ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

מאמר זה מתאר את הליך הקמת ויזואליזציה של biofilm חיידקי גדל בתוך שקופית 8-גם תא

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל ביופילמים חיידקיים בבארות של תא Slide. כל באר מחוסנת תחילה בחיידקים במצע הגידול, ולאחר מכן מתורבית ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר היווצרות הביופילמים, נעשה שימוש בצבע חיוני כדי לצבוע את התאים.

לאחר מכן הביופילמים נשטפים ומתקבעים, והבארות נאטמות באמצעות פתק כיסוי. לבסוף, ניתן לצפות בתאים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ומורפולוגיה של ביופילמים שונים המאופיינים . יתרון אחד של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תאי זרימה, הוא שהנפחים קטנים בהרבה ולכן מפחיתים את הכמות של כל תרכובת ניסויית שתשתמש בה.

כמו כן, ניתן להשוות יותר משתנים בבת אחת במגלשה של שמונה בארות בהשוואה לתא זרימה של שלושה תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על מספר שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון קינטיקה של היווצרות ביופילם. שיטה זו יכולה גם לספק תובנה לגבי מחלות מרובות הכוללות מרכיב ביופילם כגון דלקת אוזן תיכונה כרונית, סיסטיק פיברוזיס וזיהומים כרוניים בשלפוחית השתן.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שישנם שלבים רבים שבהם הביופילם הקיים יכול להיות משובש באופן מלאכותי. לכן, הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד הסרה ותוספת של שלבי נוזלים, והסיכוי לשבש את הביופילם עקב כוחות עצומים הוא הגדול ביותר בנקודות אלה בפרוטוקול המדגים את ההליך היום תהיה ליז, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה, חיסון חיידקים במדיום תרבית נוזלית, ולדגור את התרבות עד שהיא מגיעה לשלב העץ האמצעי. לדלל את מתלה שלב העץ האמצעי באחד עד 2, 500 במדיום טרום חם עבור המופילוס אינפלואנזה שאינה ניתנת לסוג, המשמשת בדוגמה זו.

זה יספק 40,000 יחידות יוצרות מושבה למיליליטר כריכוז התחלתי. העבירו באופן אספטי 200 מיקרוליטר של תרבית מדוללת לכל באר של מגלשת תא שמונה בארות סטרילית. דגרו את המגלשה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לחיידקים להתחיל ליצור ביופילמים 16 עד 18 שעות לאחר מכן.

הסר את השקופית מהחממה ושאף את המדיום מפינת כל תא. לאחר מכן החלף אותו ב -200 מיקרוליטר של מדיום טרי חם. הקפד לפזר את המדיום החדש לאורך דופן התאים על מנת למנוע שיבוש הביופילמים.

החזירו את השקופית לחממה ואפשרו לתרבויות לצמוח לצפיפות הרצויה. החלפת המדיום כל שמונה עד 16 שעות כדי לשמור על כדאיות החיידקים. כדי להמחיש את הביופילמים, ראשית, הסירו את חומרי העל של התרבית כפי שתוארו קודם לכן ושטפו בעדינות את הביופילמים פעמיים באמצעות 200 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים.

לאחר שטיפת הביופילמים, הוסף 200 מיקרוליטר של כתם מת חי בתאורה אחורית לכל באר לשקופית אחת של שמונה בארות. הרכיבו בסך הכל שני מיליליטר מתמיסת הכתם. דגרו את השקופית בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

משלב זה ואילך, הקפד להגן על השקופית מפני אור. דגרו את השקופית בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר שהתאים הוכתמו, הסר את הכתם המת החי ושטוף כל באר פעמיים במי מלח.

כפי שהודגם קודם לכן, הוסף 200 מיקרוליטר של פורמין ניטרלי לכל באר ודגר את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות כדי לתקן את הדגימה. לאחר הדגירה הזו, הסר והשליך את הקיבוע ושטוף את הביופילמים פעמיים בעזרת מי מלח, הסר את בארות הפלסטיק מהמגלשה והוסף כ-150 מיקרוליטר מי מלח לכל אחת. כסו היטב את הבארות על ידי הנחת החלקת כיסוי על האטם, וודאו שאין בועות ואטמו את שולי החלקת הכיסוי במדיום הרכבה.

לחלופין, ניתן להשתמש בלק לאיטום החלקת הכיסוי. בדוגמה זו, אנו משתמשים בלק להדמיה טובה יותר של ההליך, אפשרו לאיטום להתייבש בטמפרטורת החדר לפחות שעה לפני בחינת הביופילמים במיקרוסקופ. תמונה זו היא שחזור תלת מימדי של תמונות זאק של ביופילם של שפעת H מוכתם מת שנאסף באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

הביופילם שמוצג כאן הוא דוגמה לביופילם שנוצר על ידי NTHI לאחר 24 שעות של גדילה בשקופית החדר. באמצעות טכניקה זו, החיידקים היו ברי קיימא בזמן הקיבוע כפי שמצוין על ידי הקרינה הירוקה והיעדר הקרינה האדומה. ניתן לראות את הארכיטקטורה של הביופילם בבירור עם מגדלים רבים בתוך מבנה הביופילם ותעלות מים רבות קיימות.

מבט מהצד בפאנל B מדגים את הגובה היחסי של הביופילם שנוצר בנקודת זמן זו. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להוסיף ולהסיר את הנוזלים מהבאר לאט כדי למזער את יצירת הכוחות העצומים שעלולים לשבש את הביופילם הקיים בבאר. על ידי ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון תיוג חיסוני לחלבונים ספציפיים מעניינים או תיוג לקטין על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לרכיבים ביוכימיים הקיימים בתוך המטריצה שנוצרה על ידי החיידקים בביופילם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשקופית תא שמונה בארות כדי לחקור את היווצרותם של ביופילמים חיידקיים.