Name: מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: למד הכנת חתכי פרפין וקפואים של שרירי בית החזה ב-Drosophila לניתוח מורפולוגיה שרירית ולוקליזציית חלבונים. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מדויקת של מבני שריר ורכיבים מולקולריים במודל ביולוגי חשוב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים פרופ Eichele עבור ומאפשר לנו להשתמש cryo-microtome. העבודה מומנה על ידי מקס פלאנק, Gesselschaft.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין טרי מקבע של Carnoy על ידי שילוב של אתנול אבסולוטי, כלורופורם וחומצה אצטית קרחונית ביחס 6:03:01 בהתאמה. 3 זו, כמו גם את כל פתרונות הצללה קולרים יש לשמור בצנצנות זכוכית מכתים (ראה סעיף ריאגנטים המלצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את רדיד אלומיניום כיסים את הגודל הנכון עבור הקולרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים מכתים צנצנות: 2 X אתנול 40%, אתנול 70%, אתנול 2 X 100%, methylbenzoate (MB), 50/50 v / v מגה פרפין, 2 X פרפין. מניחים את MB מיכלי פרפין בערכת באינקובטור עד 60-65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרפין חם לשפוך לתוך הכיסים כדי לסכל 60-65 ° C. </li></ol> 2. תיקון זבובים קולרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את 4 צווארון תחת המשקפת באמצעות קלטת במצב אנכי שבו אתה יכול לראות את נקודת הכניסה עבור לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים באמצעות פחמן דו חמצני או באמצעות היפותרמיה באמצעות בלוק קרח. היזהרו לא להקפיא את הזבובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להרים זבובים בודדים על ידי גרירה כנפיהם מקום לתוך הצווארון מכוונת כראוי (הראש ואת בית החזה על גבי להבים הבטן מתחת הלהבים). 10-20 זבובים צריך להתאים בקלות לתוך הצווארון. </li></ol> הערה: אם אתה מנתח מספר גנוטיפים, לא לשכוח לרשום את מספר צווארון גנוטיפ המקביל. 3. פרפין סעיפים של תסיסנית Thoraxes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מיקום צווארון לפתרון של Carnoy ולתקן את הרקמה ב 4 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, מייבשים את המדגם באמצעות ריכוז גדל והולך של אתנול. במשך 10 דקות כל אחד לצלול לתוך הצווארון 40% (פי 2), 70% ו 100% (2 פעמים) אתנול בטמפרטורת החדר. צווארון דגירה הבא בפתרון + מגה מגה פרפין (1:1) למשך 30 דקות בכל אחד ואז לחדור צווארון בשני שינויים של פרפין במשך 60 דקות כל אחד ב 60-65 ° C. במהירות להעביר את הקולר לכיס לסכל ולמלא עם נמס (60-65 ° C) פרפין. מקום זה בטמפרטורת החדר ולאפשר פרפין להפוך קשה (עדיף להשאיר לילה). שים לב כי הקולר אפשר לשים בכיס לסכל ב נטיות שונות, תלוי בכיוון של חלקים אתה צריך (אורכית או רוחבית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגולל בלוקים פרפין יבש עם צווארונים מ לסכל את ובעדינות להפריד את הצווארון מהגוש פרפין. בעזרת סכין חדה או אזמל בזהירות לחתוך את פרפין חוץ מכל רחבי הרקמה לעוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את גוש פרפין עם 7-10 סעיף צעדים מיקרומטר על microtome סיבוב ולאפשר את הרקמה לחתוך לצוף שטוח אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. הנח את רקמת מחולק בשקופיות הקוטב לאפשר ייבוש במשך הלילה. שקופיות אלה יכולים לשמש מכתים עם hematoxyline ו eosin (איור 1A-D), toluidine כחול, אנילין כחול או מת אחר לדמיין מבנים רקמות, כמו גם מכתים נוגדן (איור 1E-E ``). </li></ol> 4. Cryosections של תסיסנית Thoraxes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בסעיפים פרפין, להכין את זבובים צווארון ואופנה כיס רדיד אלומיניום. מקרר מקפיא יהיה צורך להכין את דגימות. ודא כי המקרר הוא כ -60 ° C, להשתמש אתנול מעט קרח יבש, כדי לאפשר להגיע לטמפרטורה זו. שעה לפני תחילת הניסוי הניח את בקבוק בינוני הטבעה cryo (Tissue-Tek מתחם אוקטובר) במהופך מקרר 4 מעלות צלזיוס על מנת לקרר אותו למטה כדי לצמצם את היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מיקום צווארון זבובים לכיס לסכל כי כבר מראש מקורר במשך כמה דקות בתוך מקרר מקפיא במהירות למלא עם תרכובת cryo-הטבעת. תן להקפיא מדגם 3-10 דקות. לגולל בזהירות את הבלוק נוצר בתוך מקרר, בעדינות להפריד את הצווארון מהגוש הטבעה ושמתי אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את השרירים קפואים על cryo-microtome בין -15 ו -18 ° C עם עובי חתך של 10-15 מיקרומטר. המקום בשקופיות מקוטב ולשמור על -20 ° C עד מוכן לעשות עיבוד נוסף. אנו מציעים לתקן את הרקמה בתמיסה 4% פורמלדהיד PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני צביעה נוגדן. </li></ol> 5. ליפידים איתור בשרירים תסיסנית טיפות ליפידים ניתן להבחין בשמן אדום הו כתם על cryosections באמצעות פרוטוקול אימצה מן Sieber ו Thummel 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף עם מים שקופיות פעמיים במשך 5 דקות, equilibrated ב פרופילן גליקול דקות 10 ו דגירה של כתם 3 שעות בשמן אדום O בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף דגימות 2 דקות 5 פעמים ב פרופילן גליקול ו - 30 דקות ב-PBS. הר של גליצרול 30%. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> תאנהיור 1. Parrafin-משובצים קטעים Hematoxyline ו eosine מוכתם רוחבי (AB) ו אורכית (CD) של השרירים החלקים טיסה עקיף. A ו-C מראה שרירי מובנה נורמלי. חריגה על ידי השרירים גודל ומורפולוגיה מיוצגים על B ו-D בהתאמה (חיצים שחורים). סעיף רוחבי של מוכתם החזה תסיסנית עם הסמן, אנטי LamC המעטפה גרעיני DAPI, גרעיני כתם (EF). תצוגה מוגדלת של רגיל (חץ אדום) הידרדר (חץ צהוב) השרירים (F). G מייצג מקטע של מוכתם תסיסנית בדרכי העיכול עם LamC ו DAPI. <img src="/files/ftp_upload/2438/2438fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. חלקים קפואים א רוחבי חלקים קפואים של בית החזה תסיסנית מוכתמים בשמן אדום O, טיפות תווית השומנים. סעיפים ב קפוא אורך של השרירים טיסה ישירה מוכתם אנטי DG, שריר sarcolemma סמן ואת DAPI.

