Name: Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: למד שיטת אלקטרופורציה in vivo לטרנספקציה של תאי גנגליון רשתית בעכברים לאחר הלידה. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת וסימון תאים לחקר התפתחות מערכת הראייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PCAG-gapEGFP הפלסמיד היה מתנה ד&quot;ר ס מקונל (סטנפורד, קליפורניה). pCAG-tdTomato פלסמיד הייתה מתנה מ ד&quot;ר פלר (ברקלי, CA). אנו מודים ד&quot;ר אדוארד Ruthazer עבור מציע את השימוש באסטרטגיה של שתי פלסמיד תיוג תא בודד ואן Schohl (Montreal, QC) עבור אימות שני פלסמיד Cre / loxP אסטרטגיה בלימודי טייס וחברי Crair מעבדה לקבלת תמיכה טכנית. נתמך על ידי R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) ו-NIH P30 EY000785 (MC).

1. ציוד הקמה עבור electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות: אנו שונה דומון # 5 מלקחיים שישמש אלקטרודות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד להתפרק מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוט הלחמה בקצה הרחב של כל שן. עוטפים את החוט המצורף חודי עם סרט בידוד להשאיר כ 25-30 מ"מ של קצה חודי חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את מלקחיים שונה בחזרה יחד עם spacer כלשהו פלסטיק מתאים (למשל כפתור) בין שתי שיני לספק פעולה האביב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד חשמלי: אנו משתמשים ממריץ חשמל כדי לספק פולסים הנוכחית electroporation ועל צג האוסילוסקופ ושמע לאשר את waveform ומספר פולסים מועבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכבל של שן אחת מלקחיים אל דוושת רגל אשר מחובר גם בסדרה עם ממריץ. דוושת רגל משמש מתג. מדוכא כאשר הוא משלים את המעגל עבור electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכבל של שיניים אחרות ממריץ החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את ממריץ את האוסילוסקופ לפקח אודיו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette ו מזרק הגדרת: אנו משתמשים חדה pipettes זכוכית משך ומערכת השנייה Nanoinject מזרק כדי להזריק כמויות קטנות מאוד של צבע או פתרון ה-DNA ישירות לתוך הרשתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר על מערכת ההזרקה micromanipulator 3-ציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך pipettes זכוכית עם להתחדד ארוך טיפ קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרה למלא את משך פיפטה עם שמן מינרלי מאובטחת ההזרקה (לפרטים ראה Nanoinect ידני II הוראה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים microdissecting חדה חתך את קצה פיפטה, יצירת פתח קטן (~ 2-3 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את פיפטה עם כמות הרצויה של פתרון באמצעות הזרקה קצה פיפטה. עוד על שלמות קצה מחזיקה, היא יכולה לשמש עבור זריקות ובעלי חיים רבים. הערה: i) ודא פתרון הזרקת דיו טעון את הטיפים כזה שמן מינרלי backfilled לא מוזרק לתוך העין. ii) II Nanoinject המערכת ואת ציוד אלקטרוני מסוים בשימוש וידאו זה לא קריטי להשגת תיוג מוצלח של RGCs. זריקות עשה עם התקנים אחרים כגון picospritzer ו electroporation עם לגירוי נפוצים אחרים יכולים לשמש גם כדי RGCs התווית. </li></ol></li></ol> 2. פתרונות פלסמיד עבור תיוג RGC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיוג אשכולות קטנים של RGCs: אנו משתמשים בקידוד EGFP לבנות (~ 2-3 מיקרוגרם / μL) משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק) תחת שליטה של מקדם החטיבה (β-אקטין עוף עם האמרגן מיידית CMV משפר מוקדם). EGFP מתויג רצף palmitoylation של GAP-43 (גידול הקשורים חלבון 43) מיקוד אותו קרום התא (mut4EGFP) 12. לבנות זה נקרא pCAG-gapEGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיוג תא בודד: אנו משתמשים בשילוב של שני המבנים. וקטור הראשון הוא מקדם החטיבה נהיגה Cre recombinase (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] פלסמיד 13,775) 13 ואת וקטור השני מכיל קלטת STOP floxed ואחריו קרום ממוקד EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) משמש בריכוז כ 1,000-10,000 פי נמוך יותר pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), כליאת