Name: טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: למד מדידת פלישת תאים סרטניים דרך שכבת תאי אנדותל בזמן אמת באמצעות חישום חשמלי. השיטה מחקה תהליכי גרורה בגוף החי ומספקת נתונים כמותיים מדויקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בנדיבות על ידי כספים מהקרן לילדים סרטן (בולטימור, MD), ברנדון לי קרינגטון קרן (סילבר ספרינג, מרילנד), DOD (W81XWH-10-1-0137) ו-NIH (R01CA108641). ברצוננו להודות לד&quot;ר אנטון Wellstein וחברי המעבדה שלו לשיתוף הניסיון שלהם ועוזר לנו לייעל את השיטות שהוצגו.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים במכסת מנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחנת xCELLigence ממוקמת 37 מעלות צלזיוס חממה בנוכחות של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאי HUVEC מעבר נמוכים, רצוי לא יותר מ 6 מעבר. כמו כן, ודא כי התאים הם לא יותר מ 75% ומחוברות בזמן קציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי HUVEC גדלים בתקשורת EGM-2 מחדש עם ערכת EGM-2 כדור (Lonza Biosciences) המכילה גורמי גדילה, תוספי מזון ו5% בסרום שור העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל העקבות של טריפסין יש להסיר מהשעיות תא על ידי תאים מסתובבים ב200xg, שטיפת פעם עם PBS, וresuspending לצפיפות תאים מצוינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> xCELLigence מעיל E-צלחת 16 עם 0.1% ג'לטין במשך שעה 1 ב 37 ° C או הלילה ב 4 ° C. לשטוף צלחת עם PBS ולהוסיף EGM-2 המשוחזרת 100μL תקשורת. לבצע קריאה ריקה במערכת xCELLigence למדוד רקעעכבה בהעדר תאים. </li></ol> 2. יצירת HUVEC monolayer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר בקבוק תת ומחוברות של תאי HUVEC ידי trypsinization. תאי Resuspend בEGM-2 מדיה המשוחזרת לצפיפות סופית של 2.5 x 10 5 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היטב בכל רקע מכויל דואר צלחת המכיל EGM-2 מדיה 100μL, להוסיף 100μL של ההשעיה תא HUVEC (2.5 10 4 תאי HUVEC X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להתקין דואר פלייט במכשיר xCELLigence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת xCELLigence תכנית לבצע קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לתאי אנדותל לגדול במשך 18-21 שעות עד שהם יוצרים monolayer, כפי שמעיד על ידי השטחה של מדד תא (איור 2). </li></ol> 3. תוספת של פולשים לתאים ונורמליזצית נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שmonolayer HUVEC יציב יצרה, תאים סרטניים על ידי קציר trypsinization וresuspend למאורות סופייםity של 1 x 10 5 תאים / מ"ל בתקשורת משמשת לגידול תאים סרטניים (כמו RPMI או מדיה DMEM המכיל 10% FBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריאות עכבת הפסקה על תוכנת xCELLigence ולהסיר דואר פלייט מהתחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת EGM-2 על ידי שאיפה. הוסף 100μL של השעיה תא גידול המכילה 1 x 10 4 תאים. באופן כללי, יחס 1:2.5 של תאים סרטניים: בתאי אנדותל זורעים, עובד הכי טוב עבור assay. עם זאת, היחס יכול להיות מותאם לשורות תאים בודדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את דואר הצלחת על מערכת xCELLigence בחממה ולהמשיך קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלישה יכולה להיות במעקב בזמן אמת על 6-12 שעות הקרובות כמו ירידה במדד תא בשל הנסיגה של הצמתים אנדותל וחדיר של פולשים לתאים סרטניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את התוצאות לזמן של תוספת של פולשים לתאים סרטניים. התוכנה מאפשרת xCELLigence נורמליזציה לכל נקודת זמן ותוצאותניתן לצפות ישירות בחלון התוכנה. </li></ol> 4. נציג תוצאות: דוגמה לפלישת monolayer HUVEC ידי תאים גרורתי ולא גרורתי מוצגת באיור 3. K7M2 הוא שורת תאי אוסטאוסרקומה גרורתי. תאים אלה מבטאים רמות גבוהות של חלבון ezrin מקשר cytoskeletal, המהווה את המאפיינים פולשני של קו תא זה 13,14. כאשר תאי HUVEC מאותגרים עם K7M2 תאים, יש ירידה בהתנגדות חשמלית בתוך 6 שעות. ירידה זו בהתנגדות חשמלית מייצגת את הפלישה לmonolayer HUVEC על ידי תאי הגידול הפולשים. תא אונליין K12, לעומת זאת, מבטא רמות נמוכות יותר של ezrin וכתוצאה מכך היא פחות גרורתי 13. מאתגר את monolayer HUVEC עם תוצאות K12 תאים בירידה תלולה פחות בהתנגדות כמו התאים אינם מסוגלים לדבוק או לפלוש דרך monolayer HUVEC (איור 3). <imgsrc files></imgsrc> איור 1. תרשים סכמטי של תהליך זרימת עבודה לפלישה של תאי האנדותל ידי תאי גידול. תאי HUVEC הם מצופים ב E-צלחות מצופים ג'לטין ואפשרו ליצירת monolayer מחוברות. תאים ממאירים מתווספים פעם monolayer יצרה ופלישה מנוטרת בזמן אמת כמדד התא משתנה עקב פלישה של monolayer אנדותל. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. היווצרות monolayer HUVEC. שינויים במדד תא כתאי HUVEC לצרף ולהתפשט על אלקטרודות זהב ג'לטין מצופות. היווצרות monolayer ומחוברת מיוצגת על ידי התייצבות במדד תא לאחר 18 שעות. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. פלישה של תאי HUVEC ידי K7M2 וK12 תאי אוסטאוסרקומה. ירידה חדה בcelL-מדד מתרחש בתוך כמה שעות של ההקדמה של K7M2 תאים גרורתי מאוד. K12 תאים, לעומת זאת, הם פחות גרורתי ולא מצליחין לחדור monolayer האנדותל בצורה יעילה ככל K7M2 תאים. זה מיוצג על ידי ירידה פחות חדה במדד תא כאשר monolayer HUVEC הוא קרא תיגר עם K12 תאים. שליטה מייצגת עכבה של monolayer HUVEC בהיעדרם של תאים סרטניים. ניסויים בוצעו בשלושה עותקים.

