Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

מאמר זה מתאר שיטות שונות של גידול

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל ביופילמים של פסאודומונס אירוגן על פני השטח האפיקליים של תאי אפיתל חיים של דרכי הנשימה האנושיות. זה מושג תחילה על ידי הקמת שכבה חד-שכבתית של תאי אפיתל של דרכי הנשימה על משטח פלסטיק או החלקת כיסוי זכוכית. השלב השני של ההליך הוא גידול תרבית של חיידקי אירוגן p באופן מכונן, המבטא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק.

השלב הבא הוא למקם את החיידקים ותאי דרכי הנשימה במגע זה עם זה בסביבה סטטית או בתא זרימה. השלב האחרון של ההליך הוא לאפשר לביופילם חיידקי להתפתח לאורך זמן תוך הערכת הכדאיות של תאי דרכי הנשימה. ניתן להשיג תוצאות המראות היווצרות ביופילם על תאי דרכי נשימה חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בחולי סיסטיק פיברוזיס מכיוון שניתן להשתמש במודלים אלה של תרבית משותפת כדי לפתח ולתקף משטרי אנטיביוטיקה חדשים, המסוגלים למגר ביופילמים האחראים להתיישבות כרונית של דרכי הנשימה. בחולי סיסטיק פיברוזיס, מודל הביופילם הסטטי משתמש בתאי CFBE, שהם דרכי נשימה אנושיות אימורטליות. תאי אפיתל פותחו במקור מאדם עם סיסטיק פיברוזיס שבעה עד 10 ימים לפני חיסון החיידקים זרעו את תאי CFBE בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות.

אנו זורעים תאים בריכוז של פי שניים מ-10 עד חמישית תאים לבאר ב-0.5 מיליליטר של מדיום חיוני מינימלי או MEM בתוספת סרום בקר עוברי של 10% L-גלוטמין עוברי, 50 יחידות למיליליטר, פניצילין ו-50 מיקרוגרם למיליליטר. סטרפטומיצין מגדל את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. 95%אוויר במשך שבעה עד 10 ימים החלף את המדיום כל יומיים-שלושה.

תנאים אלה יובילו להיווצרות צמתים קונפלואנטים, חד-שכבתיים והדוקים יום אחד לפני הניסוי. חסנו תרבית של חמישה מיליליטר עם פיירו ג'ן ממלאי קפוא וגידלו 18 שעות ב-37 מעלות צלזיוס על מסובב. ב-200 סל"ד אנו משתמשים ב-p aerogen הנושא את הפלסמיד PSMC 21 לביטוי מכונן של GFP ביום החיסון החיידקי.

הסר את המדיום מתאי ה- CFPE והוסף נפח שווה של מדיום מיקרוסקופיה, שהוא MEM ללא פנול אדום, בתוספת מפגש חיסון L-גלוטמין מילימולרי, חד שכבות CFBE עם posa בריבוי זיהום של כ -30 לאחד ביחס למספר תאי CFBE שנזרעו במקור לצלחת 24 בארות. זה שווה ל-1.2 כפול 10 מה-CFU השביעי למיליליטר ב-0.5 מיליליטר MEM ל. ובכן דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני, 95% אוויר למשך שעה.

לאחר הדגירה של שעה, הסר את החטף והחלף במיקרוסקופיה טרייה. בינוני בתוספת 0.4% ארגינין. תוספת הארגינין מעכבת את הרס החד-שכבתי מספיק זמן כדי להיווצר ביופילמים על תאי ה-CFPE.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, 95% אוויר לנקודות זמן שונות עד כשמונה שעות כל שעתיים. נתח את שלמות החד-שכבת CFBE ואת צמיחת הביופילם באמצעות מיקרוסקופיה. מודל הביופילם של תרבית משותפת של תאי זרימה דורש היווצרות של חד-שכבת קונפלואנט של תאי CFBE על החלקת כיסוי זכוכית בקוטר 40 מילימטר.