ביטוי EGFP חזקה במספר קטן של תאים (מכוח הנמוך יחסית pCAG-Cre ריכוז). </li></ol> 3. הזרקת הרשתית ואת פרוטוקול electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחרי לידה 0 (P0) כדי גורים P5 מורדמים באמצעות היפותרמיה, ואילו עכברים מבוגרים מאשר P5 מורדמים עם זריקה intraperitoneal (0.7 מ"ל / ק"ג) של קוקטייל של קטמין (4.28 מ"ג / מ"ל), xylazine (0.82 מ"ג / מ"ל) ו acepromazine (0.07mg/ml) 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל מכשירי ניתוח וטיפים אלקטרודה מעקר חרוז חם. מגניב בהמשך הן מלוחים סטריליים לפני השימוש כדי למנוע נזק תרמי לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום העכבר תחת בהיקף לנתיחה ומיקום ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברים צעירים יותר P14 (לפני פתיחת העין), בניתוח לפתוח את העפעף על ידי חיתוך לאורך כל אורכו של פתיחת העפעף עתידי עם מיקרו ב באביב מספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את גלגל העין באופן חלקי לבלוט על ידי הפעלת לחץ בעדינות סביב העין בקצות מלקחיים ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העין במקום על ידי צובט בעדינות את העור סביב העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם micromanipulator ולהביא פיפטה קרוב גלגל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על דוושת רגל, אשר מחובר אל השני Nanoinject המערכת, לגרש כמה טיפות של תמיסת הזרקת ובכך לוודא כי פיפטה לא סתומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם יד אחת מייצבת את גלגל העין, הזז את micromanipulator כזה קצה פיפטה זכוכית חודרת דרך אפיתל הפיגמנט ברשתית ונכנס הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק desכמות ired של פתרון על ידי לחיצה על דוושת רגל למערכת Nanoinject השנייה. לדוגמה, כדי תווית RGCs אחד שאנחנו עושים זריקה אחת של 2.3-4.6nL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת פיפטה ובזהירות מקום טיפים אלקטרודה ישירות על הזריקה ומדכאים הדוושה ברגל ממריץ כדי להשלים את המעגל ואת electroporate את העין. אנו משתמשים בדרך כלל פולסים מרובע עם הגדרות של כוח 25V, משך 50msec, 1sec מזה. 10 פולסים (5 פולסים של הקוטביות אחד) מוחלים על עכברים פולסים מבוגר P4 ו - 6 (3 פולסים של הקוטביות אחד) מוחלים עבור P0 לעכברים P3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות בחזרה לשקע העין וליישם משחת עיניים סטריליות מעל העפעפיים לחתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיות מניחים על משטח חום מבוקר טמפרטורה על התאוששות מלאה, כולל rewarming ניידות נאותה, לחזור חיה לאמא שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בעלי חיים כל 12 שעות לכל סימן של מצוקה וכאב, או אי נוחות, כגון אובדן ניידות, יציבה כשל לא נורמלי או החתן. סיבובים חוזרים ונשנים של, זריקות הרדמה electroporation לא צריך להיות מבוצע על החיה אותו. </li></ol> 4. הערות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטת הזרקה המתואר וידאו זה הוא הזרקה "עיוורת". אפשר לדמיין את כמות ומיקום הזרקה כשעובדים עם עכברים לבקנים ופתרונות בצבע (DiI או פתרון פלסמיד עם כמויות זעירות של כחול מהיר). עם זאת, עם זני עכברים פיגמנט המיקום זריקה לא ניתן דמיינו ישירות ומכאן שקשה לתאר מילולית אם אחד הגיע המיקום המיועד רשתית או כמה רחוק צריך להזיז את פיפטה למקד את השכבה RGC במיוחד. לכן, אנו ממליצים למשתמשים חדשים קודם להתחיל עם זריקות DiI בעכברים לבקנים מאז הזרקות אלה ניתן דמיינו מיד ברשתית ואת תיוג התחזיות RGC אל הרשתית והמוח ניתן להשתמש כדי להעריך את איכות הזריקה. הכן DiI 10% N, N-Dimethylformamide (100%) זריקות מוקד. משתמשים לאחר הליך זה הוא שולט צריכים להיות מסוגלים בעקביות היעד RGCs עם פתרונות ה-DNA ברור פלסמיד בעכברים פיגמנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיטה של הזרקת המתואר וידאו זה יכול לשמש כדי להפוך מוקד זריקות DiI לתייג אוכלוסיות קטנות של תאים ללמוד retinotopy (4.6nL תוויות כמה מאות RGCS) 14 ו RGCs תווית בתפזורת עם fluorophores (Alexa555, 488 וכו ') כדי מצומדות למקטע כולרה ב רעלן ללמוד העין ספציפי הפרדה, למעט השלב electroporation ב # 10 לעיל. נפח מקסימלי הזריקה סך של 