Name: Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 30 s
Description: למדו כיצד להרכיב מערכת תאי זרימה לגידול ביופילמים של Pseudomonas aeruginosa ו-Saccharomyces cerevisiae. הפרוטוקול מדגים שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לניתוח מבנה הקהילות המיקרוביות בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. האסיפה של מערכת תא זרימה עם כל הרכיבים מערכת זרימה התאספו כוללת: צינורות autoclavable, מלכודות בועה, בינוני / בקבוק פסולת ותאי הזרימה כפי שמוצג באיור 1. כל החלקים הללו ניתן לעשות שימוש חוזר בין הניסויים. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. התא זרימה מערכת ההתקנה (מרכיבים חיוניים של ההתקנה). מערכת התא זרימה מורכב מספר מרכיבים: בקבוק בינוני, משאבה peristaltic, מלכודות בועה, התא זרימה, בקבוק פסולת, וחתכים שונים של צינורות מחוברים על ידי מחברים שונים. איור מספקים בנדיבותם על ידי רונה Lyngklip. 2. האסיפה של התא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא זרימה (איור 2 א) מטופל עם נתיבי דקה של דבק סיליקון, באמצעות מזרק (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת לכסות על גבי קווי סיליקון (איור 3). תלושי זכוכית לכסות משמשים תשתית עבור פ aeruginosa בעוד פתקי PVC לכסות מוחלים על S. cerevisiae biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. שרטוט סכמטי של התא זרימה מלכודת בועה 2. תיאור מפורט של ממדים המשמש לייצור של מלכודת) תא ב) בועה זרימה, ביולוגיה DTU מערכות. והודפס מחדש באישור וג'ון וילי ובניו בע"מ (DTU Systems Biology היה זכאי בעבר Biocentrum, כמתואר באיור) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. איור של דבק סיליקון קווי הבקשה מצורף של תשתית הזכוכית. הזכוכית המכסה הצביעו מושם על הדבק סיליקון לצרף אותו התא זרימה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא זרימה מעל ולמקם אותו על משטח שטוח עם הצד לכסות להחליק למטה. לחצו בעדינות על גבו של התא זרימה לדחוף את תלוש לכסות על בסיס של התא זרימה. הפעל את התא זרימה מעל ולבדוק עבור אזורים שאינם חתומים על ידי הסיליקון. (בוכנה) ידית חלק מזרק יכול לשמש ככלי בעדינות ללחוץ על תא הזכוכית וזרימת יחד. </li></ol> 3. בקבוק בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סיליקון צינור האכלה (2 מ"מ קוטר פנימי) בבקבוק בינוני להוסיף מחבר ישר בקצה השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני עד הבקבוק (עבור תוכן בינוני לראות "התקשורת" פסקה) כיסוי מחבר בקבוק עם רדיד מתכת החיטוי הבינוני. ודא כי בסופו של צינור אספקה ​​קבועה מעל פני הנוזל בבקבוק בינוני או אפקט סיפון עשוי לרוקן את בקבוק בינוני כאשר מעוקר. </li></ol> 4. חיבור מלכודת הבועה, תזרים תא משאבה להרכיב את כל צינורות על פי המתווה באיור 1. השתמש בצינור סיליקון למעט החלק שעובר המשאבה peristaltic שם צינורות Marprene מוחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחבר את הצינור מהבקבוק בינוני לכל חדרי תזרים בודדים, לפצל צינור למספר הנדרש של פתחי הכניסה מוחל בניסוי. השתמש ב-T-מחברים כדי להפוך את המספר הרצוי של צינורות חיבור בין צינור ההזנה של צינורות Marprene בתוך המשאבה (ראה איור 1, T-מחבר). זה בדרך כלל רעיון טוב כדי לשמור על הסדר אותו רצף של צינורות ותאי לזרום בכל המערכת, כדי להקל על זיהוי של רכיבים במקרה של תקלות במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור כל צינור האכלה בודדים (2 מ"מ קוטר) כדי Marprene צינורות המשאבה באמצעות מחברים ישר. חבר את צינורות Marprene ללכוד בועה (איור 2b) דרך צינור סיליקון ביניים (1 מ"מ קוטר). ודא כי המשאבה מחוברת כניסת בחלק הגבוה של המלכודת בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינור מוצא וכתוצאה מכך של מלכודות בועה אל מפרצון את זרימת התא (1 מ"מ קוטר), לוודא כי אורך tubings אלה מאפשר התא זרימה להתרגש לשלב של המיקרוסקופ confocal (בדרך כלל 1 מ '). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 מזרקים מ"ל על גבי מלכודות בועה. סגור את צמרות עם כמוסות מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מוצא התא זרימה חיבור קצר, כ 40 מ"מ של חתיכה (1 מ"מ קוטר), צינורות ולהשתמש "צמצום" מחבר ישר לצרף צינור פסולת (2 מ"מ קוטר) באורך הדרוש. המקום צינורות פסולת במיכל הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין, מיכל פסולת חייב תמיד להיות ממוקם באותה רמה כמו תאים הזרימה, מעולם מתחת לרמה תזרים תאים. כמו כן, ודא כי בסופו של צינורות הפסולת הוא קבוע מעל פני הצפוי של פסולת נוזלית כדי למנוע סומק גב עקב אפקט הסיפון בעת ​​טיפול בתאי לזרום. </li></ol> 5. חיטוי ושטיפת מערכת זרימת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מלכודת כמוסות בועה ולמקם אותם באתנול 70% כדי לשמור אותם סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת המשאבה במהירות הגבוהה ביותר כדי למלא את המערכת עם 0.5% (V / V) hypochlorite נתרן במים. &lt;/ Li&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מלכודת כמוסות בועה בחזרה כאשר מלכודות בועה מלאים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תאים זרימת כדי להסיר בועות בחדר זרימה. הקפד לא לפגוע זכוכית לכסות שביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מערכת לעקר עבור 3-4 שעות בקצב הזרימה של 3 מ"ל / שעה / ערוץ (0.2 מ"מ / s קצב זרימה ליניארי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המערכת 2-3 פעמים כדי לשטוף את כל hypochlorite. מילוי לרוקן את המערכת עם מים סטריליים. מלכודות הבועה צריך להיות מרוקן לחלוטין בין כל לשטוף. ניתן לעשות זאת על ידי שאיבה באוויר עד מלכודות בועה כבר התרוקן. לאחר ריקון, להסיר כמוסות מן מלכודות בועה לפני מילוי המערכת. החלף כמוסות לאחר מלכודות בועה מולאו לחלוטין בנוזל. חזור כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מים סטריליים באמצעות המערכת בקצב זרימה נמוכה (1-3 מ"ל / שעה / ערוץ) במשך לילה או להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את בקבוק בינוני עד כניסת ולשטוף את המערכת עם בינוני במשך הלילה בקצב זרימה נמוכה (3 מ"ל / שעה / ערוץ) בטמפרטורה שבה הניסוי יבוצע. הערה: מלכודות בועה יש לרוקן את המים לפני מערכת מתמלא בינוני. </li></ol> 6. הרכבה של התא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך התרבות לילה לעשות דילול צפיפות אופטית הרצוי (למשל עבור aeruginosa פ 0.001 OD 600nm ו - 0.1 OD 600nm עבור cerevisiae ס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 0.5 מ"ל עם מחט 27G לטעון inoculum מספיק כדי למלא את החדר. 250 μL מספיק עבור לתאי תזרים בעל הממדים שצוינו בעבודה זו (איור 2., 40 מ"מ x 4 מ"מ x 1 מ"מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את צינורות סיליקון מובילים אל התא זרימה כדי למנוע חזרה לזרום לתוך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את האתר חיסון על צינורות סיליקון ידי מנגב אותו עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך הצינור סיליקון להציג את קצה לתוך מפרצון של התא זרימה. לאט לאט להזריק את inoculum החדרה (להיזהר לא להזריק בועות אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט למחוק את האתר עם הזרקת אתנול 70% ואחריו אטימה מיידית של החור באמצעות דבק סיליקון על הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התא זרימה ולתת מיקרו אורגניזמים לדבוק לתשתית במשך שעה 1 ללא לזרום דרך התא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא זרימה, להפעיל את המשאבה בינוני (3 מ"ל / שעה / ערוץ) ולקחת את מהדק את שפופרת סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערכת ממוקמת על הדגירה, בשעה 37 ° C במקרה של פ aeruginosa ו - 30 ° C במקרה של ס cerevisiae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biofilm בתאי תזרים כעת ניתן דמיינו ידי CLSM. </li></ol> 7. הכתמה של biofilm עבור מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילול מכתים המתאים (למשל 1:1000 Syto 9 לחיות כתם על cerevisiae ס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלאמפ של צינורות סיליקון המוביל התא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר אתר חיסון על צינורות סיליקון ידי מנגב אותו עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 0.5 מ"ל עם מחט 27G לטעון פתרון מכתים מספיק כדי למלא את החדר. 250 μL מספיק עבור לתאי תזרים משמש כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך הצינור סיליקון להציג את קצה לתוך מפרצון של התא זרימה. לאט לאט להזריק את הפתרון מכתים החדרה (להיזהר לא להזריק בועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט למחוק את האתר עם הזרקת אתנול 70% ואחריו איטום המיידית של הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את התא זרימה ללא זרימה במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוריד את מהדק ולהתחיל את הזרימה (3 מ"ל / שעה / ערוץ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את הנתונים עם CLSM </li></ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li>
<li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li>
<li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li>
<li>Haagensen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+distribution+of+colistin-+and+sodium+dodecyl+sulfate-tolerant+cells+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).</li>
<li>Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+bacterial+migration+in+the+development+of+complex+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).</li>
<li>Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells%2C+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li>
<li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li>
<li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+type+IV+pili%2C+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li>
<li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li>
<li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li>
<li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li>
<li>COMSTAT2, a semi-automated java-based quantification program for the analysis of microbial biofilms [Internet]. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.comstat.dk/">http://www.comstat.dk/</a> (2010).</li>
<li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalmer%2C+RJ+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Palmer, J. B. , Springer. 882-900 (2006).</li>
<li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaagensen%2C+JA+%22High+Resolution+Microbial+Single+Cell+Analytics+Advances+in+Biochemical+Engineering+and+Biotechnology%22">High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology</a>. Müller, S., Bley, T. , Springer. (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנחנו הוכיחו תא זרימה מערכת המייצגת כלי רב עוצמה בחקירות biofilm. בשילוב עם הדמיה 3D ידי מיקרוסקופיה confocal, המערכת מציעה מגוון יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות של ניתוח biofilms חיידקים באמצעות שיטות מיקרוסקופיות מסורתיים יותר. מערכת זו מאפשרת הדמיית 3D של חיים מיקרוביאליים קהילות biofilm ללא הפרעה של הקהילה. במיקרוסקופ אור לא תספק מידע מפורט על נישות של biofilm ובעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מספקת רזולוציה ננומטרי של biofilm, הוא אינו מאפשר הדמיה תא חי. באמצעות ערוץ המתואר זרימת מערכת הובהר לנו בעבר את הפריסה המרחבית של תאים חיידקיים רגיש לאנטיביוטיקה מספר 5-8 (איור 4 א), הפצה של חומרים תאיים, למשל DNA ו 9-11, חלוקת תאים ניעתי ולא ניעתי של מאותו המין בתוך קהילה חיידקי 4,6,9 (איור 4 ג'). אנו צופים כי המערכת התא זרימה ניתן ללמוד היבטים של biofilms שמרים. זה עשוי להיות הפצה spatio הזמני של biofilm שמרים בתגובה גורמים סביבתיים כמו קוטלי פטריות, וכן זיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות biofilm שמרים. למרות שמרים לא ידוע להתמיין לתאי ניעתי ולא ניעתי, היבטים אחרים של גיוון עשוי להיות biofilm מחקרים כגון השינוי המורפולוגי של שמרים לתאי pseudohyphal ואת המעבר הפלואידים לתאי דיפלואידי. הראינו מערכת לציית מינים של חיידקים כמה יעבוד עם טכניקות צביעה שונות. מגוון בדיקות מכתים שונים חלבוני ניאון, כגון ה-GFP, לאפשר חקירות נישה ספציפיים biofilm המתפתח והוא מהווה כלי יעיל בניתוח ההשפעה של סוכני מיקרוביאלית או