הזרקת dsRNA לתוך יתושים א נקבה aegypti
July 4th, 2007
גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה ג'יימס להזריק dsRNA לנקבה א aegypti יתושים, אשר בנמל וירוס דנגה. הטכניקה לכיול מחטי הזרקה, מניפולציה של ההתקנה הזרקה, והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.
היי, שמי בריאן לונה. אני כאן היום באוניברסיטת קליפורניה אירווין ממעבדת ג'יימס. היום אדבר איתכם על הזרקות RNA דו-שכבתיות ליתושים נקבות גיפ בוגרות משנות השמונים.
אז ההליך מורכב משימוש בהתקנה ידנית והזרקת הנקבות הבוגרות לתוך בית החזה. גדיל כפול. ניתן להשתמש בהזרקות RNA כדי להפיל גנים רבים במעבדה שלנו. באופן ספציפי, אנו משתמשים בו כדי להפיל גנים הקשורים לביוסינתזה של סטרואידים.
עכשיו אני הולך לדבר איתך על הכנת המחטים. עכשיו אני מכין את המחטים באמצעות צינורות נימי זכוכית סיליקט סייח. כעת, הנימים הללו נמשכים על מושך הזרקת המיקרו סאטר שלנו, והשלב הבא לאחר משיכת המחטים הוא כיול באמצעות מים.
השלב הבא בתהליך זה הוא כיול המחטים. אז ברגע שהמחטים נשלפו מה-Sutter Polar, הן יוצאות ככה, כך שהמוצר הסופי יסומן בבירור בטוש שארפי שחור. כעת, על מנת לתקן את הסימונים, כל מחט נטענת בכמות מוגדרת של נפח על ידי מיקרו פיפטר.
כיול המחטים חשוב, אחרת לא נדע את הריכוז או הנפח המדויק שאנו מזריקים לכל יתוש. לצורך הדגמה זו, העמסתי את הצינורות הנימים בצבע צבעי מאכל. במקום מתלה RNA כפול טיפוסי, ניתן להעמיס את ה-RNA הכפול, ה-RNA הכפול, לתוך המחטים על ידי החדרת המחטים לתמיסה והפעולה הנימים תיפול, תפיל את הנוזל.
עכשיו אני הולך לדבר איתך על מערך ההזרקה שלנו. הוא מורכב ממזרק של 50 מיליליטר, מכלול זין מלאי המחובר לצינור גומי ומתאם נימי זכוכית. ניתן לכוונן את מכלול הזין לשלושה מצבים נפרדים.
עמדה ראשונה זו היא תנוחת המנוחה. המיקום השני הוא במצב הזרקה, והעמדה השלישית משמשת למילוי המזרק באוויר, ללחץ לבניית הלחץ להזרקה. אז במהלך ההזרקה, היתושים מוחזקים על קרח כדי להשאיר אותם ישנים.
לאחר ההזרקה, הדבר הטוב ביותר לעשות הוא להחזיר אותם לטמפרטורת החדר כדי להגדיל את השרידות. אז זה נעשה רק באמצעות רגילה כמו זו ופיפטה של אלף מיקרוליטר. קצה הפיפטה נחתך ואז מוכנס לכוס, והמוצר הסופי נראה כך.
על גבי הספל אנו מניחים רשת רשת וכיסוי מכסה. ועכשיו זה רק מאפשר לאוויר לנוע פנימה והחוצה מהכוסות ולמנוע מכמה יתושים לעוף משם. היתושים לא יעופו מקצה הפיפטה שהוכנס לכוס.
עכשיו אנחנו כמעט מוכנים לזריקות. עם ה-RNA הכפול. השלב הבא הוא להרדים את היתושים באמצעות CO2 ולהניח את היתושים על קרח כדי להשאיר אותם ישנים.
עכשיו אנחנו מוכנים למעשה, ליתושים. השלב הראשון בתהליך זה הוא מילוי, מילוי המזרק באוויר. לאחר שזה נעשה, השסתום מותאם למצב מנוחה.
אז הנה אני עומד להחדיר את המחט לבית החזה של היתוש. השלב הבא בתהליך זה הוא סיבוב השסתום למצב ההזרקה והזרקת כמות הנפח הרצויה. ולאחר השלמת ההזרקה, החזירו את היתוש לכוס.