2-3uL לעכברים מבוגר P14 ו 1-2uL לעכברים צעירים יותר P14 של כל פתרון מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes ניתן backfilled עם פתרונות להיות מוזרק ואחריו למלא את משבצות עם שמן מינרלי לפני הרכבה פיפטה על מזרק ושבירת קצה. זה שימושי במיוחד בעת השימוש ריכוז גבוה DNA פתרונות (~ 6ug/uL), אשר כללי צמיגה וקשה לטעון מקצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פיפטה זכוכית הופך סמיך, לנגב היטב את קצה פיפטה במקלון צמר גפן טבול במים פתרונות דנ"א אתנול (100%) עבור צבע (DiI) פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקת בעיניים, לסגת קצה פיפטה של ​​גלגל העין ולחץ על דוושת רגל להזריק שוב. זה כדי לאשר את קצה לא מקבל סתומים במהלך תהליך ההזרקה. אם לא הפתרון הוא לוותר, זה סביר כי הזריקה לא הייתה מוצלחת. עם זאת, זה לא צריך לקחת כסימן מוחלט כי הזריקה לא הייתה מוצלחת. הנסיין יכול להזריק את העין שוב אם אתרי הזרקה מרובות וסימון של מספר גדול יותר של תאים הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיוג RGCs יחיד, קבע את מהירות הזריקה להאט על קופסת השליטה Nanoinject. עוד דבר זה מפחית את כמות פתרון מוזרק לתוך הרשתית כמערכת לוקח יותר זמן הגדרה זו כדי לוותר על הפתרון ובמקביל קצה pipettes זכוכית מתבצע חזר מהר מן העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation של יום הלידה 0-3 (P0 ל P3) עכברים דורש טיפול נוסף מאז קל מאוד לפגוע בעין (זה הופך להיות ברור אחרי כמה ימים של התאוששות, כאשר העין היא במופגן קטן יותר מהרגיל). צמצום מספר פעימות מתח להחיל מומלץ לעכברים בילוד מוקדם. לאחר P4, העיניים הם עמידים יותר נזק electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרום הניסיון שלנו גרסאות ממוקד של EGFP או RFP ("gapEGFP", ראה 12) עדיפים בהרבה על ה-GFP ללא שינוי לבחינת תחזיות retinofugal למוח. עם זאת, pCAG-tdTomato, שאין לה קרום שינוי המיקוד, גם עובד היטב (איור 1E). בנוסף, צבעי ניאון dextran מצומדות יכול לשמש גם כדי RGCs התווית באמצעות פרוטוקול electroporation שתוארו לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, 9 מתוך 10 זריקות תוביל RGCs שכותרתו, אם כי רק כ -15% של זריקות עם הגישה הפלסמיד יהיה כפולהתוצאה RGC רק אחד להיות מתויג. מספר מקרים מוצלח יכול להיות מוגברת על ידי הזרקת DNA במקומות רבים בעין אחת או על ידי הזרקת פלסמידים קידוד חלבוני ניאון שונים לתוך כל עין. </li></ol> 5. נציג תוצאות RGC תיוג נצפתה בכל הגילאים, החל P2 ל P25, עם תיוג EGFP ב RGCs על ידי 24 שעות לאחר electroporation ומתוחזק ביטוי במשך לפחות שלושה שבועות לאחר transfection. דנדריטים שכותרתו fluorescently (איור 1 א ', ב') סוכות axonal (איור 1F) של RGCs יחיד ניתן דמיינו בבהירות משוחזר. מלבד RGCs, טכניקה זו יכולה לשמש תווית אחרים סוגי תאים ברשתית כגון תאים אופקיים, תאים דו קוטבית שונים תת תא amacrine (תרשים 1C) שיטה זו אינה מפריעה כמובן הזמן הרגיל של עידון מפה ויזואלית כפי שעולה retinotopy נורמלי SC (איור 1E). בכל גיל, בערך 90% מהמקרים, זריקת נפח קטן (~ 2.3-4.6nL) של pCAG-gapEGFP הביא לידי ביטוי RGCs מעטים (איור 1D). ב 15% של הניסויים באמצעות זריקה אחת של pCAG-Cre pCAG ו-LNL-gapEGFP פלסמידים שילוב לכל חיה, הוביל תיוג נוירון יחיד ברשתית כולל RGCs (איור 1A, B, D) סוגי תאים אחרים כגון amacrine תאים (תרשים 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 - א ', ב' דוגמאות של EGFP שכותרתו אחד התאים הגנגליון ברשתית (ראש החץ מצביע על האקסון) ברשתית שטוח הר ביום שלאחר הלידה 14 (P14) C. דוגמה של תא אחד מהספרים amacrine P8 ב ד.. . מקבץ של נוירונים EGFP רשתית שכותרתו כולל RGCs ותאי amacrine ברשתית שטוח הר ב P14. RGCs א הגבי ו הגחון בעין ימין היו electroporated ומסומן עם EGFP ו RGCs הזמני הגחון בעין שמאל היו electroplated ו שכותרתו עם tdTomato ב P1. אזורי היעד (כוכביות) שיצרו RGCs שכותרתו ניתן לראות את המיקום הנכון טופוגרפית שלהם SC ב P9 (כל הר, מתאר לבן). דוגמה של פ EGFP בודד שכותרתו RGC סוכת (2-D הקרנה) בבית קטע sagittal (250 מיקרומטר עבה) של SC (קו מקווקו). לשם הבהירות, תמונות (ד) ו - (F) הומרו לגווני אפור ו הפוכה. סולם ברים (מיקרומטר): (א) - (ד), (F): 100: (E): 500