גורמים סביבתיים אחרים. המידע ניתן להשיג מפורט מאוד (איור 4) ותכונות biofilm ניתן לכמת עם תוכנות מחשב כגון סטטמ"מ 12,13. בסך הכל, ההיבט הקריטי ביותר של פרוטוקול היא העובדה כי זהו תהליך גוזל זמן. זה גם מגבלה כי התאים צריכים להיות מסוגלים לגדול על משטח שאינו פלורסנט שקוף. . מכיוון biofilm נוצר מנותח באמצעות מיקרוסקופ confocal, עומק שניתן לחקור מוגבלת מאה מיקרומטר מספר 14 יש עוד מגבלות טכניות הטמון בעיצוב: המערכת אינו מתאים להקרנה תפוקה גבוהה, כחוקר מנוסה יכול לטפל בכ 15 ערוצי ביותר בכל ניסוי, אשר בתורו יכול לקחת כמה ימים כדי להתכונן. עם זאת, אנטיביוטיקה או מוטציות שנחשבים רלוונטיים ללימודי biofilm יכולים בתחילה להיות מסה הוקרן עם שיטות אחרות כגון מכתים סגול גביש לפני המועמדים המעניינים ביותר מועברים למערכת התא זרימה. יריעות כיסוי זכוכית דקים מאוד לשבור בקלות, יש להיזהר בעת הטיפול במערכות. בנוסף צינורות יש לבחון מדי יום במהלך הריצה של ניסוי, כמו רב "גב צמיחה" של צינורות כניסת רק נגד הזרם של תאים זרימת יכול להתרחש. זיהום מסוג זה ניתן לפתור על ידי הסרת כמה סנטימטרים של צינור סיליקון מהצד מפרצון של תאים הזרימה, באמצעות טכניקה סטרילית. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4 PAO1 הישן) יום 4 -. Biofilm GFP שטופלו במשך 24 שעות עם Colistin ו יודיד Propidium עבור מכתים מת (כתם אדום) ב) מצגת 3D של יום שלוש פ 'הישן aeruginosa PAO1 (סוג P. aeruginosa בר) - GFP biofilm 6 ג) 3D מצגת תמונה של PAO1 - CFP Pila מוטציה (כחול) עם PAO1 סוג YFP בר (צהוב) ד) 5, יום PAO1 בן - GFP biofilm כפי שהוצגו 3D דואר תמונה) 26 ש 'ח (PTR3 מוטנטי CEN.PK רקע) biofilm cerevisiae מוכתם Syto-9 15.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה מלכודות, פוליאתילן (DTU Systems Biology, האוניברסיטה הטכנית של דנמרק, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה פלסטיק פוליפרופילן המחברים ו-T-מחברים (קול לבן הזוג, 1 / 8 אינץ&#39; (3.175 מ&quot;מ) 1 / 16 אינץ&#39; (1.588 מ&quot;מ)) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clamps </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Confocal מיקרוסקופ (Zeiss, Meta LSM510) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips, זכוכית (Knittel גלזר) 50 x 24 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips, PVC coverslips (Rinzl) 50 x 24 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרים תאים, פוליאתילן (DTU Systems Biology, האוניברסיטה הטכנית של דנמרק, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקי בינוני (שוט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Peristaltic משאבה (ווטסון, מרלו, 205S) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רולינג עגלה עבור מערכות זרימה ומשאבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק סיליקון (3M איטום סופר סיליקון שקוף) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק 5 מ&quot;ל (Terumo) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Syto 9 (בדיקות מולקולריות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים 0.5 מ&quot;ל עם מחטים (27G, Terumo LU-100) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל פסולת </li></ul> Tubing: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון, 3 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 1 מ&quot;מ קוטר פנימי (אולה דיך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון, 4 מ&quot;מ קוטר חיצוני, קוטר פנימי 2 מ&quot;מ (אולה דיך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Marprene, בקוטר של 3 מ&quot;מ החיצוני, 1 מ&quot;מ קוטר פנימי (ווטסון, מרלו) </li></ul> מדיה <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa בינוני </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> דוד לחץ </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> פנסיון מלא </td></tr><tr><td> MgCl 2 6 שעות 2 O </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל 1 M CaCl 2 </td><td> 0.01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 μL / L עקבות מתכות (עבור P. aeruginosa-biofilms) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> דוד לחץ </td></tr><tr><td colspan="2"> מערבבים A10 ו FB על יחס של 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> הוסף מקור פחמן בריכוז הרצוי. </td></tr></tbody></table> <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> ס סינתטי cerevisiae בינוני מלא (SC) </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> אדנין סולפט </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-טריפטופן </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-היסטידין-HCL </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-ארגנין-HCL </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-מתיונין </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-tyrosine </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-לאוצין </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L-isoleucine </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L-ליזין-HCL </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-פנילאלנין </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-חומצה אספרטית </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L-חומצה גלוטמית </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L-valine </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> L-תראונין </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> L-סרין </td><td> 0.40 </td></tr><tr><td> שמרים ניטרוגן בסיס w / o חומצות אמינו אמוניום (Bacto) </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> אמוניום סולפט </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> Succinic חומצה </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> דוד לחץ </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז (autoclaved בנפרד) </td><td> 0.20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa ו biofilm saccharomyces cerevisiae בתוך תאים flow

