טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

סרטון זה מדגים שיטה לניטור פלישת תאי סרטן אל תוך שכבה חד-שכבתיות (monolayer) של תאי אנדוothelium באמצעות טכניקה מבוססת עכבה חשמלית בזמן אמת. ראשית, תאי אנדוothelium של וריד טבילית אנושי, המכונים VE, מושקעים ב-EPLs בעלי 16 בארות המצופים באלקטרודות זהב בתחתית הבארה. כדי ליצור שכבה חד-שכבתיות רציפה, מוסיפים תאי סרטן, הנצמדים ל-VE ופולשים לשכבת ה-HVAC תוך שהם משבשים את החיבורים בין תאי האנדוothelium. לאחר מכן נלקחות קריאות עכבה, התלויות בשטח הכולל של תחתית הבארה המכוסה בתאים.

ניתן לקבוע את מידת הפלישה על בסיס שינויים בעכבה החשמלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות תאי חלל (void chamber) ו-METROGEL, הוא שאינטראקציות בין תאי אנדותל לתאי גידול מדמות באופן קרוב יותר את תהליך הגריעות (metastatic process) in vivo, והנתונים מתקבלים בזמן אמת וניתנים לכימות בקלות רבה יותר בהשוואה לניתוח נקודת סיום (endpoint analysis) בשיטות אחרות. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פלישת תאי סרטן.

ניתן להחיל זאת גם על מערכות אחרות, כגון חקירת אינטראקציות בין תאים במערכת החיסון. יתרה מכך, את השלב הראשוני של הניסוי, שבו אנו צופים בצמיחת תאי UX, ניתן להשתמש בו להערכת השכפול התאי של כל קו תאים ללא צורך בשלבי פלישה נוספים; את הפרוצדורה תדגים സൈט רחים, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. את כל שלבי פרוטוקול זה יש לבצע בתנאים סטריליים בתוך מנדף לתרבית רקמות.

מערכת ה-Xcel ששימשה בניסוי זה נשמרת באופן קבוע בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וריכוז של 5% carbon dioxide, המוקדש למכשיר זה בלבד בשימוש הראשון שלו. יש להשאיר את המכשיר באינקובטור למשך 16 שעות לפחות כדי שיגיע לשיווי משקל עם סביבת הטמפרטורה והלחות החדשה. לאחר מכן, הכין את ה-Thence EPL 16 על ידי ציפויו ב-0.1% gelatin למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר ציפוי הפלטה, יש לשטוף אותה פעם אחת ב-PBS. לאחר מכן, יש להוסיף 100 µL של reconstituted e gm two medium לצורך ביצוע קריאת רקע (blank), כדי למדוד את העכבה (impedance) הבסיסית בהעדר תאים.

הנח את ה-EPL במערכת ה-Excel agent במחשב. פתח את תוכנת ה-Excel agent על ידי לחיצה על סמל תוכנת ה-RTCA בשולחן העבודה בחלון התוכנה. לחץ על לשונית הפריסה (layout) ובחר את הבארים המכילות את הדגימות.

להגדרת התדירות של רכישת נתונים בזמן אמת. לחצו על לשונית ה-schedule, ולאחר מכן לחצו על סמל add a step. sweeps מציין את מספר הקריאות ו-intervals מציין את פרק הזמן בין הקריאות. אלה מוגדרים באופן אוטומטי ל-one ו-1.00 minute בהתאמה.

פעולה זו מתכנתת את המערכת לביצוע קריאת רקע. לחצו על הוספת שלב (add a step) והזינו 300 בתיבת הסריקות (sweeps) ו-10 דקות בתיבת המרווחים (intervals). פעולה זו תתכנת את המכשיר לביצוע מדידות עכבה למשך עד 50 שעות.

כדי להתחיל את הניסוי, לחצו על סמל תחילת השלב. העכבה של הרקע בכל באר תימדד לאחר ביצוע מדידת הרקע. החלון מציג את ההודעה.

בשלב הבא, אנא לחצו להמשך. שלב הבא להתחלה. בשלב זה, ניתן להוסיף תאים ולעקוב אחר היווצרות השכבה החד-שכבתיות (monolayer) כפי שתואר.

בסעיף הבא, תאי אנדותל של וריד טבילי אנושי, או VE, המהווים את הדגם כאן, גודלים במצע EGM two שהורכב באמצעות ערכת EGM two bullet המכילה תוספי גורמי גדילה ו-5% FBS. יש לתחזק את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C בנוכחות 5% carbon dioxide. ביום הניסוי, יש לבדוק את רמת ההצפיפות (confluency) של ה-HUB E תחת מיקרוסקופ; התאים צריכים להיות ממספר מעבר (passage number) נמוך, רצוי לא יותר מ-6, ופחות מ-75% Con fluent. כדי להפיק שכבה אחת (monolayer) של תאי hue, יש לקצור את התאים באמצעות טריפסין. לאחר שהתאים ניתקו מהבקבוק, יש להסיר את כל עקבות הטריפסין על ידי סנטריפוגה במהירות של 200 G. לאחר הסבב, יש לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS.

