Name: תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: למד שיטה לאיסולציה ותרבות מיוציטים בוגרים מלב עכברוש באמצעות קולגנאז ופרוטאז. הפרוטוקול מספק תאים ברי-קיימא למחקר פיזיולוגי לבבי וניסויים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

חלק א הכנה לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הניתוח חולדה, לוודא את כל פתרונות מורכבים, אבל לא להוסיף כל האנזימים עדיין. Buffers, B ו החיץ לשטוף צריכים להיות מסוננים על סטריליות לפני האחסון. מאגרים צריכים להיות מאוחסנים 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 גם תרבות צלחות רקמות חייב להיות מצופה עם 10-20 מיקרוגרם / מ&quot;ל laminin ב 2 מ&quot;ל 1XSFM יום לפני, וגם צריך להיות מאוחסן על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניתוח, להכין את מכשירי ניתוח עיקור על ידי מהדק, מספריים, מלקחיים עם אתנול ו 70% ולתת להם להתייבש על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק 1 מ&quot;ל מלאים פתרון 0.5 מ&quot;ל הפרין (90 U / ml) היא מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו זה תרגול טוב לשטוף את מנגנון זלוף ידי פועל באמצעות אתנול 70%, באמצעות המשאבה peristaltic הפוך. סיים לאחר שטיפה עם אתנול, לשטוף את המנגנון עם מים מזוקקים פעמיים, ולבסוף לשטוף עם הצפת א לזרום דרך נאסף בכוס להציב אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את מנגנון זלוף לנקות, למלא את הצינור מזרק ימין עם 40 מ&quot;ל של הצפת ואת הצינור מזרק נשאר עם 40 מ&quot;ל של הצפת B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש בצינור זלוף אל קצה הצנתר על ידי מתן הצפת לזרום דרך המנגנון. מילוי למאגר מזרק לרמה 40 מ&quot;ל. ודא שאין בועות אוויר שנלכדו בצינור לאחר שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, לסגור את המאגר שסתום שסתום המזרק לחזור על התהליך עם B מאגר כזה צינורות טפטוף ערוכה עכשיו עם הצפת B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, מנגנון זלוף נשאר עם B חוצץ שסתום שסתום פתוח, אך עם הזרם הפסיק להשתמש הרגולטור על הקו הרביעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את המאגר זרימה למרות בכוס האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבר האחרון לעשות לפני הניתוח היא להוסיף את האנזימים הדרושים לפתרון המניות שלך, ואז לסנן את הפתרון אנזים בדיוק כמו פתרונות אחרים סוננו יום קודם לכן. לאחר סינון, פתרון זה אפשר להשאיר בטמפרטורת החדר. </li></ol> חלק II. הלב עכברוש לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרוטוקול הסטנדרטי בעקבות להרדים את עכברוש עם Isoflurane בתא הגזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור החתך על החזה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזה פתח באמצעות מספריים לחשוף לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק החדר השמאלי עם פתרון 0.5 מ&quot;ל הפרין (90 U / mL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלב עם חלק גדול של האאורטה המקום ללא פגע, בקרח קר הצפת B. </li></ol> חלק III. Myocytes בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב עכברוש טיפוסי צריך תשואה גבוהה של חלק בצורת מוט myocytes (בניגוד לתאי מעוגל מת) אם ההליך הבא הוא דבק כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, מהדק אל אבי העורקים הקטטר. קצה הצנתר לא צריך להיות חזק מדי ללב, כדי להבטיח זלוף טוב של הלב דרך העורק הכלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידק פעם לקשור את אבי העורקים אל קטטר עם תפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לפתוח את קו IV הרגולטור על מנת לאפשר קצב טפטוף מהיר (~ 60 טיפות / min) ולאפשר B הצפת לשטוף החוצה את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך לשטוף B חוצץ, השתמש במספריים קטנים מלקחיים כדי להסיר את הפרוזדורים וכל רקמת שומן או ריאות נצמד ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצפת B הוא סיים, לעבור את זרימת למאגר א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות הצפת מותר לזרום במשך 5 דקות, קטן מספר משימות יש לבצע במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לחמם את הפתרון אנזימים בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, כאשר מאגר מתרוקן מן המזרק (אבל עדיין קיימת בצינור), עומס 50 מ&quot;ל הפתרון אנזימים בתוך מזרק של המנגנון זלוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו זה צריך לבטל את כל זרימה דרך מן הקנקן אוסף באמבט מים (על ידי pipetting), עד לב הפתרון אנזימים perfuses. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פתרון אנזימים perfuses הלב, להפעיל את המשאבה peristaltic אשר מוגדר להעביר את פתרון האנזים מן הקנקן איסוף לחדש מזרק א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון אנזים לזרום דרך הלב עבור 10 דקות. כמו הלב מעכל, הוא מתחיל להיראות נפוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 37.5 μL של 0.1 מ &#39;CaCl 2 לפתרון האנזים מזרק לתת ריכוז יעיל של 0.1 מ&quot;מ Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות להעלות את ריכוז הסידן mM 0.2 ידי הוספת μL נוסף של 50 0.1 M CaCl 2 אל מזרק ולתת זלוף להמשיך במשך 10 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את החדרים ולהעביר מבחנה סטרילית קטן המכיל 20 מ&quot;ל אנזימים פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב כוס להגדיל את ריכוז הסידן מ&quot;מ 0.4 ידי הוספת 40 μL יותר של 0.1 מ &#39;CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לרכך את הלב לתוך 10 או יותר חתיכות עם זוג מספריים סטרילי קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הכוס במשך 5 דקות ב 37 מעלות עם נדנדה עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;CaCl 2 אללתת ריכוז יעיל של 0.6 mM Ca 2 + בעדינות triturate את חתיכות הלב עם pipet העברה פלסטיק 3-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דוגרים במשך 5 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 40 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;CaCl 2 בעדינות triturate כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד myocytes יחיד מעוכל מן הלא מעוכל רקמת חיבור באמצעות סינון דרך רשת סטרילי 500 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים להתיישב שפופרת 50 מ&quot;ל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant עם pipet העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend תאים הצפת לשטוף # 1 ולאפשר לתאים להסתפק 10-20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים ליישוב, לקחת aliquot קטן, ולהשתמש הפעם הזדמנות להעריך את האיכות ואת יכולת הקיום של התאים בתרחיף תחת מיקרוסקופ הפוכה. הכנה טובה יהיה אחוז גבוה (&gt; 80%) של מוט כמו תאים עם פסי פריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים התיישבו, להשליך את התאים supernatant ו resuspend בעדינות הצפת לשטוף # 2. בואו התאים להסתפק בטמפרטורת החדר, שאמור שוב לקחת 10-20 דקות, לבטל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך הכביסה שוב עם הצפת לשטוף # 3, התאים יהיה מוכן תרבות. </li></ol> חלק ד &#39;. תא Myocyte תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend תאים מדיה סרום 5%. לפני העברת תאים בתרבית רקמה צלחות, לשטוף את הצלחות עם SFM 1x. העברת התאים בצפיפות הרצויה דגירה של CO 2 רקמה תרבות חממה 3-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת 1x SFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים יכול להיות מתורבת עבור עד ארבעה ימים ומשומשים, כנדרש על ניסויים. </li></ol> חלק ו &#39;תוצאות נציג / תוצאה לא צריך להיות יותר מ 70% myocytes לב לחיות תחת מיקרוסקופ הפוכה כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה. <img src="/files/ftp_upload/1308/fig1.jpg" alt="דמות 1" /> טבלה 1: מתכון פתרון עבור L 1 10X Ca 2 + ללא הצפת KH: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מסה </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 68.96 גרם </td><td> 1180 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 3.58 גר &#39; </td><td> 48 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 59.58 גרם </td><td> 250 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> 2.85 גר &#39; </td><td> 12.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 3.08 גר &#39; </td><td> 12.5 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> טבלה 2: פתרון מתכון הצפת 1 L: מוסיפים 1.98 גרם גלוקוז ל -100 מ&quot;ל חיץ 10X KH ומביאים נפח סופי של 1 ל התאם osmolarity למצב הפיזיולוגיה ליד (~ 300) עם גלוקוז. מביאים pH 7.4 עם NaOH. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> - </td><td> מסה </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> מאגר 10X KH </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 1.98 גר &#39; </td><td> 11 mM </td></tr><tr><td> מביאים L 1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מביאים pH 7.4 עם NaOH </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> התאם osmolarity מצב פיזיולוגי קרוב (~ 300) עם גלוקוז. </td></tr></tbody></table> לוח 3: פתרון מתכון Buffers אנזימים <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מסה </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> Collagenase Type II </td><td> 25 מ&quot;ג </td><td> 0.05% (w / v) </td></tr><tr><td> פרוטאז XIV </td><td> 10 מ&quot;ג </td><td> 0.02% (w / v) </td></tr><tr><td> ^ נם </td><td> 0.025 גרם </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> קרניטין </td><td> 0.020 גרם </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> טאורין </td><td> 0.031 גרם </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצה גלוטמית </td><td> 0.020 גרם </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 0.1 מ &#39;CaCl 2 </td><td> 12.5 UL </td><td> 25 אממ </td></tr><tr><td> הצפת </td><td></td><td> מילוי 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 4: פתרון מתכון ^ נם 25X / טאורין / BSA (B / T / B) <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מסה </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> ^ נם </td><td> 0.076 גרם </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> טאורין </td><td> 0.094 גרם </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> BSA </td><td></td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> הצפת </td><td></td><td> מלא עד 6 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 5: פתרון מתכון B הצפת ו Buffers שטפי <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מאגר: </td><td> ב </td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td></tr><tr><td> הוסף: </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.5 מ &#39;CaCl 2 </td><td> 0.4 מ&quot;ל </td><td> 0.1 מ&quot;ל </td><td> .125 מ&quot;ל </td><td> 0.15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> הריכוז הסופי של CaCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1.25 mM </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 25X B / T / B </td><td> --- </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מאגר בנפח הסופי </td><td> 200 מ&quot;ל </td><td> 50 מ&quot;ל </td><td> 50 מ&quot;ל </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 6: פתרון מתכון מדיה culturing <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2X סרום ללא מדיה (SFM) </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> </td><td rowspan="2"></td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> (לאחר דילול) </td></tr><tr><td> קרניטין </td><td> 0.099 גרם </td><td> 10 מ&quot;מ (5 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> טאורין </td><td> 0.063 גרם </td><td> 10 מ&quot;מ (5 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> קריאטין </td><td> 0.075 גרם </td><td> 10 מ&quot;מ (5 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> אנטיביוטי / Antimycotic </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1% (0.5%) (v / v) </td></tr><tr><td> Media 199 </td><td> 45 מ&quot;ל </td><td> מילוי 50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X SFM </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 מ&quot;ל </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Media 199 </td><td></td><td> מילוי 50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1X מדיה סרום 5% </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> 2X SFM </td><td> 25 מ&quot;ל </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td><td> 5% (V / V) </td></tr><tr><td> Media 199 </td><td></td><td> מילוי 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CaVbeta+subunits%2C+and+lack+of+functional+reserve%2C+in+protein+kinase+A+modulation+of+cardiac+CaV1.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels.</a> Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).</li>
<li>SX, T. akahashi, Mittman, S., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+modulatory+effects+of+five+human+auxiliary+beta2+subunit+splice+variants+on+L-type+calcium+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating.</a> Biophys. , 84-845 (2003).</li>
</ol>