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

תאים של חיידקים רבים יש את היכולת ליצור קהילות מיקרוביאלי נייחים כהגדרתו biofilms כי שינו תכונות פיזיולוגיות פתולוגי לעומת מיקרואורגניזמים שחיים חינם. Biofilms בטבע הם לעתים קרובות קשה לחקור מתגוררים תחת תנאים מוגדרים היטב 1. באמצעות תשתית שקוף זה אפשרי למכשיר מערכת שבה biofilms פשוטה ניתן לבדוק באופן בלתי הרסניות בזמן אמת: כאן אנו מדגימים את הרכבה והפעלה של מערכת התא זרימה מודל, עבור במבחנה 3D של biofilms חיידקים יצירת reproducibility גבוהה תחת תנאים מוגדרים היטב 2,3. המערכת כוללת תא זרימה המשמש חדר הצמיחה biofilm. התא זרימה מסופק עם חומרי מזון וחמצן מן הבקבוק בינוני באמצעות משאבה peristaltic ובינוניים בילה נאסף במיכל אשפה. זה בנייה של מערכת הזרימה מאפשר אספקה ​​רציפה של חומרים מזינים מתן אנטיביוטיקה למשל עם הפרעה מינימלית של תאים בוגרים בחדר זרימה. יתר על כן, תנאי הזרימה בתוך התא זרימה לאפשר מחקרים biofilm שנחשפו ללחץ גזירה. בועה השמנה גבולות מכשיר בועות אוויר מן הצינור, אשר אחרת עלולה לשבש את המבנה biofilm בתוך התא זרימה. מערכת התא זרימה תואמת מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM) והוא יכול ובכך לספק מידע 3D מפורט ביותר על פיתוח biofilms חיידקים. תאים biofilm יכול להיות מתויג עם בדיקות ניאון או חלבונים בקנה אחד עם ניתוח CLSM. זה מאפשר הדמיה מקוונת המאפשרת חקירת נישות biofilm המתפתח. הגומלין מיקרוביאלית, חקירת סוכני מיקרוביאלית או את הביטוי של גנים ספציפיים, הם של ניסויים רבים setups שניתן לחקור במערכת התא זרימה.

הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

שלום, אני מאט מא ניטון מהאוניברסיטה הטכנית של דנמרק. היי, ואני ריבה מאוניברסיטת קופנהגן. אנו עובדים על שמרים וביופילם חיידקי במערכות תאי זרימה ובסרט זה אנו הולכים להראות לכם כיצד להקים מערכת תאי זרימה וביופילם ויזואלי על ידי מיקרופון הניתן להמרה.האם עלינו לעשות זאת עכשיו? כן, בטח. בואו נעשה את זה.הדבקת תאי הזרימה. תאי הזרימה ממוקמים בין מלכודת הבועות לבקבוק הפסולת. כעת נראה לך כיצד לצרף.זוהי שכבה לתא הזרימה. זה נעשה על ידי מספר הרכיבים שאתה רואה בטבלה. קצה של 200 מיקרוליטר נחתך לשני חלקים.החלק הדק מוחדר כעת למזרק, שיהפוך לכלי המושלם למריחת קווים דקים של סיליקון. על מנת להדביק את השכבה לתא הזרימה, דחף את הקצה הדק החוצה מהמזרק. כעת, על מנת לבצע יישום קל יותר של הסיליקון על בסיס תא הזרימה, חתכו את החלק החיצוני ביותר של הקצה, הוציאו את הבוכנה ומרחו כמות מתאימה של סיליקון לתוך המזרק.החזירו את הבוכנה למזרק ודחפו מעט סיליקון החוצה על מנת לוודא שכל הבועות נעלמו. כעת התחל למרוח קווים דקים של סיליקון על תא הזרימה. נסה ליצור קווי סיליקון חלקים ולא מופרעים לתא הזרימה.זה יבטיח שהסיליקון יתחבר באופן שווה לתשתית בעת מריחת סיליקון בכיוון ההפוך. הקפידו לא לגרד את הקווים שכבר נעשו, אלא נסו להרים בעדינות את הקצה תוך כדי תנועה, וכך תוודאו ששום פתחים בקווי הסיליקון לא יובילו לדליפות בין התאים או מתוך תא הזרימה. קח כיסוי והניח אותה בעדינות על גבי קווי הסיליקון בתא הזרימה.כפי שניתן לראות כאן, זכוכית הכיסוי תידבק בקלות לדבק הסיליקון. הפוך את תא הזרימה ודחף בעדינות כלפי מטה את גב תא הזרימה בעזרת האצבעות. זה יבטיח שזכוכית הכיסוי תתחבר בצורה שטוחה בהתאם למשטח השטוח של השולחן.עכשיו כדי ליצור אטימה מושלמת או לנסות לתקן את פתיחת האזורים, דחף בעדינות כלפי מטה עם מכשיר כבוכנה ממזרק. עשה זאת בזהירות רבה. ככיסוי זכוכית יכולה להישבר בקלות.על ידי כך, תוכל ליצור אטימה טובה עוד יותר וכנראה שתוכל לתקן אזורים בעייתיים בסופו של דבר כדי למנוע דליפות בבדיקת תאי הזרימה. על מנת לבצע ניסוי מוצלח, חשוב לבדוק את תאי הזרימה שלך לאחר שהסיליקון התמצק. כאן אנו מראים תא זרימה עם אטימה לא מושלמת, שללא ספק תוביל לדליפות, הרכבת מלכודות הבועות והצמדת הצינורות.מלכודות הבועות ממוקמות בין המשאבה לתאי הזרימה. כאן אנו מראים את המרכיבים השונים לשימוש במלכודות הבועות הביולוגיות של DTU. הם מיוצרים בצורה שתבטיח שהבועות נלכדות במערכת ורק מדיה ללא בועות תיכנס לתאי הזרימה.חמישה מזרקים של מיליליטר מונחים על גבי כל אחד מהחרירים המיוחדים. על מלכודת הבועות, איטום הדוק מבוטח על ידי הטבעות הישנות. על כל זרבובית, הניחו מכסה על כל אחד מהמזרקים.כעת, מכיוון שזה יהיה החיבור לתאי הזרימה, הקפד לחבר את הצינורות הארוכים לתא הזרימה כדי שיוכל להגיע למיקרוסקופ קונפוקלי. יש לחבר צינורות אלה למלכודות הבועות שבהן יש יציאה למדף התחתון של הזרבובית. מכיוון שמדף הכניסה במלכודת הבועות גבוה יותר ממדף היציאה, הבועות אינן מסוגלות לעזוב את המזרק ולהיכנס לחיבור תא הזרימה של תאי הזרימה למלכודות הבועות.תאי הזרימה ממוקמים בין מלכודות הבועות לבקבוק הפסולת. כאן נדרש צינורות ארוכים כדי שתא הזרימה יגיע למיקרוסקופ הקונפוקלי. שוב, הקפד לחבר את הזרימה לצד הנכון של מלכודת הבועות. הנה.