טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

סרטון זה מדגים שיטה לניטור פלישה של חד-שכבת תא אנדותל על ידי תאים סרטניים באמצעות טכניקה מבוססת עכבה חשמלית בזמן אמת. ראשית, תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי המכונים VE יושבים ב-16 בארות EPL המצופות באלקטרודות זהב בתחתית הבאר. כדי ליצור קונפלואנט חד-שכבתי מתווספים תאים סרטניים, המתחברים ל-VE ופולשים לחד-שכבת ה-HVAC המשבשים את צמתים תאי האנדותל לאחר מכן נרכשות קריאות עכבה, התלויות בשטח הכולל של קרקעית הבאר המכוסה על ידי תאים.

לאחר מכן ניתן לקבוע את מידת הפלישה על סמך שינויים בעכבה החשמלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו או שיטות קיימות, כגון מבחני תא ריק ו-METROGEL, הוא שהאינטראקציות בין תאי הגידול של תאי האנדותל מחקות יותר את התהליך הגרורתי in vivo, והנתונים מתקבלים בזמן אמת וניתנים לכימות בקלות רבה יותר בניגוד לניתוח נקודות קצה בשיטות אחרות. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פלישת תאים סרטניים.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון חקירת אינטראקציות בין תאים במערכת החיסון. יתר על כן, השלב הראשוני של הניסוי שבו אנו צופים בצמיחה של תאי UX יכול לשמש להערכת התפשטות התאים של כל קו תאים ללא שלבי פלישה נוספים המדגימים את ההליך יהיה סטודנט לתואר שני במעבדה שלי. יש לבצע את כל השלבים של פרוטוקול זה בתנאים סטריליים במכסה המנוע של תרבית רקמות.

מערכת ה-Xcel ששימשה לניסוי זה נשמרת באופן קבוע בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5%, המוקדשת אך ורק למכשיר זה בשימוש הראשון שלו. יש להשאיר את המכשיר בחממה למשך 16 שעות לפחות כדי לאזן לסביבת הטמפרטורה והלחות החדשה. לאחר מכן, הכינו את Thence EPL 16 על ידי ציפוי ב-0.1% ג'לטין למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר ציפוי הצלחת, שטפו אותה פעם אחת עם PBS. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של e gm שני מדיום משוחזר כדי לבצע קריאה ריקה. למדוד עכבת רקע בהיעדר תאים.

מקם את ה- EPL במערכת הסוכנים של Excel במחשב. פתח את תוכנת הסוכן של Excel על ידי לחיצה על סמל תוכנת RTCA בשולחן העבודה בחלון התוכנה. לחץ על לשונית הפריסה ובחר את הבארות המכילות דגימות.

לתכנת את תדירות איסוף הנתונים בזמן אמת. לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים, ולאחר מכן לחץ על סמלי הוסף צעד מציין את מספר הקריאות והמרווחים מציין את מרווח הזמן בין הקריאות. אלה מוגדרים אוטומטית לדקה אחת ו-1.00 בהתאמה.

זה מתכנת את המערכת לבצע קריאת רקע. לחץ על הוסף שלב והזן 300 בתיבת הסוויפ ו-10 דקות בתיבת המרווחים. זה יתכנת את המכשיר לבצע מדידות עכבה עד 50 שעות.

כדי להתחיל בניסוי, לחץ על סמל התחל שלב. עכבת הרקע של כל באר תימדד לאחר ביצוע מדידת הרקע. החלון מציג את ההודעה.

מוכן לשלב הבא, אנא לחץ. השלב הבא להתחיל. בשלב זה ניתן להוסיף תאים ולעקוב אחר היווצרות חד-שכבתי כמתואר.

בחלק הבא, וריד הטבור האנושי, תאי האנדותל או ה-VE המשמשים כאן מתורבתים ב-EGM שני מדיום משוחזר עם ערכת EGM שני כדורים המכילה תוספי גורמי גדילה, ותאי FBS 5% צריכים להישמר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% פחמן דו חמצני. ביום הניסוי, בדוק את שטף הפעולה של HUB E תחת מיקרוסקופ, התאים צריכים להיות מספר מעבר נמוך, רצוי לא יותר משישה ופחות מ-75% שוטף כדי ליצור גוון, חד-שכבתי קוצר את התאים על ידי טריפסין. לאחר שהתאים התנתקו מהבקבוק, יש להסיר את כל עקבות הטריפסין על ידי צנטריפוגה ב -200 גרם.לאחר הסיבוב יש לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים והרכיבו מחדש את e GM שני מדיה לריכוז של 2.5 כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר. לאחר השעיית התאים מחדש, הסר את ה-EPL המכויל ברקע ממערכת EXOGEN והוסף 100 מיקרוליטר של מתלה HX ל-100 מיקרוליטר של שני מדיה E GM שכבר נמצאים בצלחת. מקם מיד את ה- EPL במנתח תאי המערכת של Excel.