<ol><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+The+metastasis+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. The metastasis cascade.</a> Science. 321, 1785-1787 (2008).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).</li>
<li>Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+cancer+cells+and+the+endothelium+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis.</a> J Pathol. 190, 310-329 (2000).</li>
<li>Bacac, M., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic cancer cell.</a> Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).</li>
<li>Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+signals+from+the+invasive+front%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New signals from the invasive front.</a> Nature. 441, 444-450 (2006).</li>
<li>Kramer, R. H., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+tumor+cells+with+vascular+endothelial+cell+monolayers%3A+a+model+for+metastatic+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li>
<li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time%3A+assessment+of+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).</li>
<li>Whipple, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+promotes+tubulin+Detyrosination+and+Microtentacles+that+enhance+endothelial+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement.</a> Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).</li>
<li>Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-microelectronic+sensing+technique+for+profiling+cytotoxicity+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals.</a> Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).</li>
<li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li>
<li>Ren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-cytoskeleton+linker+protein+ezrin+is+regulated+during+osteosarcoma+metastasis+by+PKC%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC.</a> Oncogene. 28, 792-802 (2009).</li>
</ol>

עלות הפרסום לכתב היד הזה היה מספק בנדיבות על ידי חברת רוש מדע יישומי.

Assay פלישת HUVEC בזמן אמת הוא שיטה פשוטה, אך רב עוצמה לניטור פלישה. הוא מספק תוצאות בזמן אמת, שהוא יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות אחרות המסתמכות על ניתוח נקודת סיום. Assay יכול להיות שונה כדי בדיקת סמים, נוגדנים, ligands וחלבונים כמעכבים או stimulators של גרורות. ההשפעה של סוכנים שונים על תא האנדותל / הסרטן צולב שיחה ניתן להעריך גם כן. כאשר מציגים את הסוכנים חיצוניים, כגון גורמי גדילה ותרופות בתקשורת ובתרבות, חשוב לוודא שהם אינם משפיעים על שלמות monolayer HUVEC. שיבוש monolayer HUVEC ניתן לבדוק על ידי החדרת סוכן אקסוגני בהיעדרו של פולשים לתאים, ולהבטיח כי לא יחולו שינוי במדד תא. לפיכך, שליטה ובקרה נאותה צריכה להיכלל כחלק מעיצוב ניסיוני. שונה סלולריים קווים להפגין עקומות תא מדד שונות כפי שהם יוצרים confmonolayer luent. הצורה של העקומה, כמו גם את המקסימום השיג תא מדד, היא סוג תא מסוימת. תאי HUVEC להראות אופייני השטחה של מדד תא חולף 4-6 שעות לאחר זריעה, ואחרי ייצוב נוסף במדד תא גבוה יותר לאחר 16-18 שעות. לפיכך, חשוב לתת לתאים בצורה monolayer ומחוברת ללפחות 18 שעות לפני התוספת של תאים סרטניים. מאז מדד התא תלוי בסביבה יונית בשלבי ביניים אלקטרודה / תא, גורמים שונים, כגון תאי מורפולוגיה ואיכות של הידבקויות תאי תאים להשפיע על תאי המדד, בנוסף לאזור התחתון המכוסה היטב. לכן, הירידה במדד תא, אשר מתרחשת על פלישת תאי גידול, היא פונקציה של מספר גורמים, הכוללים נסיגה של צמתים האנדותל ופלישת תא גידול שלאחר מכן. מכשיר xCELLigence מיוצר בשלוש תצורות שונות: מנתח סלולרי בזמן אמת(RTCA) SP, RTCA MP וRTCA עקורים. מכשיר SP RTCA מחזיק אחד E-96 גם צלחת ואילו מכשיר MP RTCA יכול להכיל עד שישה 96, גם E-צלחות בו זמנית. זה מאפשר להקרנת תפוקה גבוהה של תרופות ותרכובות. את הניסויים במאמר זה מבוצעים באמצעות המכשיר העקורים RTCA, שיכול להחזיק שלוש צלחות E-16-כן. כל תחנת דואר צלחת החזקה יכולה להיות מופעלת באופן עצמאי, המאפשרת למשתמשים מרובים כדי להריץ ניסויים בו זמנית. המכשיר העקורים RTCA יכול לשמש גם כדי ללמוד הגירה באמצעות CIM צלחות. אלה הם 16 צלחות היטב עם תאים עליונים ותחתונים מופרדים בפוליאתילן terephtalate (PET) קרום עם גודל נקבובית החציוני של 8um. החיישנים האלקטרוניים הממוקמים בחלק התחתון של הקרום הנקבובי של החדר העליון. התא התחתון משמש כמאגר לchemoattractant לתאים בחדר העליון. עם זאת, יתרון גדול של assay פלישת HUVEC על CIM הצלחות הוא שפלישת תא גידול בי לשעברזה לא מוגבל על ידי הגודל הנקבובית, כמו פלישת תא אנדותל תלוי בצולבת שיחה בין התאים הסרטניים ואנדותל. Assay פלישת HUVEC יכול גם להתבצע במכשיר Z ECIS, המיוצר על ידי אפלייד ביופיסיקה (טרוי, ניו יורק). מכשיר Z ECIS מנצל טכנולוגיה דומה למכשיר xCELLigence, עם הבדלים בתצורות המערך ואלקטרודה. יש לנו לבצע בהצלחה מבחני פלישת HUVEC באמצעות מערכי ECIS 8-כן. חשוב לציין כי שטח הפנים התחתון גם הוא גדול יותר במערכי ECIS, אשר דורש מספר גדול יותר של תאי האנדותל וגידול להיות מצופה: 2.5 x 10 5 ו 1 x 10 5 תאי בהתאמה.

<table><tbody><tr><td>תחנת xCELLigence RTCA DP</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> קבוצת Roche</a></td><td>05469759001</td><td></td></tr><tr><td>יחידת בקרה של RTCA</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> קבוצת Roche</a></td><td>05454417001</td><td>מחשב נייד עם תוכנת RTCA מותקנת מראש</td></tr><tr><td>E-Plate 16</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> קבוצת Roche</a></td><td>05469830001</td><td></td></tr><tr><td>תאי HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>מצע EGM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כדורים EGM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>0.1% ג'לטין ב-H סטרילי&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD Millipore</td><td>MCPROTO045</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