שימו לב לצינורות הארוכים המובילים לזרימה ממלכודת הבועות. זה כמובן יכול להשתנות בבניית מערך אחד. כעת חבר היטב את כל הצינורות לתא הזרימה מכלול המערכת מלכודות בועות למשאבה ולמחברי T.לצינורות הזנת המדיה. עבור המשאבה הפריסטלטית, אנו משתמשים בצינורות RIN. צינורות מסוג זה מסוגלים לעמוד בלחץ המכני מהמשאבה.הגדר צינור לכל אחד מהתאים בתאי הזרימה שלך. כאן נראה כעת כיצד מורכבים הצינורות העוברים מבקבוק המדיה למשאבה. חותכים את צינורות הסיליקון לחתיכות בגודל מתאים ומחברים אותם עם מחברי T.הרכיבו את הצינורות כך שיהיה חיבור אחד לכל אחד מצינורות המוח במשאבה. הקפד להכין צינור לכל אחד מהתאים בתא הזרימה. נסה להפוך את הצינורות שלך לקצרים ככל האפשר כדי לקבל סקירה קלה יותר של החיבורים שלך.כעת מצינור ההזנה המרכזי המחובר למחברי ה-T צינורות קצרים שניתן לחבר לצינורות ה-ING במשאבה. ודא שצינורות הסיליקון מחוברים היטב למחברים. כעת עם צינורות הזנת המדיה בצד שמאל של המשאבה, נחבר כעת את שאר המערכת למשאבה.להלן הצינורות ההולכים למגשי הבועות מחוברים לצינורות הרין במשאבה. שוב, כאן תוכלו להבהיר את הסקירה הכללית של הניסוי שלכם. אם אתה יודע אילו צינורות עוברים לאיזה חיבור במשאבה, אורך הצינורות הללו אינו קריטי כמו הצינורות בצד השני של מלכודת הבועות.מדיה מובילה לתאי הזרימה, הראינו לך כעת כיצד להרכיב בהצלחה מערכת עם מלכודת בועות אחת ותא זרימה אחד בנקודת היציאה של תא הזרימה. חיברנו צינורות ארוכים מספיק כדי להיכנס לעיקור מיכל פסולת של המערכת על מנת לעקר את המערכת, ליצור תמיסה של 0.5 של נתרן הידרוכלוריד. הנח את צינורות ההזנה של המשאבה לתמיסת ההידרוכלוריד.בשלב זה, חשוב ביותר למלא את כל המערכת בתמיסת ההידרוכלוריד. מאפשר למזרקים של מלכודות הבועות להתמלא לחלוטין בהידרוכלוריד כשהם מתמלאים, להחזיר את המכסים, שבינתיים היו צריכים להיות מונחים באתנול. שלב חשוב בעיקור המערכת הוא הסרת בועות מתאי הזרימה.ניתן לראות בועות כאלה בקלות בתאי הזרימה המוצגים כאן, אך ההצלחה הגבוהה של הסרת הבועות הופכת את המשאבה לסיבובים הגבוהים ביותר לדקה. זה יוביל לזרימת נוזלים גבוהה יותר בתאי הזרימה, מה שעם הזמן יעזור להיפטר מהבועות, להרים את תא הזרימה ולהרים את הצינורות המובילים לתא הזרימה ולהקיש בחוזקה על תא הזרימה על השולחן כדי לשחרר את הבועות על מנת לשטוף אותן החוצה. עם זרימת הנוזל, הליך זה ייקח לפעמים זמן רב, אך בדרך זו תוכלו להיפטר מהבועות.אם אתה מטופל, עכשיו, השאר את תאי הזרימה מעוקרים במשך שלוש עד ארבע שעות בזרימה של כ-0.2 מילימטר לשנייה. שטיפת המערכת תחילה לתוך המערכת על ידי מתן אפשרות לאוויר לדחוף את ההידרוכלוריד החוצה מהמערכת כולה. מכיוון שהמערכת רוקנה כעת את ההידרוכלוריד, הנח את צינור ההזנה המרכזי לתוך בקבוק מים סטרילי וכסה את החלק העליון.כעת צריך לשטוף את המערכת פעמיים-שלוש על ידי מילוי ריק במערכת במים סטריליים, חיבור המדיום ורוויה של צינורות למשך הלילה. בעת חיבור בועת המדיה למערכת, יש לרוקן את המערכת ממים. כמו עם ההיפו כלורט, מלאו את פח הבועות במדיה לפני שתחזירו את המכסים.בעת חיבור המדיה, הקפד מאוד לשמור על הכל סטרילי. הכינו אתנול בצד בנקודת החיבור. הנח את שני הצינורות באתנול ממש לפני חיבור הצינורות.