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).</li>
<li>Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+muscle+and+neuronal+disorders+in+a+Drosophila+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy.</a> The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).</li>
<li>Kucherenko, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modifier+screens+reveal+new+components+that+interact+with+the+Drosophila+dystroglycan-dystrophin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex.</a> PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).</li>
<li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carnoy+fixation%3A+practical+and+theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemie%22%5BJournal%5D)">Carnoy fixation: practical and theoretical considerations.</a> Histochemie. 16, 361-36 (1968).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila+-+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila - A Laboratory Manual</a>. , CSHL Press. (1989).</li>
<li>Sieber, M. H., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DHR96+nuclear+receptor+controls+triacylglycerol+homeostasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila.</a> Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<table><tbody><tr><td>טבעות פלדת אל-חלד</td><td>תוצרת ביתית</td><td></td><td>בבנייה מיוחדת</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>נייר אלומיניום</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>להב או סקלפל</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנצנת צביעה מאקרו של Wheaton</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>דגם: Hyrax M25</td></tr><tr><td>קריו-מיקרוטום</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>דגם CM3050S</td></tr><tr><td>אינקובטור 60-65&amp;#x00B0;C</td><td>כל ספק</td><td></td><td>גדול מספיק להכיל לפחות 4 צנצנות צביעה</td></tr><tr><td>מקרר הקפאה עם בלוק מתכת</td><td>כל ספק</td><td></td><td>אחסון ב- -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>זכוכיות Super-frost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>9161155</td><td></td></tr><tr><td>זכוכיות כיסוי</td><td>כל ספק</td><td></td><td>מומלץ 24 X 40 mm</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td>דרגת ניתוח (Analytical grade)</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100063</td><td>דרגת ניתוח (Analytical grade)</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100983</td><td>דרגת ניתוח (Analytical grade)</td></tr><tr><td>מתילבנזואט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M29908-500G</td><td>דרגת ניתוח (Analytical grade)</td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76258</td><td>פראפין</td></tr><tr><td>תרכובת Tissue-Teck O.C.T.</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>16% פורמאלדהיד, נטול מתנול</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

