ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

מאמר זה מתאר GFP מבוססי פלואורסצנציה

בפרוטוקול וידאו זה מודגמת שיטה למדידת היעילות והדיוק של תיקון בלמים כפולים של DNA על ידי NHEJ או HR בקו תאים של יונקים. ההליך מתחיל ביצירת קו תאים המכיל עותק יחיד משולב כרומוזומלית של קלטת NHEJ או HR reporter. תאי דיווח אלה עוברים טרנספטציה עם תערובת של I SCE, אחד המבטא פלסמיד ואדום DS ופלסמיד אחד.

אני מבין. אנדונוקלאז אחד מייצר שבירת גדיל כפול במבנה המדווח ו-DS RED משמש כבקרת טרנספקציה. לאחר מכן, אחוז התאים החיוביים ל-GFP ו-DS החיוביים ל-DS מנותח על ידי פקס על מנת לכמת את היעילות של NHEJ או HR אם רוצים.

נאמנות התיקון מנותחת על ידי הצלת מוצרי המדווח באי קולי ורצף מוצרי התיקון. באופן זה, היעילות והנאמנות של שבירת גדיל כפול או תיקון DSB בקו תאים נתון נקבעים על סמך כימות זרימה ציטומטרי של אירועי תיקון ורצף תוצרי התיקון. לשיטה זו יתרונות רבים על פני השיטות הקיימות לניתוח תיקון בלמים כפולים.

קודם כל, שיטה זו מבדילה באופן ספציפי בין רקומבינציה הומולוגית לבין לא הומולוגית והצטרפות. אז השיטה היא כמותית ביותר, ומאפשרת ניתוח של מיליוני תאים על ידי זרימה ציטומטרית ואז השיטה אינה דורשת אריזה נרחבת של תאים לאחר השלמת התיקון לבחירת cls עמידים לאנטיביוטיקה. ולבסוף, ניתן לעקוב אחר השלמת התיקון בזמן אמת על ידי התבוננות במראה של תאים ירוקים.

ושיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התיקון כגון מדידת דופק ויעילות תיקון HEGA בסוגי תאים מוטנטיים של וירוסים או בעקבות טיפולים תרופתיים. בדוק את תיקון A בשלבים שונים של מחזור התא ומדידת קצב התיקון כל כך כללי. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שחשוב להשיג יעילות טרנספקציה טובה.

בהליך זה. שתי קלטות עיתונאים משמשות לבדיקה לתיקון שברי DNA דו-גדיליים. קלטת אחת משמשת לבחינת חיבור קצה לא הומולוגי או תיקון N-H-E-J-D-N-A.

השני משמש להסתכלות על רקומבינציה הומולוגית או תיקון DNA HR הקצה הלא הומולוגי. קלטת הכתבים המצטרפת מכילה גן GFP עם אינטרון מהונדס של שלושה קילו-בסיס מהגן PEM אחד או GFP PEM. בקיצור, המבוא P one מכיל אקסון אדנו-ויראלי המוקף ברצפי זיהוי עבור הינדי שלוש ו-I SCE אנדונוקלאז אחד לאינדוקציה של הפסקות דו-גדיליות.

אתרי I SCE אחד הם אוריינטציה הפוכה I SCE אחד יש רצף זיהוי לא פלינדרומי, ולכן שני אתרים הפוכים מייצרים לא תואמים. הדנ"א מסתיים בחוסר תואם. קצוות ה-DNA מחקים בצורה הטובה ביותר את ה-DSS הטבעי.

קלטת NAEJ לא מסודרת היא GFP שלילית מכיוון שהאקסון האדנוויראלי משבש את ה-G-F-P-O-R-F. עם השראת שברי DNA דו-גדיליים על ידי ISEE אחד, האקסון האדנוויראלי מוסר ו-NHEJ משחזר את תפקוד הגן GFP. קלטת הדיווח הרקומבינציה ההומולוגית מבוססת גם על מבנה GFP PEM אחד בקלטת HR.

האקסון הראשון של ה-G FP PEM מכיל מחיקה של 22 זוגות בסיסים בשילוב עם הכנסת שלושה אתרי הגבלה. I SCE אחד הינדי שלוש I SCE E אחד. המחיקה מבטיחה שלא ניתן יהיה להקים מחדש את GFP על ידי אירוע NHEJ גם כאן.

