התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

מטרת הליך זה היא לבטא קולטני תאי T ספציפיים לאנטיגן פונקציונלי על תאי T של עכברים. ראשית, העבירו קו תאים המייצר רטרו-ויראלי עם פלסמיד המכיל את הגן TCR המעניין כדי לארוז TCR המבטא רטרו-וירוס. לאחר מכן, בודדו וטהרו תאי T מטחול עכברים מדביקים את תאי ה-T המטוהרים הללו ברטרו-וירוס המיוצר בשלב הראשון.

לבסוף, הרחב את תאי ה-T המומרים כדי לבטא ולהשיג רמות ניכרות של קולטנים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הביטוי של TCRs ספציפיים לאנטיגן פונקציונלי על תאי T של עכבר באמצעות ציטומטריית זרימה. היי, שמי מישל קרואו גארד.

אני במכון הסרטן של NYU בבית הספר לרפואה של NYU. היום אנו הולכים להראות לכם כיצד להתמיר תאי T ראשוניים, האנשים שיראו לכם כיצד לעשות זאת יהיו שיונג, פוסט-דוקטורנטית במעבדה, קלינה מלק, סטודנטית לתואר שני במעבדה, ואריאן פרז גרסיה, פוסט-דוקטורנטית במעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטה קיימת כמו עכברים טרנסגניים הוא שהיא גוזלת הרבה פחות זמן.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות אימונולוגיות מרכזיות כגון איזה TCR יכול לתת תגובה טובה יותר נגד אנטיגנים. ניתן ליישם טכניקה זו לטיפול בהעברת תאי T מאמצים, שהוכח כמבטיח לטיפול בחולי סרטן ומורכב משינוי חוץ גופי של תאי T אנושיים כדי להבטיח ביטוי שווה של שרשראות אלפא ובטא של קולטני תאי T. לשכפל את הגן המעניין לאותו וקטור רטרו-ויראלי בשליטת אותו מקדם.

הכן DNA פלזמה באיכות גבוהה באמצעות ערכת ההכנה של Kyogen Maxi והכין מלאי של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר. הסר את המדיה מהצלחת עם תאי אריזה רטרו-ויראלים פלטינה E ושטוף את הצלחת פעם אחת עם XPBS אחד. עקרו את התאים על ידי הוספת טריפסין EDTA ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות.

לנטרל את התאים שנעקרו עם מדיה DMEM ולהעביר לצינור בז. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב -1000 פעמים G למשך חמש דקות. שאפו את ה-supinate והשעו מחדש את כדור התא במדיה DMEM.

קבע את מספר התא ודלל את התאים ב-0.6 כפול 10 עד שש לצלחת מיליליטר. 10 מיליליטר של תרחיף תאים בצלחת תרבית רקמה מצופה פוליליזין של 10 מילימטר וגדלים בן לילה בחממת תאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. למחרת בבוקר, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא כ-80% שטף.

הסר בעדינות את המדיה מהצלחת. שטפו את התאים פעם אחת עם XPBS אחד והוסיפו 10 מיליליטר של חומר DMEM טרי ומחמם מראש ללא פניצילין או סטרפטומיצין. עבור קומפלקס הטרנספקציה הממוצע של השפתיים, הכינו שתי תערובות ואופטימיזציה ME M1 של DNA והשני של מגיב לכריתת שומן שיווי משקל בנפרד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן מערבבים יחד בעדינות ודוגרים למשך 20 דקות. בטמפרטורת החדר, טפטפו לאט את התערובת לתאי הפלטינה E. נדנד בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה כדי לפזר את תערובת הטרנספקציה באופן שווה.

לאחר מכן דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בחממת תאים. לאחר שש עד שמונה שעות, החלף את המדיום ב-10 מיליליטר של מדיום DMEM טרי לייצור ויראלי. קצרו טחול עכבר והעבירו למדיום RMI.

מניחים את הטחול במסננת תאים. מועכים את הטחול בעזרת בוכנת מזרק לצלחת תרבית רקמות של חמישה סנטימטרים. שטפו תאים ממסננת התאים בעזרת PBS סטרילי על מנת לקצור את צנטריפוגת התאים ב -1000 פעמים G למשך חמש דקות.

השליכו את הסאפ נטנט. המשך על ידי Resus השעיית כדור התא במאגר CK. הוספת שני מיליליטר לטחול דגירה למשך שתי דקות.

בטמפרטורת החדר. הוסף מדיום RPMI עד 20 מיליליטר וצנטריפוגה ב 1000 פעמים G למשך חמש דקות. לבסוף, השעו מחדש את כדור התא ב-PBS סטרילי.