כדי להשיג זאת, המקום הראשון, כיסוי סטרילי מחליק לתוך צלחת פלסטיק סטרילית בקוטר 60 מילימטר. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של גידול תאים חמים מראש, לחיצה בינונית על החלקת הכיסוי עם קצה הפיפטה כדי להסיר את כל הבועות הכלואות מתחת, וכדי לאלץ את הכיסוי להחליק לתחתית זרע צלחת הפלסטיק, פעמיים כפול 10 לתאי CFBE השישיים למנה. מנערים את המנה בעדינות קדימה ואחורה, אך הימנעו ממערבולת כדי למנוע צנטריפוגה של התאים כנגד דפנות המנה.

מניחים את המנה בחממת אוויר של 5% פחמן דו חמצני, 95% אוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה עד 10 ימים. האכילו את התאים כל יומיים בשלושה מיליליטר של מצע גידול טרי. בתנאים אלה, התאים ייצרו חד-שכבת קונפלואנט על החלקת כיסוי הזכוכית.

השלב הבא הוא הכנת זן חיידקי P aerogen יום אחד לפני הניסוי. גדל p aerogen בחמישה מיליליטר LB למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על מסובב. ב-200 סל"ד, אנו משתמשים בזן אווירוגן P, PO one, הנושא את הפלסמיד PSM C 21 לביטוי מכונן של GFP ביום הניסוי.

במיליליטר אחד של תרבית חיידקים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי וצנטריפוגה ב-6,000 סל"ד למשך שלוש דקות. שוטפים את גלולת החיידקים פעמיים במיליליטר אחד של מיקרוסקופיה. מדלל בינוני 0.5 מיליליטר של חיידקים שטופים ומרחפים לתוך 4.5 מיליליטר של מדיום מיקרוסקופיה כדי להשיג ריכוז של בערך פי חמישה פי 10 מה-CFU השמיני למיליליטר.

כעת אנו מוכנים לצפות בתאי CFPE בזמן אמת, מה שדורש תא הדמיה המחובר למשאבה פריסטלטית כדי להבטיח זרימה של חומרי מזון לפרקי זמן ממושכים. ובקר טמפרטורה, אנו משתמשים במנגנון תא זרימת ביופילם סטנדרטי. הביוטק FCS שני תאים שונה כדי להכיל תאי CFPE.

אחד השלבים הקריטיים ביותר במודל הביופילם של תרבית משותפת של תאי זרימה הוא הרכבת החדר מבלי לפגוע בצג התא כדי להרכיב את החדר. החזק את החצי העליון של החדר הפוך כך שצינורות הזלוף יהיו גלויים ויישר את חורי המרווח של אטם גומי בעובי 0.75 מילימטר על צינורות הזילוף. ערמו את מגלשת המיקרו אקוודוקט המסופקת עם התא על גבי אטם הגומי, וודאו שהצד המחורץ

לאחר מכן הניחו אטם גומי נוסף על גבי השקופית. העובי והגיאומטריה הפנימית של אטם שני זה יקבעו את נפח החדר. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום מיקרוסקופיה חם מראש במרכז השקופית.

הנח את תא ההדמיה על משטח סטרילי בזמן שאתה שולף את תאי ה-CFPE מאינקובטור תרבית התאים. מוציאים את המדיום המושקע מהכלי ושוטפים את תאי ה- CFPE פעם אחת עם שלושה מיליליטר של מדיום מיקרוסקופיה חם מראש. בעזרת אתנול שטפו מלקחיים.

הוצא את פתק הכיסוי מהצלחת והורד אותו הפוך על חרוז מדיום המיקרוסקופיה המונח על החדר. החלקת הכיסוי מונחת כעת על אטם הגומי השני והשכבה החד-שכבתית של תאי דרכי הנשימה פונה כלפי מטה. החזק את הרכיבים המורכבים ביד אחת, הנח את בסיס החדר על גבי הערימה והפוך את החדר במהירות כך שהכל יהיה בצד ימין כלפי מעלה.

נעל את הבסיס למקומו על ידי סיבוב הטבעת. חבר את צינור הכניסה למשאבת המיקרו זלוף בזרימה נמוכה. חתיכת צינור שנייה, מקשרת את המשאבה לפלאס של מדיום מיקרוסקופיה המונח באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס.

ממוקם ממש ליד המיקרוסקופ. התחל את הזרימה בקצב של 20 מיליליטר לשעה. קצב זרימה זה נמצא ביכולת מהירות השחייה של פוסה.