הפצה גרורתי של תאים ממאירים דורשת פירוק של קרום במרתף, התקשרות של תאים סרטניים להאנדותל של כלי דם, נסיגה של צמתים האנדותל וסופו של דבר פלישה והגירה של תאים סרטניים באמצעות שכבת האנדותל כדי להיכנס למחזור הדם כאמצעי תחבורה לאתרים מרוחקים בשורה 1-3. פעם אחת במערכת הדם, תאים סרטניים לדבוק נימי קירות וextravasate לרקמה שמסביב כדי ליצור גידולים גרורות 4,5. הרכיבים השונים של אינטראקציה תא תא האנדותל גידול יכולים להיות משוכפלים במבחנה על ידי מאתגר monolayer של תאים אנושיים טבור וריד אנדותל (HUVEC) עם תאים סרטניים. שבוצעו עם אלקטרונים ומיקרוסקופ שלב בניגוד מחקרים מראים כי ברצף של אירועי מבחנה למדי לייצג את in vivo תהליך גרורתי 6. כאן, אנו מתארים טכניקה מבוססת חשמל, המנטרת את עכבה ומכמתת בזמן אמת על invasיון של תאי האנדותל ידי תאי גידול ממאירים. Giaever וKeese תוארו לראשונה טכניקה למדידת תנודות בעכבה כאשר אוכלוסייה של תאים גדלות על פני השטח של אלקטרודות 7,8. מכשיר xCELLigence, המיוצר על ידי חברת רוש, מנצל טכניקה דומה כדי למדוד שינויים בעכבה חשמלית כתאים לצרף ולהתפשט בצלחת התרבות מכוסות במערך microelectrode זהב המכסה כ -80% משטח בתחתית באר. ככל שתאים לצרף ולהתפשט על פני האלקטרודה, זה מוביל לעלייה בעכבה חשמלית 9-12. העכבה מוצגת כפרמטר נקרא תא מדד חסר ממדים, העומדים ביחס ישר לשטח הכולל של רקמות התרבות היטב כי הוא מכוסה על ידי תאים. לפיכך, ניתן להשתמש בתאי המדד לפקח הידבקות תא, מתפשט, מורפולוגיה וצפיפות תאים. Assay הפלישה מתואר במאמר זה מבוסס על שינוייםבעכבה חשמלית באלקטרודה ביניים / תא, כאוכלוסייה של תאים ממאירים לפלוש דרך monolayer HUVEC (איור 1). שיבוש צמתים אנדותל, ההכחשה של monolayer האנדותל והחלפה על ידי תאים סרטניים יוביל לשינויים גדולים בעכבה. שינויים אלו לתאם ישירות עם הקיבולת פולשנית של תאים סרטניים, כלומר, פלישה על ידי תאים אגרסיביים מאוד להוביל לשינויים גדולים בעכבת תא ולהיפך. טכניקה זו מספקת יתרון כפול על פני שיטות קיימות של מדידת פלישה, כגון וידן הקאמרית ומבחני Matrigel: 1) האינטראקציה תא תא האנדותל גידול מחקה באופן הדוק יותר בתהליך vivo, ו2) הנתונים מתקבל בזמן אמת, זמן, והוא בקלות רבה יותר לכימות, בניגוד לניתוח נקודת סיום לשיטות אחרות.

מאמר זה מתאר<em&gt; במבחנה</em&gt; טכניקה לתאים סרטניים באמצעות ניטור הפולש monolayer של תאי האנדותל. הנתונים שנרכשו בזמן אמת כפונקציה של שינויים בעכבה על פני השטח של אלקטרודות בתחתית היטב.

הפצה מטאסטטית של תאים ממאירים דורשת פירוק של קרום הבסיס, היצמדות של תאי גידול לאנדותל כלי דם, נסיגה של...