קבע את מספר התא והצנטריפוגה ב-1000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. על מנת להפעיל את תאי ה-T של העכבר לפני התמרה ויראלית יש לצפות בלוחות עם נוגדנים מפעילים, כלומר אנטי CD שלוש אפסילון ואנטי CD 28. הכן תערובת נוגדנים של מיקרוגרם אחד למיליליטר של אנטי CD, שלושה אפסילון ושני מיקרוגרם למיליליטר של אנטי CD 28 ב-PBS סטרילי, חלק 250 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים לכל באר של צלחת תרבית הרקמה של 24 הבארות ודגר במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.

סמן מגנטית את תאי הטחול בהתאם למדריך המוצר. מקם עמודת LS בשדה המגנטי. החל מתלה תאים עם תווית על העמודה.

אסוף זרימה דרך CD עכבר מועשר שמונה פלוס תאי T. שוטפים את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר חיץ ובשילוב עם המכה הקודמת. לצבוע את התאים בנוגדנים אנטי CD שלושה אפסילון ואנטי CD שמונה אלפא ולנתח את ציטומטריית הזרימה.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-1000 פעמים G למשך חמש דקות והשעו מחדש את פלת התאים למיליון תאים למיליליטר במדיום RPMI עם IL אנושי רקומביננטי 2. הסר את תמיסת הנוגדנים מלוחית ההפעלה. שוטפים כל באר עם PBS סטרילי.

הוסף מיליליטר אחד של תרחיף התאים לכל באר והנח את הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס. 5% פחמן דו חמצני בחממת תאים. לאחר יומיים של ייצור הנגיף, המדיום בפלטינה ESE אמור להיות צהוב.

העבירו את הנגיף לצינור חרוטי של 15 מיליליטר כדי להסיר פסולת תאים. צנטריפוגה הנגיף S supernatant ב-1000 כפול G למשך חמש דקות. העבירו בזהירות את הנגיף לצינור חדש.

השאירו מעט נוזלים בתחתית הצינור ואל תפריעו לפסולת התאים. אסוף תאי T מופעלים מהצלחת לתוך צינור חרוטי של 50 מילימטר. קבע את מספר התא.

שמור כמה תאים בצינור נפרד שישמש כצנטריפוגת בקרה שלילית ב-1000 פעמים G למשך חמש דקות והשליך את הנטנט השכיב. לאחר מכן השעו מחדש את כדור התא בשכיבת הנגיף. נטנט ב-10 עד שישה תאים למיליליטר עם 20 ננוגרם למיליליטר של אדם רקומביננטי, אינטרלוקין 2 ו-10 מיקרוגרם למיליליטר של חלבון גופרתי.

הוסף מיליליטר אחד של תרחיף תאים לכל באר של צלחת 24 הבארות עבור צינור הבקרה. החייאה. השעו את התאים במדיום RPMI באותה צפיפות תאים עם אותה כמות של אדם רקומביננטי, אינטרלוקין 2 וחלבון גופרתי. הוסף את התאים לאותה צלחת.

עטפו את הצלחת בצנטריפוגת סרט פלסטיק למשך 90 דקות ב -2000 פעמים G ב -32 מעלות צלזיוס ללא הפסקה. לאחר הצנטריפוגה, הסר את סרט הפלסטיק. הוסף מיליליטר אחד של מדיום RPMI טרי עם 20 ננוגרם למיליליטר של אינטרלוקין אנושי רקומביננטי שניים לכל אחד, והחזיר את הצלחת לחממה.

חשוב לבחון את תאי ה-T המומרים מדי יום. פצל את התאים ביחס של אחד עד שלושה במידת הצורך. אל תתנו לתאים לצמוח יתר על המידה ואל תתנו למדיום להצהיב ביום השישי או השביעי.

צבעו את התאים בנוגדנים וטטרמר MHC ספציפיים ל-TCR כדי להעריך את ביטוי ה-TCR על פני השטח של תאי T. השתמש בתאי UNSD T כפקד. תאי T מתמרים אלה מוכנים כעת ליישומים נוספים במורד הזרם.

לפני התמרה ויראלית. זה יתרון להשיג תת-קבוצות של תאי T בטוהר גבוה באמצעות חרוזים מגנטיים מסחריים כדי להעריך את רמת הביטוי של TCRs על תאי T. ניתן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לשרשראות TCR אלפא או בטא.

בדרך כלל, 30% עד 80% מהתאים יכולים לבטא TCR מותמר בהתאם לגנים של TCR ולטיטרים של הנגיף. ניתן להשתמש בטטרמר MHC הספציפי ל-TCR גם כדי לאמת עוד יותר את הביטוי הפונקציונלי של TCR. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על התאים במצב בריא לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו חומצה ציטוטוקסית או בדיקות שחרור ציטוקינים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הספציפיות והרגישות של התמר. ה-TCR.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מומחה בהתמרת ה-TCR האהוב עליך לתאי T ראשוניים. אז נתראה במעבדה.