לאחר מכן, השביה מחדש את התאים ואת מצע ה-e GM two ששוחזר לריכוז של 2.5 times 10 to the fifth תאים למיליליטר. ברגע שהתאים הושביהו, הסר את ה-EPL המכויל של הרקע ממערכת ה-EXOGEN והוסף 100 µL של תרחיית ה-HX ל-100 µL של מצע e GM two שכבר נמצאים בלוחית. מקם מיד את ה-EPL במנתח התאים של מערכת ה-Excel.

התחילו באיסוף קריאות עכבה על ידי לחיצה על כפתור התחלת השלב (start step) בחלון התוכנה. אפשרו לתאי האנדותל לגדול. המערכת תמשיך לבצע קריאות עכבה כל 10 דקות.

תאי Uve מראים התפשטות זמנית אופיינית של מדד התאים (cell index) ארבע עד שש שעות לאחר הזריעה, ולאחריה התייצבות נוספת לאחר 16 עד 18 שעות. לפיכך, חשוב להניח לתאים להוות שכבה רציפה (confluent monolayer) למשך 18 שעות לפחות. ברגע שנוצרה שכבה רציפה, זהו הזמן להוסיף את התאים הפולשים כהכנה לבדיקת הפלישה (invasion assay).

הכינו את תאי הגידול הפולשים. במקרה זה נעשה שימוש בתאי אוסטאוסרקומה. התחילו בקצירת התאים באמצעות טריפסין.

הסר את כל שאריות ה-trypsin על ידי סבוב (centrifugation) של התאים ב-200 G ושטיפה אחת עם PPS. לאחר השטיפה, השהה את התאים בצפיפות סופית של 1×10⁵ תאים למיליליטר בתוך המצע שבו גודלו תאי הגידול, כגון מצע RPMI או DMEM המכיל 10% FBS. השהה את הניסוי על ידי לחיצה על סמל השהיית השלב בחלון התוכנה.

הסר את ה-EPL ושאב את מצע ה-EGM two מהשכבה המוניו-שכבתיות של ה-vac. הוסף 100 µL של תרחיף תאי גידול המכיל 1 × 10⁴ תאים. בדרך כלל, יחס של 1 ל-2.5 בין תאי גידול לתאי אנדותל הוא היעיל ביותר עבור הבדיקה.

עם זאת, ניתן לייעל את היחס עבור שורות תאים בודדות. החזיר את ה-EPL למערכת ה-Excel agent באינקובטור. לחץ על שלב ההמשך כדי להמשיך במדידות עכבה במרווחי זמן של 10 דקות.

עקבו אחר הפלישה בזמן אמת במהלך שש עד 12 השעות הבאות. ירידה במדד התאים (cell index) תתרחש כתוצאה מהסגת הצמתים האנדותליאליים וחדירה של תאי גידול פולשים. עם סיום הניסוי, השתמשו בתוכנת ה-exergen כדי לנרמל את התוצאות לזמן ההוספה של תאי הגידול הפולשים.

תוכנת ה-exergen מאפשרת נורמליזציה לכל נקודת זמן שבה תרביו VEX במערכת ה-exergen כפי שמוצג בסרטון זה, ולאחרי היווצרות השכבה החד-שכבתיות (monolayer) הוספו תאי K seven M two או תאי K 12. כפי שניתן לראות כאן, ירידה חדה במדד התאים (cell index) מתרחשת תוך מספר שעות מהחדרת תאי K seven M two. K seven M two הוא קו תאים של אוסטאוסרקומה בעל פוטנציאל מטאסטטי גבוה.

תאים אלו מבטאים רמות גבוהות של חלבון הקישור השלדי ene, האחראי לתכונות הפולשניות של השורה התאית. לעומת זאת, תאי K 12 הם פחות מטאסטטיים ואינם מסוגלים לחדור את השכבה האנדותליאלית ביעילות השווה לזו של תאי K seven M two. הדבר בא לידי ביטוי בירידה פחות עמוקה במדד התאים, כפי שמוצג כאן.

הביקורת המוצגת כאן מייצגת את העכבה של השכבה החד-שכבתיות של תאי ה-uve. בהיעדר תאי סרטן, הניסויים בוצעו בשלוש חזרות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד למדוד פלישה בזמן אמת על ידי יצירת שכבה חד-שכבתיות של תאי אנדותל, והחדרת תאי סרטן לשכבה זו.

ניתן להשתמש בשלבים הראשוניים של הניסוי הכוללים יצירת שכבה אחת (monolayer) של HU XL כדי להעריך פרוליפרציה של תאים באמצעות עכבה (impedance). שני.