תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.

ההליך מתחיל בכריתת הלב מחולדה בוגרת ותלייתו על מערכת הזלוף. מותר לתמיסות אנזימים לחלחל במשך כ -30 דקות ולאחר מכן מסירים את הלב. עיכול טחון ואנזימטי הותר להמשיך בכוס קטנה.

בסוף העיכול, התאים מפורקים לתרחיף תא בודד על ידי תסיסה מכנית ומסוננים לצינור סטרילי. תאי לב ראשוניים נשטפים שלוש פעמים במאגרים עם ריכוז סידן הולך וגובר, מושעים מחדש בתרבית, בינוניים ומצופים על כלי תרבית רקמות מצופים למינציה. היי, אני שאהי מהמעבדה של הנרי קווה במחלקה לפיזיולוגיה ופיזיקה סלולרית באוניברסיטת קולומביה.

היום נראה לכם נוהל לבידוד וטיפוח תאי לב אחרים של חולדות. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור תעלות סידן בלב. אז בואו נתחיל.

יום לפני ניתוח החולדות וודאו שכל הפתרונות מיוצרים, אך אל תוסיפו עדיין אנזימים. יש לסנן את המאגרים A B ואת מאגר הכביסה לסטריליות לפני האחסון בארבע מעלות צלזיוס. שש צלחות תרבית רקמות באר חייבות להיות מצופות בתמיסת למינציה גם יום קודם ולאחסן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2.

ביום הניתוח. הכן את מכשירי הניתוח על ידי חיטוי המספריים והמלקחיים עם 70% אתנול ותן להם להתייבש על מגבת נייר. מזרק מיליליטר אחד מלא בחצי מיליליטר תמיסת הפרין מוכן.

עכשיו זה תרגול טוב לשטוף את מנגנון הזלוף העובר דרך 70% אתנול עם המשאבה הפריסטלטית הפוכה. לאחר סיום, שטיפה באתנול, שטפו את המכשיר במים מזוקקים כפולים ולבסוף שטפו עם מאגר A.הזרימה דרכה נאספת בכוס ומונחת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כדי להכין את מנגנון השפע הנקי, מילא את צינור המזרק הימני ב-40 מיליליטר של מאגר A ואת צינור המזרק השמאלי ב-40 מיליליטר של מאגר B.ראש את צינור הזלוף לקצה הקטטר על ידי מתן אפשרות למאגר A לזרום דרך המכשיר.

מלאו מחדש את המאגר מזרק עד לרמה של 40 מיליליטר. ודא שאין בועות אוויר כלואות בצינור לאחר שלב זה, כבה כעת את המאגר, מזרק עם שסתום זין העצירה וחזור על התהליך כך שצינור השפע מוכן כעת עם מאגר B.מנגנון השפע מוכן סוף סוף ונשאר עם המאגר. B שסתום זין עצור פתוח, אך הזרימה נעצרת.

בעזרת הרגולטור בקו העירוי, השליכו את זרימת החיץ בכוס האיסוף. הדבר האחרון שצריך לעשות לפני הניתוח הוא להוסיף את האנזימים הנדרשים לתמיסת המלאי שלך ולאחר מכן לסנן את תמיסת האנזים בדיוק כפי שסוננו התמיסות האחרות יום קודם. לאחר הסינון, ניתן להשאיר תמיסה זו בטמפרטורת החדר בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי.

המתת חסד של החולדה עם איזו פלואור בתא גזים. לחטא את אזור החתך בבית החזה עם 70% אתנול. פתח את החזה בעזרת מספריים וחשוף את הלב.

הזריק לחדר השמאלי תמיסת הפרין של 0.5 מיליליטר. הסר את הלב עם חלק גדול מאבי העורקים שלם. הכנס מיד את הקטטר לאבי העורקים.

לב חולדה טיפוסי אמור להניב חלק גבוה של מיוציטים בריאים בצורת מוט ומעט תאים מעוגלים מתים. אם מקפידים על ההליך הבא כראוי, כדי להתחיל להדק את אבי העורקים לקטטר. אין לדחוף את קצה הקטטר רחוק מדי לתוך הלב כדי להבטיח זלוף טוב של הלב דרך העורק הכלילי.

לאחר ההידוק, קשרו את אבי העורקים לקטטר בעזרת התפר. לאחר מכן, פתח את ווסת קו העירוי כדי לאפשר קצב טפטוף מהיר ולאפשר לדבורת החיץ לשטוף את הלב במהלך שטיפת דבורת החיץ. השתמש במספריים הקטנים והמלקחיים כדי להסיר את הפרוזדורים וכל רקמת שומן או ריאה הנצמדת ללב.

