אפרוח אובו לשעבר תרבות אובו לשעבר CAM Assay: איך זה באמת עובד

היי, אני סוזן פאה. אני מהמכון לכימיה פיזיולוגית, המחלקה לאנדוקרינולוגיה ביוכימית באוניברסיטת בורג אסן בגרמניה. היי, אני דניאל זה בסיאן דול.

אני מאותו מוסד כמו סוזן. היי, אני מאן מהמכון לאנטומיה של המחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת בורג. אנו הולכים להראות לך כיצד תרבות CH X וחיבור ממברנה משותפת באמת עובדים.

אז בואו נלך למעבדה. ברוב המחקרים הניסויים האחרונים, המצלמה שהיא ממברנת צ'יקו, נחשפה על ידי חיתוך חלון דרך קליפת הביצה, וניסויים נערכו בביצה, וכתוצאה מכך הוגבלו מגבלות משמעותיות בנגישות ה-CAM ובאפשרויות התצפית ותיעוד הצילום של האפקטים. תרביות X ביציות של עוברי אפרוח מקלות משמעותית על הנגישות של הפקה ועובר הגוזל.

אנא ראה את הלב הפועם המאפשר תיעוד קל in vivo של השפעות ומניפולציה ניסיונית של העובר. במאמר הווידיאו שלנו, אנו הולכים לספק הדגמה שלב אחר שלב של היישום המוצלח של תרבית X ovo למספר רב של שאלות מדעיות. הביצים מודגרות בחממה עם מגש נע.

כאן תוכלו לראות את גוף החימום ואת מוביל המגש מסובבים את הביצים 12 פעמים ביום ברציפות. הלחות נשמרת על 60% על ידי הוספת מים למיכלי פלסטיק בתחתית החממה, וטמפרטורת הדגירה נקבעת על 37.5 מעלות צלזיוס לפני תחילת הדגירה. לכלוך, נוצות וצואה מוסרים בזהירות מקליפות הביצים, מנגבים מכנית את הביצים באתנול או בחומר חיטוי, אולם מפחיתים משמעותית את שיעורי ההישרדות של העוברים.

הביצים ממוקמות אופקית על המגש הנע של החממה. אנא הקפידו לשמור על מרחק מספיק בין הביצים הבודדות כדי לאפשר סיבוב חופשי. לאחר הדגירה במשך 72 שעות מוציאים את הביצים מהחממה והצד העליון של הביצים בו שוכן העובר מסומן בעיפרון.

מכיוון שהעובר מתנגד לסיבוב במידה מסוימת ונשאר ממוקם כאן לתחושה טובה יותר, אין להשתמש בכפפות לפיצוח הביצים, אך יש לחטא את הידיים באתנול 70%. הביצה מוחזקת אופקית עם סימן עיפרון מלמעלה וסדוק בקצה מוט ערבוב מגנטי משולש לבקרת כוח מקסימלית במהלך הליכי הפיצוח, המרפקים לא צריכים לנוח על הספסל. חשוב שקליפת הביצה כמו גם קרום הביצה ייפתחו במהלך פיצוח דליפת חלבון ביצה היא סימן בטוח לכך שקרום הביצה מחורר.

הביצה נשמרת קרוב לתחתית צלחת הפטריוט. כדי למנוע דליפה נוספת של חלבון ביצה במהלך הליך הפתיחה הראשוני הזה, חשוב שהחלבון בתחתית צלחת הפטריוט עדיין יהיה מחובר לשאר בתוך הביצה. מכיוון שהדבר גורם לוואקום בתוך הביצה המחזיק את החלמון במקומו על ידי הפעלת לחץ עדין על המרידיאן העובר דרך הסדק ועל קו המשווה של הביצה על ידי האגודל והאצבע האמצעית, ניתן לווסת את הוואקום ואת שחול תכולת הביצה.

לאחר מכן ניתן להעביר את תכולת הביצה לצלחת הפטרי כשהחלמון לא פגום. אם מרימים את הביצה בעדינות ושני חצאי הקליפה מופרדים בזהירות, תרביות האקס אובו מונחות על מגש, מוחזרות לאינקובטור ונשמרות בטמפרטורה של 37.5 עד 38.2 מעלות צלזיוס ו-70% לחות. אין צורך באספקת פחמן דו חמצני או חמצן.

אם משתמשים בכלים פטריוטיים מיוחדים עם מרווחים בין מכסה לצלחת וחממות עם רשת אוורור, יש לשמור על רשת האוורור פתוחה באמצע הדרך. מסנן חיטוי ניירות משמשים כחומר תומך לחומרים נוזליים המופעלים על המצלמה מכיוון שנראה שהם גורמים לגירוי הקטן ביותר של המצלמה. אתר היישום צריך להיות באמצע הדרך בין העובר לגבול המצלמה, שכן אחרת העובר מעכב את התצפית המיקרוסקופית של ההשפעות באור המועבר.