מדורים פרפין-embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

אפיון מולקולארי של dystrophies ו myopathies שרירים בבני אדם חשף את המורכבות של מחלת שרירים ניתוח גנטי של מפרט שרירים, היווצרות ותפקוד במערכות מודל סיפקה תובנה חשובה הפיזיולוגיה השריר. לכן, זיהוי ואפיון המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס נזק לשרירים הוא קריטי. המבנה של מבוגר תסיסנית מרובת סיבים דומים השרירים השרירים מפוספס חוליות 1 ו נהילות הגנטי של תסיסנית עשה את זה מערכת גדולה לנתח מורפולוגיה שריר dystrophic ולאפיין את התהליכים המשפיעים על תפקוד השרירים הבוגרים הזדקנות זבובים 2. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. הכנות אלו מאפשרות הרקמה להיות מוכתם בכתמי היסטולוגית קלאסית שכותרתו עם צבעים חלבון גילוי, ובמיוחד cryosections הם אידיאליים עבור זיהוי immunohistochemical של חלבונים בשרירים ללא פגע. זה מאפשר ניתוח של מבנה רקמת השריר, זיהוי פגמים מורפולוגיים, זיהוי של דפוס הביטוי של שריר / עצב ספציפי חלבונים בשרירים תסיסנית מבוגר. טכניקות אלה יכולים גם להיות שונה במקצת עבור חתך של חלקי גוף אחרים.

זיהוי המנגנונים נזק לשרירים הוא קריטי. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. זה מאפשר ניתוח של מורפולוגיה שרירים לוקליזציה של חלבונים אחרים בתא השריר המרכיבים.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

האפיון המולקולרי של דיסטרופיות שרירים ומיופתיות בבני אדם חשף את מורכבותן של מחלות השרירים, וניתוח גנטי של...