<ol><li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li>
<li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li>
<li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+function+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuthazer%2C+ES+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%3A+A+Laboratory+Manual%22">Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual</a>. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.</li>
<li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+ocular+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li>
<li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+proteins%2C+eye+patterning%2C+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים בפרוטוקול electroporation vivo כי התוצאות תיוג של אשכולות יחיד או קטן של נוירונים ברשתית אצל עכברים לאחר הלידה עם בונה DNA קידוד חלבוני ניאון. אשכולות קטנים של תחזיות RGC שכותרתו fluorescently את dLGN ו SC לשכפל דפוסי השלכה דומה כמו במחקרים קודמים באמצעות תיוג RGC עם צבעים lipophilic, המציין electroporation שלא להפריע נורמלי עידון RGC סוכת האקסון. יש לנו שימוש בפרוטוקול זה על מנת לנתח את המפה retinotopic ברמה של שני יחידים וקבוצות של RGCs...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> חומרים </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> חשמל ממריץ </td><td> גראס מכשירים </td><td> דגם S4 </td></tr><tr><td> אוסצילוסקופ </td><td> Agilent </td><td> דגם 54621A </td></tr><tr><td> אודיו לפקח </td><td> גראס מכשירים </td><td> דגם AM8B </td></tr><tr><td> חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-97 </td></tr><tr><td> Vannas מספריים </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> מיקרו מספריים ב </td><td> טד פלה </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> דומון AA מלקחיים ג </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II מערכת </td><td> דראמונד מדעי </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> זכוכית pipettes </td><td> דראמונד מדעי </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> דוושת רגל </td><td> דראמונד מדעי </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> שמן מינרלי </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamide </td><td> סיגמא </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי in vivo electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