אתרי I SCE one נמצאים בכיוון הפוך. אז העיכול I SCE אחד משאיר קצוות לא תואמים. העותק הראשון של GFP PMM אחד ואחריו מקדם פחות TG, פחות אקסון ראשון ומבוא ראשון של GFP M1. המבנה השלם הוא GFP שלילי עם השראת שבירת גדיל כפול על ידי I sce E עיכול אחד.

גן ה-GFP הפונקציונלי נבנה מחדש על ידי אירוע המרת גנים בין שני העותקים המוטנטיים של ה-GFP PMM הראשון, אקסון אחד, סוגים אחרים של תיקון DSB, כגון חציית כריעה חד-גדילית. ו-NHEJ לא יבנה מחדש את הגן GFP. מכיוון שהעותק השני של הגן GFP חסר.

קודון ה-TG הראשון ורזולוציית האקסון השנייה על ידי הצלבה או כריעה חד-גדילית אינם משחזרים את פעילות ה-GFP. עיצוב זה מאפשר אפוא זיהוי בלעדי של רזולוציה על ידי המרת גנים, שהוא מסלול ה-HR השולט בתאי יונקים. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בערכה נטולת האנדו מבית Kyogen כדי להכין מלאי איכותי של פלסמיד מדווח NHEJ או HR ליניאריזציה של 10 מיקרוגרם של הפלסמיד ולטהר את ה-DNA מתמיסת העיכול.

עיין בפרוטוקול הכתוב הנלווה לפרטים על הכנת פלסמיד. כהכנה לטרנספקציה. ודא שפיברובלסטים אנושיים רגילים נשמרים בתנאי הגידול הטובים ביותר.

אם מתחילים מבקבוקון קפוא, פצלו את התאים פעמיים לפני הטרנספקציה. אם מתחילים מלוח של תאי מפגש מפצלים את התאים ברגע שגדלים התאים למפגש של 70 עד 80%. זה לוקח בערך יומיים עבור חמישה כפול 10 עד חמישית תאים מצופים בצלחת של 100 מילימטר.

ליעילות הטרנספקציה הטובה ביותר, הביאו את התאים לצמיחה לוגריתמית. תרבית גידול פעיל מכילה תאים בשלב M הנראים כתאים מעוגלים המחוברים לפני השטח לצורך קציר טרנספקציה בערך פי שניים מתוך 10 מתוך ששת התאים משתי צלחות של 100 מילימטר. זה קריטי לא להגזים בטריפסין התאים להפסיק את הטריפסין ברגע ש-80% מהתאים התנתקו מהצלחת.

השעו מחדש את התאים בתמיסת NHDF. מכיוון שהתאים רגישים לתמיסת NHDF, צמצמו את זמן הדגירה וערבבו את התאים בעדינות. לאחר מכן, השתמש באפקטור הגרעין של אמקסה כדי להעביר את התאים עם 0.5 מיקרוגרם של מבנה מדווח ליניארי עבור פיברובלסטים אנושיים רגילים.

תנאי טרנספקציה אלה מביאים לשילוב של עותק יחיד של מבנה מדווח במשך רוב האינטגרציה 24 שעות לאחר הטרנספקציה במיליגרם אחד למיליליטר גנטי או G ארבע 18. על מנת לבחור את התאים עם מבני מדווח משולבים כרומוזומלית, המשך בבחירה במשך שבעה עד 10 ימים, ולאחר מכן בחר מושבות עמידות בודדות G 4 1 8 או אסוף את השיבוטים העמידים. הרחב את התרבות לכחמש צלחות של 100 מילימטר.

הקפיאו שלוש צלחות לשימוש עתידי, והרחיבו את שתי הלוחות הנותרים לחמש פעמים 10 לתאים החמישיים לכל צלחת של 100 מילימטר. עשר לוחות מאה מילימטר מספיקים בדרך כלל לחמישה טרנספקטים. יומיים לאחר הציפוי כאשר התאים המכילים את מבנה המדווח הגיעו למפגש של 70 עד 80% עם תערובת של חמישה מיקרוגרם של פלסמיד מבטא אחד ו-0.1 מיקרוגרם של פלסמיד אדום DS.

כבקרת יעילות טרנספקציה, השתמש באפקטור הגרעין AM maxon כדי להעביר בערך פי שניים 10 מתוך ששת התאים מתרבית הגדלה באופן לוגריתמי. מכיוון שיעילות DSP נמדדת כיחס בין GFP חיובי לתאים אדומים חיוביים DS, וריאציות בתערובת של ISCE one ו-DS אדום פלסמיד עשויות להשפיע על התוצאות. איכות הפלסמיד עשויה גם להשפיע על התוצאות על ידי שינוי יעילות הטרנספקציה.