זה עתה סיימתי להראות לכם את הטכניקה להזרקת גדיל כפול של RNA ל-gti של שנות השמונים למבוגרים. ניתן לקבוע את הפלת היתושים על ידי שימוש ב-R-T-P-C-R או R-T-P-C-R כמותית. אני אשתמש ב-R-T-P-C-R כדי לקבוע את יעילות הנוקדאון בנקודת זמן מסוימת של ה-g of Interest שלי.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול הוידאו הזה מדגים שיטה להזרקת RNA דו-גדילי (dsRNA) לתוך יתושים נקבות של Aedes aegypti, שהם וקטורים לנגיף הדנגה. הטכניקה חיונית לחקר פונקציות גנים הקשורות לעמידות נגד פתוגנים וקטורים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה של וקטורים
רקע
- גישות גנטיות הפוכות עוזרות לזהות גנים המעורבים בעמידות לפתוגנים.
- יתושים של Aedes aegypti הם וקטורים משמעותיים למחלות כמו דנגה.
- הזרקות של RNA דו-גדילי יכולות להשבית גנים ספציפיים.
- שיטה זו מאפשרת מניפולציה ממוקדת של גנים ביתושים בוגרים.
מטרת המחקר
- להמחיש טכניקה להזרקת dsRNA ליתושים.
- לחקור פונקציות גנים הקשורות לביוסינתזה של סטרואידים.
- לשפר את ההבנה של עמידות היתושים לפתוגנים.
שיטות ששימשו
- התקנה ידנית להזרקת dsRNA.
- הזרקת dsRNA לתוך בית החזה של יתושים נקבות בוגרות.
- כיול מחטי ההזרקה לדיוק.
- מניפולציה של מערך ההזרקה להעברה יעילה.
תוצאות עיקריות
- הזרקה מוצלחת של dsRNA ליתושים של Aedes aegypti.
- השתקה של גנים הקשורים לביוסינתזה של סטרואידים שנצפתה.
- הוכחת היתכנות השיטה להזרקה.
- השלכות פוטנציאליות לאסטרטגיות בקרת וקטורים.
מסקנות
- שיטת ההזרקה של dsRNA יעילה למניפולציה של גנים ביתושים.
- טכניקה זו יכולה לסייע בהבנת הביולוגיה של היתושים ועמידות למחלות.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על שיטה זו כדי לחקור גנים נוספים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional gene knockdown in adult female Aedes aegypti mosquitoes, supporting target validation in vector biology. By allowing precise dsRNA delivery to the thorax, it facilitates mechanistic de-risking of genes involved in pathogen resistance and steroid biosynthesis. The method provides a scalable approach for phenotypic screening in disease-relevant insect models, informing early discovery decisions for vector control strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by knocking down genes related to steroid biosynthesis and pathogen resistance.
- Operational Value: Provides a reproducible method for functional target validation in adult mosquito models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay standardization through calibrated needle injection and quantitative readouts via RT-PCR.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound or genetic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system for studying vector-pathogen interactions and resistance mechanisms.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by linking gene knockdown to phenotypic outcomes in pathogen susceptibility.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic validation, enabling iterative refinement of vector control targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through targeted gene knockdown in adult mosquitoes.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized injection volumes and measurable knockdown efficiency.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., gene expression via RT-PCR) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by modeling gene function in a disease-relevant insect vector.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative gene screening across multiple targets in vector biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through measurable gene knockdown and phenotypic assessment.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of dsRNA delivery across mosquito cohorts.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in target prioritization by reducing mechanistic ambiguity in resistance pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement decisions based on functional validation of genes in pathogen susceptibility.
Implementation Considerations
- Expertise in mosquito handling, microinjection, and molecular biology techniques.
- Instrumentation including microinjection puller, syringe setup, and calibration tools.
- Cross-team standardization of needle calibration and injection protocols.
- Adaptation considerations for different mosquito species or developmental stages.
- Practical limitations include mosquito survivability post-injection and variability in dsRNA delivery efficiency.