סרטון זה מדגים שיטה לניטור פלישת תאי סרטן אל תוך שכבה חד-שכבתיות (monolayer) של תאי אנדוothelium באמצעות טכניקה מבוססת עכבה חשמלית בזמן אמת. ראשית, תאי אנדוothelium של וריד טבילית אנושי, המכונים VE, מושקעים ב-EPLs בעלי 16 בארות המצופים באלקטרודות זהב בתחתית הבארה. כדי ליצור שכבה חד-שכבתיות רציפה, מוסיפים תאי סרטן, הנצמדים ל-VE ופולשים לשכבת ה-HVAC תוך שהם משבשים את החיבורים בין תאי האנדוothelium. לאחר מכן נלקחות קריאות עכבה, התלויות בשטח הכולל של תחתית הבארה המכוסה בתאים.ניתן לקבוע את מידת הפלישה על בסיס שינויים בעכבה החשמלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות תאי חלל (void chamber) ו-METROGEL, הוא שאינטראקציות בין תאי אנדותל לתאי גידול מדמות באופן קרוב יותר את תהליך הגריעות (metastatic process) in vivo, והנתונים מתקבלים בזמן אמת וניתנים לכימות בקלות רבה יותר בהשוואה לניתוח נקודת סיום (endpoint analysis) בשיטות אחרות. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פלישת תאי סרטן.ניתן להחיל זאת גם על מערכות אחרות, כגון חקירת אינטראקציות בין תאים במערכת החיסון. יתרה מכך, את השלב הראשוני של הניסוי, שבו אנו צופים בצמיחת תאי UX, ניתן להשתמש בו להערכת השכפול התאי של כל קו תאים ללא צורך בשלבי פלישה נוספים; את הפרוצדורה תדגים സൈט רחים, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. את כל שלבי פרוטוקול זה יש לבצע בתנאים סטריליים בתוך מנדף לתרבית רקמות.מערכת ה-Xcel ששימשה בניסוי זה נשמרת באופן קבוע בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וריכוז של 5% carbon dioxide, המוקדש למכשיר זה בלבד בשימוש הראשון שלו. יש להשאיר את המכשיר באינקובטור למשך 16 שעות לפחות כדי שיגיע לשיווי משקל עם סביבת הטמפרטורה והלחות החדשה. לאחר מכן, הכין את ה-Thence EPL 16 על ידי ציפויו ב-0.1% gelatin למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C.לאחר ציפוי הפלטה, יש לשטוף אותה פעם אחת ב-PBS. לאחר מכן, יש להוסיף 100 µL של reconstituted e gm two medium לצורך ביצוע קריאת רקע (blank), כדי למדוד את העכבה (impedance) הבסיסית בהעדר תאים.הנח את ה-EPL במערכת ה-Excel agent במחשב. פתח את תוכנת ה-Excel agent על ידי לחיצה על סמל תוכנת ה-RTCA בשולחן העבודה בחלון התוכנה. לחץ על לשונית הפריסה (layout) ובחר את הבארים המכילות את הדגימות.להגדרת התדירות של רכישת נתונים בזמן אמת. לחצו על לשונית ה-schedule, ולאחר מכן לחצו על סמל add a step. sweeps מציין את מספר הקריאות ו-intervals מציין את פרק הזמן בין הקריאות. אלה מוגדרים באופן אוטומטי ל-one ו-1.00 minute בהתאמה.פעולה זו מתכנתת את המערכת לביצוע קריאת רקע. לחצו על הוספת שלב (add a step) והזינו 300 בתיבת הסריקות (sweeps) ו-10 דקות בתיבת המרווחים (intervals). פעולה זו תתכנת את המכשיר לביצוע מדידות עכבה למשך עד 50 שעות.כדי להתחיל את הניסוי, לחצו על סמל תחילת השלב. העכבה של הרקע בכל באר תימדד לאחר ביצוע מדידת הרקע. החלון מציג את ההודעה.בשלב הבא, אנא לחצו להמשך. שלב הבא להתחלה. בשלב זה, ניתן להוסיף תאים ולעקוב אחר היווצרות השכבה החד-שכבתיות (monolayer) כפי שתואר.בסעיף הבא, תאי אנדותל של וריד טבילי אנושי, או VE, המהווים את הדגם כאן, גודלים במצע EGM two שהורכב באמצעות ערכת EGM two bullet המכילה תוספי גורמי גדילה ו-5% FBS. יש לתחזק את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C בנוכחות 5% carbon dioxide. ביום הניסוי, יש לבדוק את רמת ההצפיפות (confluency) של ה-HUB E תחת מיקרוסקופ; התאים צריכים להיות ממספר מעבר (passage number) נמוך, רצוי לא יותר מ-6, ופחות מ-75% Con fluent. כדי להפיק שכבה אחת (monolayer) של תאי hue, יש לקצור את התאים באמצעות טריפסין. לאחר שהתאים ניתקו מהבקבוק, יש להסיר את כל עקבות הטריפסין על ידי סנטריפוגה במהירות של 200 G. לאחר הסבב, יש לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS.לאחר מכן, השביה מחדש את התאים ואת מצע ה-e GM two ששוחזר לריכוז של 2.5 times 10 to the fifth תאים למיליליטר. ברגע שהתאים הושביהו, הסר את ה-EPL המכויל של הרקע ממערכת ה-EXOGEN והוסף 100 µL של תרחיית ה-HX ל-100 µL של מצע e GM two שכבר נמצאים בלוחית. מקם מיד את ה-EPL במנתח התאים של מערכת ה-Excel.התחילו באיסוף קריאות עכבה על ידי לחיצה על כפתור התחלת השלב (start step) בחלון התוכנה. אפשרו לתאי האנדותל לגדול. המערכת תמשיך לבצע קריאות עכבה כל 10 דקות.תאי Uve מראים התפשטות זמנית אופיינית של מדד התאים (cell index) ארבע עד שש שעות לאחר הזריעה, ולאחריה התייצבות נוספת לאחר 16 עד 18 שעות. לפיכך, חשוב להניח לתאים להוות שכבה רציפה (confluent monolayer) למשך 18 שעות לפחות. ברגע שנוצרה שכבה רציפה, זהו הזמן להוסיף את התאים הפולשים כהכנה לבדיקת הפלישה (invasion assay).הכינו את תאי הגידול הפולשים. במקרה זה נעשה שימוש בתאי אוסטאוסרקומה. התחילו בקצירת התאים באמצעות טריפסין.הסר את כל שאריות ה-trypsin על ידי סבוב (centrifugation) של התאים ב-200 G ושטיפה אחת עם PPS. לאחר השטיפה, השהה את התאים בצפיפות סופית של 1×10⁵ תאים למיליליטר בתוך המצע שבו גודלו תאי הגידול, כגון מצע RPMI או DMEM המכיל 10% FBS. השהה את הניסוי על ידי לחיצה על סמל השהיית השלב בחלון התוכנה.הסר את ה-EPL ושאב את מצע ה-EGM two מהשכבה המוניו-שכבתיות של ה-vac. הוסף 100 µL של תרחיף תאי גידול המכיל 1 × 10⁴ תאים. בדרך כלל, יחס של 1 ל-2.5 בין תאי גידול לתאי אנדותל הוא היעיל ביותר עבור הבדיקה.עם זאת, ניתן לייעל את היחס עבור שורות תאים בודדות. החזיר את ה-EPL למערכת ה-Excel agent באינקובטור. לחץ על שלב ההמשך כדי להמשיך במדידות עכבה במרווחי זמן של 10 דקות.עקבו אחר הפלישה בזמן אמת במהלך שש עד 12 השעות הבאות. ירידה במדד התאים (cell index) תתרחש כתוצאה מהסגת הצמתים האנדותליאליים וחדירה של תאי גידול פולשים. עם סיום הניסוי, השתמשו בתוכנת ה-exergen כדי לנרמל את התוצאות לזמן ההוספה של תאי הגידול הפולשים.תוכנת ה-exergen מאפשרת נורמליזציה לכל נקודת זמן שבה תרביו VEX במערכת ה-exergen כפי שמוצג בסרטון זה, ולאחרי היווצרות השכבה החד-שכבתיות (monolayer) הוספו תאי K seven M two או תאי K 12. כפי שניתן לראות כאן, ירידה חדה במדד התאים (cell index) מתרחשת תוך מספר שעות מהחדרת תאי K seven M two. K seven M two הוא קו תאים של אוסטאוסרקומה בעל פוטנציאל מטאסטטי גבוה.תאים אלו מבטאים רמות גבוהות של חלבון הקישור השלדי ene, האחראי לתכונות הפולשניות של השורה התאית. לעומת זאת, תאי K 12 הם פחות מטאסטטיים ואינם מסוגלים לחדור את השכבה האנדותליאלית ביעילות השווה לזו של תאי K seven M two. הדבר בא לידי ביטוי בירידה פחות עמוקה במדד התאים, כפי שמוצג כאן.הביקורת המוצגת כאן מייצגת את העכבה של השכבה החד-שכבתיות של תאי ה-uve. בהיעדר תאי סרטן, הניסויים בוצעו בשלוש חזרות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד למדוד פלישה בזמן אמת על ידי יצירת שכבה חד-שכבתיות של תאי אנדותל, והחדרת תאי סרטן לשכבה זו.ניתן להשתמש בשלבים הראשוניים של הניסוי הכוללים יצירת שכבה אחת (monolayer) של HU XL כדי להעריך פרוליפרציה של תאים באמצעות עכבה (impedance). שני.