הטכניקה ההיסטולוגית הבאה להכנת חתכים קפואים וחתכים טמיעים בפראפין של שרירי החזה של דרוזופילה מאפשרת גישה רב עוצמה לניתוח מורפולוגיה של השריר וביטוי חלבונים. הדבר משיג תחילה על ידי קיבוע של בעלי החיים בטבעות (collars) ולאחר מכן הטמעה של הרקמה. בפראפין או במדיום OCT, הרקמות המוטמעות נחתכות באמצעות מיקרוטום.לבסוף, נתחים נצבעים כדי להמחיש מבני רקמת שריר או כדי לזהות רכיבים מולקולריים שונים של השרירים. הדגימות המתקבלות, כאשר הן משמשות בשילוב עם שיטות צביעה היסטולוגיות קלאסיות, צבעים פלואורסצנטיים או צביעה אימונולוגית, יכולות להראות את המורפולוגיה של רקמת השריר ואת המיקום של רכיבים ספציפיים לשריר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לשחזר נתחי שריר דקים בתצורה שנמצאת באופן טבעי בתוך בעל החיים.ניתן להתאים שיטה זו בקלות למערכות אחרות, כגון בטן-ראש של Drosophila. היא פותחה במעבדתה של Helena Sheta, המעבדה לביטוי גנים ואיתות, והודגמה היום על ידי Maria Rinko. לשלב הראשון, שמרו את כל התמיסות לטבילת הטבעות בתוך צנצנות צביעה מזכוכית.הכינו מקבע קאר-נויז (Carnoy) טרי על ידי ערבוב של אתנול מוחלט, כלורופורם וחומצה אצטית קרחית ביחסים של שישה לשלושה לאחד, בהתאמה. הכינו ערימה של רדיד אלומיניום, בכיסים בגודל המתאים לצווארונים. הכינו בנוסף את תמיסות האתנול, המתיליקה והפראפין בתוך צנצנות צביעה.כעת הניחו את מיכלי המתיל בנזואט והפרפין באינקובטור המכוון ל-60 עד 65 מעלות צלזיוס. בנוסף, חממו פרפין נוסף ל-60 עד 65 מעלות צלזיוס. כדי למזוג לתוך כיסי רדיד אלומיניום, הצמידו את צווארון הדגימה מתחת למיקרוסקופ בעזרת סרט דביק במצב אנכי, כך שנקודת הכניסה של הזבוב תהיה גלויה.הרדימו את הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני או באמצעות היפותרמיה באמצעות בלוק קרח. היזהרו לא להקפיא את הזבובים בעת השימוש בפינצטה. אספו זבובים בודדים מהכנפיים והניחו כל זבוב בתוך צווארון הקיבוע באופן שראשו וחזהו יהיו מעל הלהבים ובטנו תהיה מתחת ללהבים.הניחו בין 10 ל-20 זבובים בכל צווארון כאשר מנתחים מספר גנוטיפים. רשמו את מספר הצווארון ואת הגנוטיפ התואם לו. העבירו את הצווארון לתמיסת Carnoy וקבעו את הרקמה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה.לאחר הקיבוע, ייבשו את הדגימה על ידי טבילת הטבעה במיקצוצי אתנול בריכוזים עולים למשך 10 דקות בכל שלב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הדגירו את הטבעה במתיל בנזואט ובסמיכת מתיל בנזואט ופרפין למשך 30 דקות בכל שלב, ואז בצעו חדירה של הפרפין לתוך הטבעה בשני החלפות של פרפין למשך 60 דקות לכל אחת. בטמפרטורה של 60 עד 65 מעלות צלזיוס (°C), העבירו במהירות את הטבעה לכיס נייר כסף.בשלב זה, יש למקם את הטבעת בתוך כיסי הרדיד כדי להקל על התמצאות הצמח עבור חיתוכיםlongitudinal או transverse. לאחר מכן, מלאו את הכיסים בפאראפין מומס כדי לאפשר לפאראפין להתגבש. השאירו את כיסי הרדיד בטמפרטורת החדר למשך הלילה.הוציאו את בלוקי הפרפין היבשים עם הטבעות מהנייר המוזהב והפרידו בעדינות את הטבעת מבלוק הפרפין בעזרת סכין מנתחים חדה. גלפו בזהירות את עודפי הפרפין מסביב לרקמת הזבוב במיקרוטום סיבובי. חתכו את בלוק הפרפין במקטעים של 7 עד 10 מיקרון.אפשרו לרקמה החתוכה לצוף בצורה שטוחה באמבט מים בטמפרטורה של 30 °C. לבסוף, הניחו את נתח הרקמה על סליידים פולריים והניחו להם להתייבש למשך לילה. סליידים אלו מוכנים כעת לצביעה ב-hematin ו-eosin.שעה לפני תחילת הניסוי, הניחו את בקבוק תווך הקיבוע לקריוגרפיה (cryo embedding medium) הפוך במקרר בטמפרטורה של 4°C כדי לקריר אותו ולמזער את היווצרותן של בועות אוויר. בנוסף, הכינו מקריר בהטמפרטורה של 60-°C באמצעות אתנול וקרח יבש. בדומה לחתכים בפרפין, קיבעו את הזבובים בתוך צווארון, העבירו את הצווארון עם הזבובים לכיס נייר גזיר שקודר מראש, ומלאו במהירות את החלל ב-OCT, תרכובת הקיבוע לקריוגרפיה.המתינו עד שה-OCT יתגבש. עטפו בזהירות את הבלוק שנוצר בתוך המקרר. הפרידו בעדינות את הטבעת מהבלוק של הדגימה והניחו אותו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפחות. באמצעות מיקרוטום קריו, חתכו את השרירים הקפואים בטמפרטורה שבין 15- ל-18- מעלות צלזיוס, בעובי חתך של 10 עד 15 מיקרון.לאחר מכן, הנח את הדגימות על סליידים מקוטבים. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 20°C- עד למועד העיבוד הנוסף. ניתן לזהות טיפות ליפידים באמצעות צביעת oil red o בחתכים קריו-גניים.תוך שימוש בפרוטוקול המבוסס על seber and tum, זכרו שמיד לפני הצביעה, יש לקבע את החתכים הקפואים ב-4% formaldehyde למשך 10 דקות לאחר הקיבוע. שטפו את השקופיות במים פעמיים, חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, השרו אותן ב-propylene glycol למשך 10 דקות להשגת שיווי משקל.כעת הדגרימו במשך שלוש שעות בשמן. צבעו ב-Red O בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הדגימות פעמיים למשך חמש דקות בפוליפרופילן גליקול, ולאחר מכן למשך 30 דקות ב-PBS. רכבו את הדגימות ב-30% glycerol, וצבעו ב-hematin and eosin חתכים רוחביים ואורכיים של שרירי התעופה העקיפים. הבדילו בין גודל ומורפולוגיה חריגים לבין שרירים בעלי מבנה תקין.ניתן להstain ביעילות גם חתכים טבועים בפאראפין באמצעות נוגדנים, כפי שמוצג בחלק זה של מערכת העיכול של drosophila המוארת עבור הסמן של המעטפת הגרעינית Lamin C וצבע הגרעין dpi. כאן, חתכים רוחביים של thorax של drosophila צבועים ב-anti lamb C וב-DPI כדי להראות מבט מוגדל של שרירים תקינים ושרירים פגומים.באופן דומה, ניתן לצבוע חתכים קפואים לאורכיים של שרירי תעופה עקיפים באמצעות anti distro, glycan muscle, סמן סארקולמה ו-DPI; כאשר צובעים חתכים קפואים רוחביים של חזה דרוזופילה ב-oil red O, מסומנות טיפות ליפידים. שילוב של טכניקות אלו עם שיטות אחרות, כגון צביעת HNE וזיהוי אימונוהיסטוכימי, מציע גישה רבת עוצמה לקביעת מבנה הרקמה ומיקום חלבונים בשרירים.