חבר צינור CFL 16 סטרילי חתוך מראש לצינורות הזלוף של הכניסה והיציאה של החדר, ולאחר מכן חבר את בקר הטמפרטורה. הנח את החדר המורכב על שלב המיקרוסקופ של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. שימוש במזרק חד פעמי של מיליליטר.

הזרקו את תרחיף החיידקים שהוכן בעבר לתא באמצעות שסתום דו-כיווני הממוקם בקו בין המשאבה לתא כדי לאפשר לחיידקים להיצמד לתאי דרכי הנשימה. עצור את המשאבה למשך שעתיים. לאחר שעתיים ניתן לחדש את הזרימה ולשמור עליה במהירות של 20 מיליליטר לשעה.

בהמשך הניסוי, עקוב אחר שלמות תאי דרכי הנשימה על ידי הפרעות דיפרנציאליות. מיקרוסקופ ניגודיות לאורך כל הניסוי כדי לבדוק אם יש סימני נזק לשכבה החד-שכבתית. במקביל לעקוב אחר התפתחות הביופילמים של אירוגן p המסומנים ב-GFP על פני השטח האפיקליים של תאי דרכי הנשימה.

על ידי רכישת תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי או רחב שדה הפוך הן במבחני הסטטי והן בבדיקות תאי הזרימה, נמצא כי החד-שכבת CFPE יכולה לעמוד בנוכחות של p aerogen עד שמונה שעות לאחר החיסון ללא כל סימן לשינוי. ניתן להעריך את שלמות האפיתל חד-שכבתי על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה באמצעות הפוך כפי שמוצג בדוגמה זו של חד-שכבת קונפלואנט של תאי CFPE הגדלים על לוחות תרבית רקמות. עם הזמן, p aerogen ייצר רעלים וגורמי אלימות שעלולים לפגוע בחד-שכבת תא האפיתל באופן מלא או בחלקים.

בדוגמה זו של חד-שכבת CFPE שנפגעה, חיידקי P אירוגן המוצגים בירוק נראים מתפשטים בין הצמתים ההדוקים של תאי האפיתל ומקבלים גישה לממברנות הבסיסיות. היווצרות ביופילם בדרך כלל אינה מושגת בתנאים אלה עקב הידרדרות השכבה החד-שכבתית. תמונה זו מציגה ביופילם של אירוגן p מגודל שנצפה 24 שעות לאחר החיסון לאחר תמיכה מוצלחת ביצירת ביופילם.

החד-שכבת CFPE ניזוקה ללא תיקון וכיום היא כמעט נעדרת. ביופילם שיורי הגדל כשכבה שטוחה של חיידקים מוצג מחובר לכיסוי הזכוכית. כאשר שלמות החד-שכבה של דרכי הנשימה אינה נפגעת.

ביופילמים של אירוגן P יכולים להיווצר ולהתפתח בהצלחה על פני השטח האפיקליים של תאי דרכי הנשימה בשני המודלים של תרבית משותפת. מוצגת כאן תמונה מייצגת של GFP המבטא ביופילם של p aerogen שגדל על חד-שכבת קונפלואנט של תאי CFPE באמצעות מודל ביופילם סטטי של תרבית משותפת המוערך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי. התמונה היא שכבת-על של ערוץ ניגודיות הפנים וערוץ הקרינה.

התמונה הבאה מציגה GFP שכותרתו p aerogen. ביופילם שגדל במשך שש שעות על שכבה חד-צדדית של תאי CFBE באמצעות מודל ביופילם של תרבית משותפת של תאי זרימה כדי להקל על הדמיה של דרכי הנשימה. גרעינים חד-שכבתיים נצבעו ב-HEXT 3 33 42 לפני החיסון ב-posa ונראים בצבע כחול.

סרטים המוצגים כגושים ירוקים המחוברים למשטח האפיקלי של תאי ה-CFPE מפוזרים על פני תאי דרכי הנשימה. המבנים דמויי הפטרייה האופייניים של ביופילמים אווירוגנים בני שש שעות הנוצרים על חד-שכבת תא A-C-F-P-E לאחר שחזור תלת מימד מוצגים כאן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגדל בהצלחה ולדמיין ביופילמים של חיידקים על שכבה אחת מבוססת של תאי דרכי הנשימה באמצעות מודלים של תרבית משותפת המתוארים כאן, ובשילוב עם שיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.