מיקוד ועידון של תחזיות RGC אל המוח התיכון, היא מערכת מודל פופולרי ורב עוצמה ללימוד כיצד דפוסים מדויקים של טופס קישוריות עצבית במהלך ההתפתחות. בעכברים, תחזיות retinofugal מסודרים בצורה טופוגרפית ובצורה ספציפית עין שכבות בגרעין הברכיתי הרוחב (dLGN) של התלמוס ואת Colliculus מעולה (SC). הפיתוח של דפוסים אלה המדויק של תחזיות retinofugal יש בדרך כלל נחקרה על ידי תיוג אוכלוסיות RGCs עם צבעים קליעים נותבים ניאון, כגון peroxidase חזרת 1-4. עם זאת, שיטות אלו גס גם כדי לספק תובנה לגבי שינויים התפתחותיים אצל אדם מורפולוגיה RGC סוכת axonal כי הם הבסיס של היווצרות המפה retinotopic. הם גם אינם מאפשרים מניפולציה גנטית של RGCs. לאחרונה, electroporation הפכה שיטה יעילה עבור מתן שליטה במרחב ובזמן מדויק עבור משלוח של מולקולות טעונים לתוך הרשתית 5-11. שוטפים ופרוטוקולים electroporation ברשתית אינם מאפשרים מניפולציה גנטית מעקב אחר תחזיות retinofugal מקבץ קטן של יחיד או RGCs בעכברים לאחר הלידה. נטען כי לאחר הלידה ב electroporation vivo אינה שיטה מעשית עבור transfecting RGCs מאז יעילות תיוג הוא נמוך ביותר, ולכן דורש מיקוד בגילאים עובריים, כאשר אבות RGC עוברים בידול ריבוי 6. בסרט זה אנו מתארים בפרוטוקול electroporation vivo למסירה ממוקד של גנים, shRNA ו dextrans ניאון RGCs Murine אחרי הלידה. טכניקה זו מספקת חסכוני, מהיר פלטפורמה קלה יחסית לסינון יעיל של גנים מועמדים מעורב בכמה היבטים של ההתפתחות העצבית כולל נסיגת האקסון, מסתעפת, למינציה, התחדשות היווצרות הסינפסה בשלבים שונים של פיתוח מעגל. לסיכום נתאר כאן כלי רב ערך אשר יספקו תובנות נוספות המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח המפה חושית.