כעת, עם המדיה המחוברת למערכת, היא מוכנה כעת לרוויה או חיסון בן לילה. תלוי בבחירת המדיה המחסנת את תא הזרימה. בתאי הזרימה הביולוגית של DTU, יש לך שלושה אתרי חיסון לשלושת תאי הגידול הבודדים.הדבר הראשון שצריך לעשות הוא לעקר את אתר החיסון מתרבית לילה. הפוך את זה לרמז כדי להגיע לצפיפות האופטית הרצויה לך. השתמש במזרק של 500 מיקרוליטר עם מחט של 27 גרם כדי לחסן את הדגימה.חיסון של 250 מיקרוליטר מספיק לתאי הזרימה הביולוגית של DTU. כעת אתר החיסון נמחק עם החלקת אתנול נטו וצד החיסון נסגר עם דבק סיליקון. כעת הפוך את תא הזרימה הפוך והשאיר אותו במצב זה למשך שעה ללא כל זרימת מדיה.לאחר שתא הזרימה היה הפוך במשך שעה, הסר את הצדפה בחזרה והתחל את זרימת המדיה והנח שוב תא זרימה במצב הפוך. כעת התחל את הדגירה של המערכת. זמן הדגירה ובחירת הטמפרטורה משתנים בין בחירות, זנים והגדרות ניסוי, צביעה של ביופילם שמרים והדמיה על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.על מנת לדמיין את הביופילם של השמרים במיקרוסקופ קונפוקלי, אנו צובעים אותו עם כתם חומצת הגרעין הפלואורסצנטית הירוקה CY 9. כאן אנו משתמשים בדילול של אחד לאלף. ראשית, הצינורות המובילים חזרה למלכודות הבועות מתאי הזרימה נדחקים.זה ימנע זרימה חוזרת מהזרימה במהלך הליך הצביעה. עכשיו עצרו את זרימת המדיה למלכודת הבועות. השתמש במזרק של 500 מיקרוליטר באשר לחיסון כדי להזריק את כתם הציטו תשע לתא הזרימה.שוב, השתמש במגבון אתנול כדי לעקר את אתר החיסון. הזרקו 250 מיקרוליטר לתא כאן. היו זהירים ועדינים מאוד.בעת החיסון מהירות החיסון צריכה להיות נמוכה מאוד כדי לא לשבש את הביופילם. סגור את חור החיסון עם דבק סיליקון. הניחו לכתמים להתיישב במשך 15 דקות ללא זרימה.הסר את המהדק והתחל את הזרימה שוב. עכשיו אתם מוכנים לנתח את הביופילם המוכתם. במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, לתאי הזרימה יש מדפים מיוחדים המאפשרים למקם אותו במחזיקים על במת המיקרוסקופ.כאשר תא הזרימה ממוקם בשלב המיקרוסקופ, מניחים טיפת שמן על זכוכית השכבה. על מנת להשתמש במטרת טבילת השמן, הפעל את האור הלבן והורד את המטרה כדי שיבוא במגע עם השמן ויאתר את התאים בתא. היזהר אם אתה משתמש בכוס שכבה מכיוון שהיא עלולה להישבר בקלות.כאן אנו מראים ביופילם של שמרים כפי שנראה עם האור הלבן במיקרוסקופ. כאשר האור הפלואורסצנטי נדלק, ניתן לראות בקלות את צביעת הציטו תשע של התאים. כתם cyto nine יאפשר כעת סריקה של הביופילם במיקרוסקופ קונפוקלי.לניתוח נוסף עם תוכנת Amer, אתר את מיקום העניין בתא הזרימה באמצעות המיקרוסקופ. זכור לקחת בחשבון את הסביבות השונות שנוצרות לאורך זמן בתוך תא הזרימה. בעת בחירת מיקום, כעת עברו את המיקרוסקופ מהדמיה עינית להדמיית לייזר סורקת.עם תוכנת LM בגודל זה, התחל כעת להחיל את הגדרות ההחלטה לסריקת הדוגמאות שלך. סריקה מהירה של הדגימות שלך תיתן לך אינדיקציה להרכב המבני של הביופילם בתאי הגידול. לפני שהתחלנו בסריקה ברזולוציה גבוהה הגוזלת זמן רב יותר כאן אמרנו מהו המיקום הראשון ומה המיקום האחרון של הסריקה, ובכך כמה גדולה תהיה הערימה.אנו מסוגלים לסרוק את מספר התדרים בשל הלייזרים השונים המותקנים במיקרוסקופ. זה יאפשר חקירה של תת-אוכלוסיות רבות ושונות. כאן אנו רואים את ביופילם השמרים של תשעה כתמי הצל הירוק המוצג בחלון מאורכי הגל הספציפיים שבהם נעשה שימוש.כעת ניתן לנתח כל אחת מערימות הסריקה בתוכנות כשגיאות.