לכן, כדי להשיג מדידות עקביות, חשוב להשתמש באותה תערובת פלסמיד בניסוי אחד במקביל, הכינו שלושה בקרות כיול לעובדות עבור כל בקרה. טרנספקט בערך פעמיים 10 מתוך ששת התאים. שלושת הבקרות הם חמישה מיקרוגרם של EGFP המבטא פלסמיד, חמישה מיקרוגרם של DS, פלסמיד אדום וחמישה מיקרוגרם.

פלסמיד בקרה שאינו מבטא חלבון פלואורסצנטי. שלושה ימים לאחר הטרנספקציה, ודא את יעילות הטרנספקציה והביטוי של חלבונים אדומים GFP ו-DS על ידי מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי עם מסננים לזיהוי GFP ו-DS. אדום מגדל את התאים ליום נוסף לפני ניתוח פקס, ארבעה ימים לאחר קצירת הטרנספקציה I SCE אחד התאים הטרנספטנטיים ותאי הביקורת. בשלב זה, קריטי לקצור את כל התאים ולקבל תאים בעלי צורה עגולה.

כדי להשיג זאת, השתמש בזמן טריפסין ארוך יותר או בריכוז גבוה יותר של טריפסין. בדוק את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ש-99% מהתאים מנותקים מהצלחת ובעלי צורה עגולה. השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר PBS והעבירו לצינורות פקס.

שמור את התאים על קרח והגן עליהם מפני אור בזמן שאפשר לאחסן את התאים על קרח לכמה שעות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, נתח את התאים מיד לאחר הקטיף. לאחר מכן, כייל את העובדות עם TFP DS RED והבקרות השליליות.

התאם את פיצוי המתח והצבע על מנת לכלול את כל תאי הפלורסנט בניתוח. זכור כי עוצמת הפלואורסצנט של דגימות הניסוי נמוכה מזו של הבקרות. לאחר כיול העובדות עם הבקרות, נתח את התאים הטרנספטקטיים של I SCE אחד סופרים לפחות 20,000 תאים לכל טיפול כדי למנוע הפרעה פוטנציאלית בין GFP ל-ds.

פלואורסצנציה אדומה שומרת על אחוז התאים החיוביים GFP או DS החיוביים מתחת ל-25%אם האחוז גבוה יותר, הפחיתו את כמות ה-DS RED או I sce E פלסמיד אחד. אחוז התאים החיוביים ל-GFP תואם את היעילות של תיקון D-N-A-D-S-P ואחוז התאים החיוביים האדומים של DS מצביע על יעילות הטרנספקציה. חשב את היעילות היחסית של תיקון D-N-A-D-S-P כיחס בין תאים חיוביים GFP לתאים חיוביים אדומים DS.

על מנת לקבוע את הדיוק של הצווים המתוקנים, הצל את מבני המדווח על ידי עיכול DNA גנומי עם מעגל אנזים eco R one והפיכתו לתאי אי קולי מוכשרים. הצלה זו אפשרית מכיוון שהמבנים המקוריים מכילים מקור חיידקי של שכפול המנותח על ידי הגבלה, עיכול וריצוף. אלו הן עובדות אופייניות, תוצאות של חתכי בקרה וניסויי NHEJ ו-HR.

עוצמת הפלואורסצנט ומספר התאים הפלואורסצנטיים נמוכים יותר בתאי I SCE 1 שעברו טרנספטציה בהשוואה לביקורת. ההבדל באות הקרינה נובע מההבדל במספר ההעתקים של מבני GFP ו-DS RED בתאים אלה. כל תא בניסוי מכיל עותק אחד של מבנה המדווח המשולב.

לפיכך, אירועי תיקון מוצלחים מרכיבים מחדש את הגן GFP בשבריר מהתאים. היעילות של NHEJ ו-HR מחושבת כיחס בין GFP חיובי לתאים אדומים חיוביים DS. NHEA הוא תהליך יעיל יותר מ-HR בתאים אנושיים, בפיברובלסטים אנושיים, יעילות ה-NHEJ היא בדרך כלל 0.6 עד 1.3 ויעילות HR היא 0.05 עד 0.3.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תיקון ה-DNA לחקור את התפקידים של גורמים שונים ב-HEG ו-HR ולחקור את הקינטיקה והתקנות של NHEG ו-HR בתאי יונקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד למדוד את היעילות והדיוק של HR ו-GJ בתאי יונקים באמצעות מבחן פלואורסצנטי.