התחל לרכוש קריאות עכבה על ידי לחיצה על כפתור שלב ההתחלה בחלון התוכנה. אפשרו לתאי האנדותל לגדול. המערכת תמשיך לבצע קריאות עכבה כל 10 דקות.

Uve מראה השטחה חולפת אופיינית של אינדקס התא ארבע עד שש שעות לאחר הזריעה, ואחריה התייצבות נוספת לאחר 16 עד 18 שעות. לפיכך, חשוב לתת לתאים ליצור חד-שכבת קונפלואנט למשך 18 שעות לפחות. לאחר שנוצר חד-שכבה, הגיע הזמן להוסיף את התאים הפולשים כהכנה לבדיקת הפלישה.

הכן את תאי הגידול הפולשים. כאן משתמשים בתאי אוסטאוסרקומה. התחל בקצירת התאים על ידי טריפסין.

הסר את כל עקבות הטריפסין על ידי סיבוב התאים ב -200 גרם ושטיפה פעם אחת עם PPS. לאחר השטיפה reus, השעו את התאים תוך צפיפות סופית של אחד כפול 10 עד חמישי תאים למיליליטר במדיום המשמש לגידול תאי הגידול כגון RPMI או מדיום DMEA המכיל 10% FBS. השהה את הניסוי על ידי לחיצה על סמל שלב ההשהיה בחלון התוכנה.

הסר את ה- EPL ושאף את ה- EGM שני בינוני מהחד-שכבת הוואק. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי גידול המכיל אחת כפול 10 לתאים הרביעיים. בדרך כלל, יחס של 1 עד 2.5 תאי גידול לתאי אנדותל עובד בצורה הטובה ביותר עבור הבדיקה.

עם זאת, ניתן למטב את היחס עבור שורות תאים בודדות. הנח את ה- EPL בחזרה במערכת הסוכנים של Excel בחממה. לחץ על שלב ההמשך כדי להמשיך לבצע קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות.

עקוב אחר הפלישה בזמן אמת במהלך שש עד 12 השעות הקרובות. ירידה באינדקס התאים תנבע מנסיגה של צמתים אנדותליים וחדירה של תאי גידול פולשים. בסיום הניסוי, השתמש בתוכנת exergen כדי לנרמל את התוצאות לזמן הוספת תאי הגידול הפולשים.

תוכנת האקסרגן מאפשרת נורמליזציה לכל נקודת זמן VEX תורבתה על מערכת האקסרגנים כפי שמוצג בסרטון זה, ותאי K 7 M שני תאים או K 12 נוספו לאחר היווצרות השכבה החד-שכבתית. כפי שמוצג כאן, ירידה תלולה באינדקס התאים מתרחשת תוך מספר שעות מהכנסת K שבעה M שני תאים. K שבע M שתיים הוא קו תאי אוסטאוסרקומה גרורתי מאוד.

תאים אלה מבטאים רמות גבוהות של חלבון המקשר הציטו-שלד ene, המהווה את התכונות הפולשניות של קו התאים. תאי K 12, לעומת זאת, הם פחות גרורתיים ואינם מסוגלים לחדור לחד-שכבת האנדותל ביעילות כמו K seven M שני תאים. זה מיוצג על ידי ירידה פחות עמוקה באינדקס התאים כפי שמוצג כאן.

השליטה המוצגת כאן מייצגת עכבה של החד-שכבת uve. בהיעדר תאים סרטניים, הניסויים בוצעו בשלושה עותקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד פלישה בזמן אמת על ידי יצירת חד-שכבת תא אנדותל, ואתגר את השכבה החד-שכבתית עם תאים סרטניים.

ניתן להשתמש בשלבים הראשונים של הניסוי הכולל היווצרות חד-שכבתית HU XL כדי להעריך את התפשטות התאים על ידי עכבה. שניים.