paraffin-embedded-and-frozen-sections-of-drosophila-adult-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שרירי התעופה של דרוזופילה משמשים כמערכת מודל להתפתחות שרירים ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר את שרירי התעופה של מבוגרים ומדגיש פרוטוקול לניתוח שרירי טיסה עקיפים מתפתחים המתאימים לריצוף RNA מגלמים.

דרוזופילה דיסקציה מאוחרת של שריר התעופה העקיפה של הגלמים (IFM): שיטה לאיסוף רקמות בתפוקה גבוהה

סרטון זה מדגים פרוטוקול להערכת השלמות המבנית של צמתים עצביים-שריריים בשרירי האורך הגביים של דרוזופילה. ההליך כולל צביעת נוירונים ושרירים בשני נוגדנים נפרדים והשוואת דפוסי פלואורסצנטיות בין זבובים מוטנטיים לזבובי בר. הפחתה בכתמים עצביים בזבובים מוטנטיים מצביעה על ניוון עצבי, בעוד מבנה השריר נשאר שלם.

הערכת השלמות המבנית של הצמתים העצביים-שריריים האורכיים הגביים בדרוזופילה

מורפולוגיה, גודל ומיקומם של אברונים תוך-תאיים נשמרים אבולוציונית ונראה כי הם משפיעים ישירות על תפקודם. הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליכים אלה הפכה למטרה חשובה של הביולוגיה המודרנית. כאן אנו מראים כיצד ניתן להקל על מחקרים אלה על ידי יישום טכניקות כמותיות.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

. מדווחים שיטה לכמת שרירים באזור, אשר היא שיטה עקיפה כדי לקבוע את מסת השרירים במבוגרים דרוזופילה . נדגים היישום של המתודולוגיה שלנו על-ידי ניתוח הטיסה עקיף השרירים במודל דרוזופילה ממחלת ניוון שרירים חולים Myotonic.

קביעת אזור שרירים חתך הרוחב אופטי שרירי תעופה עקיף למבוגרים דרוזופילה Melanogaster

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר רגולציה משלימה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכניאולוגיה. אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי ליצור דגימות מועשר מאוד אידיאלי עבור פרוטאומוניקס וברצף עמוק. דגימות אלה יכולות להציע תובנות מכניסטיות חשובות להיבטים מגוונים של פיתוח שרירים.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

למד הכנת חתכי פרפין וקפואים של שרירי בית החזה ב-Drosophila לניתוח מורפולוגיה שרירית ולוקליזציית חלבונים. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מדויקת של מבני שריר ורכיבים מולקולריים במודל ביולוגי חשוב.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

גלה סרטונים נוספים