הצעד הקריטי הוא המהירות שבה את הלב מבודד הוא תלה על מערכת זלוף. אורך תקופת עיכול אנזימטי עשוי להיות קצת שונה עבור כל חולדה. ההתאמה תלוי כמה רך הלב הופך לאחר תקופת סדירה של מערכת העיכול. ההתאוששות באיטיות של Ca 2 + לאחר עיכול אנזים חיוני להשגת Ca 2 +-סובלנית תאים בריאים. עבור שפן ניסיונות, הפרוטוקול הוא זהה, למעט hyaluronidase משמש במקום פרוטאז XIV. בדרך כלל, אנו מוצאים את אחוז הראשונית של הת...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9666</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן של הפרין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>קרניטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9500</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גלוטמית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3630</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה</td><td>Cellgro</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>מדיום 199</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>BD Biosciences</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>בן מאט</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>משאבה כימית בעלת ספיקה משתנה</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>פלטת תרבית בעלת 6 בארות</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבות ראשונית של הלב myocytes למבוגרים עכברוש

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured העיקרי מכרסמים מבוגרים לתאי לב הם מערכת מודל חשוב למחקר קרדיווסקולרי. עם זאת, הקמתה של החזקה, myocytes קיימא מבוגר תרבותי יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, שער הגבלת צעד עבור חוקרים רבים. כאן אנו תיאר פרוטוקול להשיג תשואה גבוהה של מבוגר לב myocytes עכברוש שנותרו קיימא בתרבות במשך כמה ימים. הלב הוא מבודד perfused עם collagenase ו פרוטאז תחת Ca נמוך<sup&gt; 2 +</sup&gt; התנאים להתאושש myocytes יחיד. Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; עמיד תאים מתקבלים על ידי עליות בשלבים ב Ca תאיים<sup&gt; 2 +</sup&gt; ריכוז בשלושה שלבים לשטוף הבאים. תאים מסוננים, resuspended במדיום תרבות, מצופה על תלושי laminin מצופה. Myocytes Cultured שהושגו באמצעות פרוטוקול זה הם קיימא עבור עד ארבעה ימים ומתאימים רוב הניסויים כולל electrophysiology, ביוכימיה, ביולוגיה מולקולרית הדמיה.

במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

תאי לב ראשוניים מזוקנים של מכרסמים בתרבית מהווים מערכת מודל חשובה למחקר קרדיווסקולרי. עם זאת, ביסוס של תרביות חסונות וחיות...

הפרוצדורה מתחילה בהוצאת הלב מחולדה בוגרת ותלייתו על מערכת הפרפוזיה. תמיסות אנזימים מופעלות לפרפוזיה למשך כ-30 דקות, ולאחריהם הלב מוסר. הלב נקטע לחתיכות קטנות והעיכול האנזימטי נמשך בתוך כוס כימית קטנה.בסיום העיכול, התאים מופרדים לתליה של תאים בודדים באמצעות ערבול מכני ומסוננים אל תוך מבחנה סטרילית. תאי לב ראשוניים נשטפים שלוש פעמים במא Tampons בריכוזי סידן עולים, מושחים מחדש במצע תרבית ומונחים על צלחות תרבית רקמה מצופות למינציה. היי, אני שאהי מהמעבדה של הנרי קווא בתוך המחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה תאית באוניברסיטת קולומביה.היום נציג בפניכם פרוצדורה לבידוד ולתרבית של תאי לב של חולדה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור תעלות סידן בלב. אז בואו נתחיל.ביום שלפני הניתוח בחולדה, ודאו שכל התמיסות הוכנו, אך אל תוסיפו אנזימים בשלב זה. יש לסנן את באפרים a ו-B ואת באפר השטיפה כדי להבטיח סטריליות לפני האחסון בטמפרטורה של 4°C. יש להכין פלטות תרבית רקמה בעלות שישה בארות עם תמיסת למינציה (laminate solution) גם ביום שלפני, ולאחסנן בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO2.ביום הניתוח. הכין את כלי הניתוח על ידי חיטוי התפסן, המספריים והפינצטה ב-70% ethanol והשאר אותם להתייבש על נייר סופג. הכן מזרק של 1 mL המולא ב-0.5 mL של תמיסת heparin.כעת מומלץ לשטוף את מכשיר הפרפוזיה באמצעות 70% ethanol, כאשר מש

primary-culture-of-adult-rat-heart-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

בידוד קרדיומיוציטים של חולדות יילודים הוא הליך גוזל זמן ובלתי צפוי.  מחקר זה מתאר שיטות לשימור בהקפאה והפשרה של קרדיומיוציטים של חולדות יילודים המאפשרות שימוש יעיל יותר בתאים. ניתן להשתמש ב-NRCMs המופשרים לניסויים שונים ללא צורך בביצוע בידודים בכל פעם.

בידוד וCryopreservation של שריר לב עכברוש ילודים

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

כאן, אנו מציגים עבור בידוד של טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC) פרוטוקול. ניתן להשתמש ARVC מבודד לטיפוח לטווח הקצר ולטווח הארוך. בידוד של טיפוח של ARVC יכול לשחק תפקיד מפתח בפיתוח משטרי הטיפול החדש למחלות לב.

בידוד, טיפוח של עכברים בוגרים Cardiomyocytes

כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

למד שיטה לאיסולציה ותרבות מיוציטים בוגרים מלב עכברוש באמצעות קולגנאז ופרוטאז. הפרוטוקול מספק תאים ברי-קיימא למחקר פיזיולוגי לבבי וניסויים שונים.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

גלה סרטונים נוספים