יש למרוח את הנוזל כאן אטרופין מיד לאחר הנחת המסנן על המצלמה כדי למנוע התייבשות. יש למרוח מחדש מינונים נוספים או בופר מדי יום. כאשר הפיקה מפותחת במלואה, ניתן ליישם עד שש דגימות שונות וניתן להשוות את ההשפעות על טבעות פקה בודדות חתוכות מקצה פיפטה של מיליליטר אחד יש לחתוך דק ככל האפשר כדי למזער את המשקל ולמנוע כניסה של הפקה.

לאחר מכן מורחים את הטבעת על הפיקה והתאים מוזרמים לתוך הטבעת. מזרק המילטון מיקרוליטר נשטף מספר פעמים עם אתנול 70% ולבסוף עם מלח פוספט סטרילי או PBS, מזרק המיקרו מלא בתרחיף תאים מוכן בזהירות אך חודרים במהירות למצלמה ולשכבות העיניים עם מחט המזרק ומזריקים ברציפות את מתלה התאים. המחט צריכה להישאר כמה שניות בעין כדי למנוע אובדן של מתלה התאים המוזרק על ידי בדיקת דליפה X Ovo.

תרביות ביצים שהודגרו במשך שלושה ימים משמשות כתורמות ניצני גפיים. העובר מנותח מכלי החלמון המחוברים. על ידי חיתוך מעגל, העובר מועבר לצלחת פטרי מלאה ב-PBS סטרילי קר באמצעות כף ניקוז קטנה ונשטף על ידי תסיסה.

לאחר מכן העובר מועבר לצלחת פטרי טרייה ממולאת ב-PBS סטרילי ומשוחרר מהממברנות שמסביב, קורע אותם בזהירות בעזרת מלקחיים עדינים. ניצני הגפיים מנותקים על ידי מלקחיים קרוב ככל האפשר לגוף, נתפסים ומועברים למצלמה של תרנגולת מארחת בת שמונה עד עשרה ימים. באתר היישום הרצוי, הפקה עוברת טראומה סלקטיבית על ידי גירוד עדין עם נתח אחד של המלקחיים.

לאחר מכן תופסים את השתל ומניחים אותו על המצלמה עם הנתח השני של המלקחיים. נקבת העכבר מקובעת על לוח. דופן הבטן מרטיבה ב-70% אתנול שנחתך לאורך קו האמצע ודשי העור מקובעים לרוחב על ידי סיכות.

הרחם מוסר מהבטן, מנותק ומועבר לכוס. עם PBS קר. הממברנות העובריות מוסרות בזהירות על ידי שימוש במלקחיים למטרות הדגמה.

עובר עכבר בן 16 יום מוצג כאן לנראות טובה יותר של ניצני הגפיים. תוצאות השתלה אופטימליות מתקבלות בלבד. עם זאת, אם משתמשים בניצני גפיים מעוברים בני 10 עד 13 יום, ניצני הגפיים נחתכים או משתמשים במלקחיים עדינים קרוב ככל האפשר לגוף.

באתר היישום הרצוי, ה-CAM עובר טראומה סלקטיבית על ידי גירוד עדין עם מלקחיים. לאחר מכן תופסים את ניצני הגפיים ומועברים ל-CAM של תרנגולת מארחת בת שמונה עד עשרה ימים. השתל מונח פעם או פעמיים בצד של המצלמה שבו לא נועדה השתלה סופית להסיר עודפי PBS.

השתלים ממוקמים באופן אידיאלי על המצלמה ליד התפצלות Y של גידול בכלי דם. ביופסיות נחתכות לחתיכות של מילימטר עד שניים מעוקב על ידי אזמלים סטריליים. לקיחת חומר מפני השטח של הביופסיה מגדילה את הסיכון לזיהום בשריר או ברקמת חיבור.

באתר היישום הרצוי, ה-CAM עובר טראומה סלקטיבית על ידי גירוד עדין. חתיכה מליבת דגימת הביופסיה מושתלת על CAM של תרנגולת מארחת בת שמונה עד עשרה ימים. השתלים ממוקמים באופן אידיאלי על המצלמה ליד התפצלות Y של כלי דם.

לאחר מכן השתל מועבר ל-CAM עם PBS מינימלי מחובר. ניתן להפעיל לחץ קל כדי לתמרן את השתל לתוך שקע כתוצאה מכך של הפקה. עובר הצ'יק המארח נהרג על ידי עריפת ראש.

ה-CAM עם השתל המצורף מוסר על ידי חתך מעגלי ומועבר לצלחת פטרי מלאה ב-PBS. CAM מוגזם נחתך מהשתל למעט אתר ההתקשרות הקודם. שוב באתר היישום הרצוי.

המצלמה של עובר אפרוח מארח חדש עוברת טראומה סלקטיבית על ידי גירוד עדין והשתל מועבר למצלמה של המארח השני עם PBS מינימלי מחובר. זה עתה הדגמנו איך CH X או תרבות באמת עובדים. הראיתי לכם את היתרונות בהשוואה לניסויים של אורוול ונתתי לכם כמה דוגמאות ליישום שלו.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.