפריאן. הרגישות של השיטה מאפשרת לעקוב אחר התפתחות הגידול בשלבים מוקדמים מכיוון שניתן למדוד גידולים על ידי ביולומינסנציה הרבה לפני שניתן למדוד אותם באופן אמין על ידי מחוגה. זכור לייעל את פרמטרי ההדמיה שלך בכל שלב שאות הזוהר אינו רווי, אך על ידי זוהר, ניתן לנטר את בעלי החיים כמותית במשך חודשים כדי לחקור את השפעות ההפוגה וההישנות.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.