לאחר סיום מאגר B, העבר את הזרימה למאגר זמן מה. מאגר A מותר לזרום במשך חמש דקות. מחממים את תמיסת האנזים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

כאשר מאגר A מתרוקן מהמזרק אך עדיין קיים בעומס הצינור, 50 מיליליטר מתמיסת האנזים במזרק A של מנגנון השפע. כעת יש צורך להשליך את כל הזרימה מכוס האיסוף באמבט המים עד שתמיסת האנזים חודרת ללב. ברגע שתמיסת האנזים מחפשת את הלב, הפעל את המשאבה הפריסטלטית, המוגדרת להעביר את תמיסת האנזים מכוס האיסוף למזרק המחודש.

ת: אפשר לתמיסת האנזים לזרום דרך הלב למשך 10 דקות. כאשר הלב מתעכל, הוא מתחיל להיראות נפוח ב -37.5 מיקרוליטר של 0.1 סידן כלורי מולרי לתמיסת האנזים במזרק A כדי לתת ריכוז יעיל של 0.1 מילי-מולרי סידן. זוהי הראשונה מבין כמה תוספות סידן כלורי המשמשות להעלאת הריכוז לאחר 10 דקות, להגדלת ריכוז הסידן ל-0.2 מילי-מולרי על ידי הוספת 50 מיקרוליטר נוספים של 0.1 סידן כלורי מולרי למזרק A ולתת לשפע להמשיך למשך 10 דקות נוספות.

לאחר שחלפו 10 דקות, חתכו את החדרים והעבירו את הלב לכוס סטרילית קטנה המכילה 20 מיליליטר תמיסת אנזים בכוס. הגדילו את ריכוז הסידן ל-0.4 מילי-מולרי על ידי הוספת 40 מיקרוליטרים נוספים של 0.1 מולארי סידן כלורי טחנו בעדינות את הלב ל-10 חתיכות או יותר בעזרת מספריים סטריליות קטנות. כעת דגרו את הכוס ב-37 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין.

לאחר חמש דקות של דגירה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של 0.1 סידן כלורי מולארי כדי לתת ריכוז יעיל של 0.6 מילי-מולרי סידן וחזרו בעדינות על חלקי הלב עם פיפטת העברה מפלסטיק שלוש עד חמש פעמים לאחר הדגירה למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסיפו 40 מיקרוליטר של 0.1 סידן כלורי מולארי וחזרו בעדינות כמו קודם. השתמש במסנן סטרילי של 500 מיקרומטר כדי להפריד את המיוציטים הבודדים המעוכלים מרקמת חיבור לא מעוכלת. אפשר לתאים להתיישב בשפופרת של 50 מיליליטר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר השליכו את הסופרנטנט עם העברה VI השעו בעדינות את התאים במאגר כביסה מספר אחת, ואפשרו לתאים להתיישב במשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר בזמן שהתאים מתייצבים.

קחו מנה קטנה והשתמשו בזמן זה כהזדמנות להעריך את האיכות והכדאיות של התאים בתרחיף תחת מיקרוסקופ הפוך. לתכשיר טוב יהיה שיעור גבוה של תאים דמויי מוט עם פסים חדים. לאחר שהתאים התייצבו, השליכו את החרטום והשעו בעדינות את התאים במאגר הכביסה.

שנית, תנו לתאים להתיישב בטמפרטורת החדר, מה שאמור לקחת שוב 10 עד 20 דקות והשליכו את הסופרנטנט. יש להשעות בעדינות את התאים ב-5% סרום לפני העברת התאים לצלחות תרבית רקמות. שטפו את הצלחות עם XSFM אחד.

מעבירים את התאים בצפיפות הרצויה ודוגרים באינקובטור תרבית רקמת CO2. במשך שלוש עד חמש שעות, העבר את המדיה ל-XSFM אחד ניתן לתרבית תאי XSFM עד ארבעה ימים ולהשתמש בהם כנדרש לניסויים. אמורים להיות יותר מ-70% מיוציטים חיים בלב תחת מיקרוסקופ הפוך כאשר הפרוטוקול נעשה כהלכה.

אלה מיוציטים מבודדים שהועברו עם YFP REM לאחר תרבית במשך 48 שעות. תאים באיכות זו מתורבתים בדרך כלל מהליך זה. אנחנו רק נראה לך איך לבודד והתרבית היא תאים חמים.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות מהיר ונקי ככל האפשר. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.