אנו מדגימים<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation פרוטוקול transfecting אשכולות יחיד או קטן של תאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ושאר סוגי תאים ברשתית אצל עכברים לאחר הלידה על פני טווח רחב של גילאים. היכולת התווית גנטית לתפעל RGCs לאחר הלידה<em&gt; In vivo</em&gt; הוא כלי רב עוצמה למחקרים התפתחותיים.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

המיקוד והדיוק של השליחות של תאי רשתית גנגליוניים (RGC) אל הגב המוח הם מערכת מודל נפוצה וחזקה לחקר האופן שבו תבניות מדויקות של רשתות עצביות...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבצע טרנספקציה של תאי גנגליון רטינליים בודדים או של קבוצות קטנות של תאים באמצעות אלקטרופורציה in vivo בעכברים לאחר הלידה, וזאת כדי לחקור את התפתחותן של השליחות הרטינליות. פעולה זו מושגת על ידי חשיפה כירורגית של גלגל העין והזרקה של נפח קטן של תמיסת פלסמיד DNA ישירות לרשתית. כשלב שני, מונחים אלקטרודות על גלגל העין ישירות מעל אתר ההזרקה, ומועברים פולסים חשמליים המאפשרים את העברת ה-DNA הפלסמידי אל תוך נוירוני הרשתית.בשלב הבא, בגיל הרצוי, קוצרות הרשתיות והמוחות שעברו אלקטרופורציה כדי להמחיש תאי גנגליון של הרשתית שעברו טרנספקציה וההשלכות שלהם אל מערכת העצבים המרכזית (CNS); התוצאות המתקבלות מראות סימון פלואורסצנטי הן של הדנדריטים והן של ה-ARBs האקסונליים של תאי גנגליון רשתית מסומנים במבני היעד התת-קורטיקליים השונים שלהם. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרופורציה רשתית בתוך הרחם (in-utero), הוא שטכניקה זו פחות פולשנית ואינה מפריעה לאירועי הדרכה מוקדמים של אקסונים, כגון ההצטלבות בכיאסמה האופטית. היא גם מאפשרת לנו לסמן אוכלוסייה קטנה או תאי גנגליון רשתית בודדים בעכברים לאחר הלידה, תוך בקרה מרחבית וזמנית מדויקת.כדי להכין אלקטרודות לאלקטרופורציה, שברו שינוני אחת מזוג פינצטות Dumont מספר 5, ולאחר מכן הלחימו חוט לבסיס של כל שינוני. עטפו את בסיס החוטים בבידוד, סרט הדבקה, והתאימו מפריד פלסטיק בין השינוניות כדי לספק פעולת קפיץ. לאחר הרכבת האלקטרודות, חברו את החוט מאחת השינוניות לדווסת הרגל, המחוברת בטור למעורר החשמלי.בעת לחיצה על דוושת הרגל, זורם זרם דרך האלקטרודות. לאחר מכן, חברו את החוט מהפין השני למעורר החשמלי. ולבסוף, חברו את המעורר החשמלי לאוסצילוסקופ ולמסך שמע.התקינו את מערכת ההזרקה על מיקרו-מניפולטור בעל שלושה צירים על השולחן באמצעות שובב פיפטות. הכינו פיפטות זכוכית משובבות בעלות היטיה ארוכה וקצה קטן, באמצעות המחט המסופקת עם ה-nano Inject two. מלאו את הפיפטה המשובבת בשמן מינרלי מהקצה האחורי והדקו אותה למיקרו-מזרק.באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה חדים, גזרו את קצה הפיפטה המורכבת כדי ליצור פתח של שני עד שלושה מיקרומטר. מלאו את הפיפטה בתמיסת ההזרקה על ידי שאיבתה דרך הקצה הפתוח.הרדימו גורי עכברים בני 4 עד 5 ימים לאחר הלידה באמצעות היפותרמיה. ודאו את מצב ההרדמה באמצעות צביטה של בהו הבוהן. הניחו את העכבר המורדם תחת מיקרוסקופ דיסקסציה ובצעו פתיחה כירורגית של העפעף על ידי חיתוך לאורך הפתיחה העתידית של העפעף בעזרת מספרי מיקרו-דיסקסציה, והבקיעו את גלגל העין על ידי הפעלת לחץ עדין מסביב למסגרת העין בעזרת פינצטה.מקמו את הפיפטה סמוך לגלגל העין באמצעות כיוון המיקרו-מניפולטור. לחצו בעזרת יד אחת על דום הרגל של מערכת המיקרו-הזרקה כדי לוודא שקצה הפיפטה אינו סתום. ייצבו את גלגל העין הבולט על ידי לחיצת העור מסביב למשבצת העין בעזרת פינצטה ביד השנייה.הזיזו את המיקרו-מניפולטור כך שהפיפטה תחדור דרך אפיתל הפיגמנט הרשתית ותיכנס לרשתית. הניחו את כמות התמיסה הרצויה על ידי לחיצה על דוושת הרגל, החזירו את הפיפטה והניחו את קצות האלקטרודות ישירות מעל אתר ההזרקה. בשני צדי גלגל העין, במגע עם הפני השטח, לחצו על דוושת הרגל המחוברת לממריץ כדי להשלים את המעגל ולהעביר גירוי חשמלי לגלגל העין.דחפו בעדינות את גלגל העין חזרה לתוך המחסור שלה ומריחו פומדה אופתלמית על החתך. הניחו את העכברים על משטח חימום המוחזק בטמפרטורה של 36 °C עד שיחזרו להם ההערות, והחזירו אותם לאמם רק במקרה של טרנספקציה ל-RG CS. שניהם, הפלסמיד והמקודד ל-Cree Recombinase ו-flock stop EGFP, מסוגלים להתבטא.סימון תאים בודדים באמצעות EGFP מושג הודות לריכוזו הנמוך יחסית של פלסמיד Cree שנעשה בו שימוש. ניתן להמחיש תא עצב רשתית גנגליוני (RG), דנדריטים ואקסונים מסומני EGFP ברשתית המורכבת מהרכבה שטוחה (flat mount). ניתן לסמן בטכניקה זו גם סוגים אחרים של תאי רשתית, כגון תאי starburst ו-omicron. כאן אנו רואים דוגמה לצבר של נוירוני רשתית מסומני EGFP, הכולל תאי RG, CS ותאי omicron, ברשתית בהרכבה שטוחה ביום ה-14 לאחר הלידה.באמצעות טכניקה זו, נוכל לנתח את הת targeting של RG CS ברשתית ב-whole mount של superior colliculus מכל ארבעת הקואורדינטות המרכזיות של הרשתית באותה עכבר. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע טכניקה זו בארבע עד חמש דקות אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבצעים הזרקות מוקדיות של תמיסות כגון plasma DNA לרשתית לאחר הלידה, וטרנספקציה in vivo של נוירונים ברשתית באמצעות electroporation.