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר שיטות שונות של...

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

נדונים פרוטוקולים לחקר היווצרות ביופילם במכשיר מיקרופלואידי, המחקה מדיה נקבובית. המכשיר המיקרופלואידי מורכב ממערך של מיקרו-עמודים והיווצרות ביופילם על ידי Pseudomonas fluorescens במכשיר זה נחקרת.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

לביופילמים יש אינטראקציות מורכבות עם הסביבה הסובבת אותם. כדי לחקור באופן מקיף אינטראקציות בין ביופילם לסביבה, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות ליצירת סביבה כימית הטרוגנית להתפתחות ביופילם, לכימות מהירות זרימה מקומית ולניתוח הובלת מסה בתוך מושבות ביופילם ובסביבתן.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

אנו מתארים את מכלול, המבצע, ועוצב ניקוי של מנגנון זרימה כדי התמונה פטרייתי ביופילמים בזמן אמת בזמן תחת זרימה. אנחנו גם מספקים ולדון אלגוריתמים כמותיים כדי לשמש על תמונות נרכשות.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

כאן, אנו מתארים את השימוש תפוקה גבוהה יותר microfluidic מגיב ביולוגי בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח של גזירה השפעות על biofilms Pseudomonas aeruginosa המבטאים חלבונים ניאון ירוק, כולל כלי להגדיר, הקביעה של כיסוי biofilm, שיעור הצמיחה ומאפיינים מורפולוגי.

חיים תא ניתוח של גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת אוטומטית Microfluidic תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה לביצוע צמיחת ביופילם ומדידות ביומסה באמצעות התקני לוח PCR עמוקים בהרכבה עצמית עבור הקרנת ביופילם סטטית של מכסה 96-היטב.

ייצור ביופילם ביומסה חיידקית גדולה יותר באמצעות מכשירי מיקרופלאט עמוק באר עמוקה צלחת PCR

מתודולוגיה זו מאפשרת הקמת מודל ביופילם פולימיקרוביאלי בסיסטיק פיברוזיס לבדיקת רגישות מיקרוביאלית במעבדות מחקר וקליניות. מודל זה מספק תוצאות מדויקות ואמינות על פני מגוון תפוקות.

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

מחקר זה מתאר מסגרת לפיתוח מודל ביופילם פולימיקרוביאלי מצטבר ואופטימיזציה של פרוטוקול מיצוי RNA כדי להעריך את ביטוי הגן Pseudomonas aeruginosa המשקף את סביבת הריאות של סיסטיק פיברוזיס. היישומים כוללים הערכת השפעות אנטי-מיקרוביאליות וחקר חלופות אנטיביוטיות בתנאים הרלוונטיים לסיסטיק פיברוזיס.

מודל ביופילם מצטבר של סיסטיק פיברוזיס לחקר ביטוי גנים רלוונטי לזיהום

למדו כיצד להרכיב מערכת תאי זרימה לגידול ביופילמים של Pseudomonas aeruginosa ו-Saccharomyces cerevisiae. הפרוטוקול מדגים שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לניתוח מבנה הקהילות המיקרוביות בזמן אמת.

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

גלה סרטונים נוספים