Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעביר קבוצות בודדות או קטנות של תאי גנגליון ברשתית באמצעות אלקטרופורציה in vivo בעכברים לאחר לידה כדי לחקור את התפתחות הקרנות הגנגליון ברשתית. זה מושג על ידי חשיפה כירורגית של גלגל העין והזרקת נפח קטן של תמיסת DNA פלזמה ישירות לרשתית. כשלב שני, אלקטרודות מונחות על גלגל העין ישירות מעל אתר ההזרקה, ומופעלים פולסים חשמליים, המאפשרים העברת DNA פלזמה לנוירונים ברשתית.

לאחר מכן, בגיל הרצוי, רשתית ומוחות אלקטרופוטיים נקצרים כדי לדמיין תאי גנגליון רשתית שעברו טרנספטציה ומתקבלות הקרנות שלהם לתוצאות מערכת העצבים המרכזית המציגות תיוג פלואורסצנטי הן של דנדריטים והן של ARBs אקסונליים של תאי גנגליון רשתית מסומנים במבני המטרה התת-קורטיקליים השונים שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו אלקטרופורציה של רשתית בתוך הרחם, הוא שטכניקה זו פחות פולשנית ואינה מפריעה לאירועי הנחיית אקסונים מוקדמים, כגון חצייה בכיאזמה האופטית. זה גם מאפשר לנו לתייג אוכלוסייה קטנה או תאי גנגליון רשתית בודדים בעכברים לאחר לידה עם בקרה מרחבית וזמנית מדויקת.

כדי ליצור אלקטרודות לאלקטרופורציה, שברו חוד אחד מזוג מלקחיים של דומונט מספר חמש, ולאחר מכן הלחמו חוט בבסיס כל חוד. עטפו את הבסיס בחוטים עם בידוד, סרט והתאימו מרווח פלסטיק בין השיניים כדי לספק פעולת קפיץ. לאחר הרכבת האלקטרודות, חבר את החוט מחוד אחד לדוושת כף הרגל, המחוברת בסדרה לממריץ החשמלי.

כאשר לוחצים על דוושת הרגל, זרם זורם דרך האלקטרודות. לאחר מכן, חבר את החוט מהשיניים השני לממריץ החשמלי. ולבסוף, חבר את הממריץ החשמלי לאוסילוסקופ ולצג השמע.

התקן את מערכת המזרק על מיקרו מניפולטור בעל שלושה צירים בספסל באמצעות מושך פיפטה. הכינו פיפטות זכוכית משוכות עם מתחדד ארוך וקצה קטן באמצעות מחט המסופקת עם הזרקת הננו שתיים. מלאו פיפטה משוכה בשמן מינרלי ואבטחו אותה למזרק המיקרו.

בעזרת מספריים חדים של מיקרו-דיסקציה. חותכים את קצה הפיפטה המותקנת ליצירת פתח של שניים עד שלושה מיקרומטר. מלאו את הפיפטה בתמיסת הזרקה על ידי משיכתה כלפי מעלה דרך הקצה הפתוח.

עכברים מרדימים קופצים ב-H ארבעה עד חמישה ימים לאחר הלידה על ידי היפותרמיה. ואשר את מצב ההרדמה באמצעות צביטה בבוהן. הנח את העכבר המורדם מתחת לטווח ניתוח ופתח את העפעף בניתוח על ידי חיתוך לאורך העפעף העתידי פתיחה עם מספריים מיקרו-דיסקציה, הבלטת גלגל העין על ידי הפעלת לחץ עדין סביב ארובת העין בעזרת זוג מלקחיים.

מקם את הפיפטה ליד גלגל העין על ידי כוונון המניפולטור המיקרו. לחץ על דוושת הרגל של מערכת המיקרו-הזרקה כדי לוודא שקצה הפיפטה אינו סתום ביד אחת. ייצב את גלגל העין הבולט על ידי צביטה של העור סביב ארובת העין בעזרת מלקחיים עם השני.

הזז את המניפולטור המיקרו כך שהפיפטה חודרת דרך פיגמנט הרשתית, האפיתל ונכנסת לרשתית. הוצא את כמות התמיסה הרצויה על ידי לחיצה על דוושת הרגל, משוך את הפיפטה והנח את קצות האלקטרודה ישירות מעל מקום ההזרקה. משני צידי גלגל העין רק נוגע במשטח, לחץ על דוושת הרגל המחוברת לסטימולטור כדי להשלים את המעגל ומצעד אלקטרו את גלגל העין.

דחפו בעדינות את גלגל העין בחזרה לארובה והניחו משחה עיניים על החתך. הניחו את העכברים על כרית חימום המתוחזקת בטמפרטורה של 36 מעלות צלזיוס עד שהם חוזרים להכרה והחזירו אותם לאמם רק RG CS שעבר טרנספטציה. עם פלסמיד וקידוד עבור Cree Recombinase ועצירת צאן EGFP מסוגלים לבטא.

תיוג תא בודד של EGFP מושג בזכות הריכוז הנמוך יחסית של פלסמיד Cree המשמש EGFP המסומן בגנגליון רשתית יחיד, ניתן לדמיין דנדריטים ואקסונים של תאים ברשתית שטוחה. ניתן לתייג סוגים אחרים של תאי רשתית כגון תאי אומיקרון מתפרצים בטכניקה זו. כאן אנו רואים דוגמה לאשכול של נוירונים ברשתית, כולל תאי RG CS ואומיקרון ברשתית שטוחה ביום ה-14 שלאחר הלידה.

באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לנתח מיקוד נושא רשתית של RG CS בהר שלם קולוס מעולה מכל ארבע קואורדינטות הרשתית העיקריות באותו עכבר לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע עד חמש דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הזרקות מוקדיות של תמיסות כגון DNA פלזמה לרשתית שלאחר הלידה והעברה in vivo של נוירונים ברשתית באמצעות אלקטרופורציה.