transfection-mouse-retinal-ganglion-cells-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על...

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה וזולה לכמת את הפעילות של cis-הרגולציה אלמנטים (כלומר, משפר / היזמים) לחיות הרשתיות העכבר דרך electroporation explant. הכנת ה-DNA, דיסקציה רשתית, electroporation, תרבות explant רשתית, שלאחר קיבוע ניתוח וכימות מתוארים.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית...

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

הליך זה מראה כיצד למקד אינטרנוירונים במוח הקדמי של העכבר המתפתח באמצעות אלקטרופורציה ברחם. טכניקה זו הייתה יעילה במיוחד להשגת ביטוי גנים סלקטיבי בתת-סוגים בין-נוירונים המיועדים לשכבות השטחיות של קליפת המוח.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: אקס-אוב גישת Electroporation

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

זריקות תת-רשתית הן טכניקה הכרחית לפיתוח פרה-קליני של טיפולים למחלות קולטני אור ו-RPE. אנו מתארים טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית אופטימלית בעכברים המשפרת את שיעורי ההצלחה תוך ניתוחיים וממזערת נזק לרשתית.

טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית זעיר פולשנית אופטימלית בעכבר

למד שיטת אלקטרופורציה in vivo לטרנספקציה של תאי גנגליון רשתית בעכברים לאחר הלידה. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת וסימון תאים לחקר התפתחות מערכת הראייה.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

גלה סרטונים נוספים