a-real-time-electrical-impedance-based-technique-to-measure-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר בדיקת פלישה באמצעות מערך תלת-תאי המבוסס על עכבה חשמלית. טכניקה זו מודדת את הפוטנציאל הפולשני של תאים סרטניים בהשפעת גורמים מסיסים המופרשים על ידי תאי סטרומה השוכנים במיקרו-סביבות גידוליות.

בדיקת עכבה מבוססת מערכים תלת תאים: טכניקת ניתוח בזמן אמת להערכת פוטנציאל פולשני של תאים סרטניים על ידי מדידת עכבה חשמלית

מקור: Mudduluru, G., et. al. מדידה בזמן אמת מבוססת עכבה של נדידה ופלישה של תאים סרטניים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת עכבה למדידת פלישה ונדידה של תאי גליובלסטומה. תאים משפילים את המטריצה החוץ-תאית, עוברים דרך ממברנות מיקרו-נקבוביות ונצמדים לאלקטרודות, ויוצרים עכבה. ניתוח זה בזמן אמת משקף את הפוטנציאל הפולשני שלהם ליישומי חקר סרטן.

מדידות מבוססות עכבה של פלישת תאי סרטן המוח

פרוטוקול זה מסוקר Cell-מצע חשמלי עכבת חישה, שיטה להקליט ולנתח את ספקטרום העכבה של תאי חסיד לכימות של התקשרות סלולרי, התפשטות, תנועתיות, ותגובות תאיות לגירויים תרופתיים ורעילים. זיהוי של חדירות האנדותל והערכה של קשרים בין תאים ותא מצע מודגשים.

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

סרטן היא מחלה קטלנית בשל יכולתה לעבור גרורות לאיברים שונים. קביעת היכולת של תאים סרטניים להגר ולפלוש תחת תנאי טיפול שונים חיונית להערכת אסטרטגיות טיפוליות. פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את היכולות גרורתית בזמן אמת של קו הסרטן הגלינובלסטומה.

עכבה מבוססי מדידה בזמן אמת של סרטן הגירה תאים ופלישה

אנו מתארים גישה לאיתור ולכידת תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים בזמן אמת. התכנון הניסויי משתמש באנליזה תאית בזמן אמת על ידי ניטור שינויים בעכבה החשמלית של תאים. סרטן פולשני, תאי חיסון, אנדותל או סטרומל ברקמות מורכבות יכולים להיתפס, וניתן להעריך את ההשפעה של תרביות משותפות.

זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות

גנים רבים מעודכנים, מעודדים נדידה ופלישה של תאי גידול, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה. קביעה אילו גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול היא קריטית. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקר ההשפעות של ביטוי מוגבר של גן על נדידה ופלישה של תאי גידול בזמן אמת.

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

כאן אנו מדגימים את הטכניקה של שימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה: ECIS ו- cellZscope, למדידת חוזק מחסום אנדותל במוח. אנו מפרטים את ההכנה והטכניקה של הוספת גירויים שונים למודל in vitro של אנדותל המוח. אנו מודדים, רושמים ונותנים ניתוח מייצג של הממצאים.

מדידת שינויים בשלמות מחסום האנדותל במוח באמצעות שני חיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה בתגובה לתאים סרטניים וציטוקינים

אנו מציגים גישה חדשנית לכמת לוקליזציה nanoparticle ב vasculature של גידולים xenografted אנושי באמצעות דינמי, בזמן אמת הדמיה intravital במודל העובר העופות.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

סקירה מקיפה של טכניקות מעורב ביצירת מודל עכברי של סרטן הפה ניטור כמותי של הפלישה הגידול בתוך הלשון באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון של תאים שכותרתו מוצג. מערכת זו יכולה לשמש פלטפורמה שימושי להערכת יעילות התרופה מולקולרית של תרכובות אנטי פולשנית.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

למד מדידת פלישת תאים סרטניים דרך שכבת תאי אנדותל בזמן אמת באמצעות חישום חשמלי. השיטה מחקה תהליכי גרורה בגוף החי ומספקת נתונים כמותיים מדויקים.

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

גלה סרטונים נוספים