בידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה בצפק: טכניקה להשגת נויטרופילים בצפיפות נמוכה מנוזל שטיפת הצפק באמצעות מיון תאים מופעלים מגנטיים

נויטרופילים בצפיפות נמוכה, או LDNs, הם תת-אוכלוסיית נויטרופילים מובהקת הנמצאת במספרים גבוהים במהלך מצבים פתולוגיים כמו סרטן מערכת העיכול. ניתן לבודד LDNs משטיפת חלל הצפק או מנוזל השטיפה של חולים.

ראשית, סנן את נוזל השטיפה כדי להסיר פסולת רקמות. צנטריפוגה את המסנן כדי להשיג גלולה המכילה תאי דם, כולל LDNs. השעו אותו מחדש במאגר מתאים. שכב מתלה זה על מדיום שיפוע צפיפות מתאים האופטימלי לבידוד LDN.

צנטריפוגה להפרדת מרכיבי הדם השונים על סמך הצפיפות היחסית שלהם. ה-RBCs הצפופים יותר יוצרים את השכבה התחתונה, בעוד שחלק הפלזמה הפחות צפוף יוצר את השכבה העליונה. ה-LDNs הפחות צפופים תופסים את שכבת הביניים יחד עם תאים חד-גרעיניים אחרים.

העבירו את שכבת הביניים לצינור טרי המכיל מגיב חוסם. רכיבי המגיב חוסמים אתרי קשירה לא ספציפיים על כל משטחי התאים שאינם מטרה ומגדילים את הספציפיות של LDN במהלך התיוג שלאחר מכן.

הוסף מיקרו-חרוזים מצומדים לנוגדנים המכוונים למולקולת משטח תא ספציפית המתבטאת יתר על המידה ב-LDNs. דגירה כדי שמתחמי הנוגדנים-חרוזים ייקשרו למולקולות המטרה שלהם ב-LDNs.

העבירו את המתלה המודגר דרך עמוד הממוקם בשדה מגנטי. תחת ההשפעה המגנטית, כל קומפלקסי המיקרו-חרוזים של LDN נצמדים לדופן העמוד בזמן שתאים לא מסומנים עוברים דרכו.

הסר את העמודה. שטפו את התכולה באמצעות מאגר מתאים כדי לאסוף ולאסוף את החלק המכיל LDN.

כדי לרכוש את הנויטרופילים, ראשית, יש להחדיר 1 ליטר של מי מלח סטריליים רגילים מיד לפני סגירת הפצע ישירות לחלל הבטן של מטופל שזה עתה עבר ניתוח בטן עקב ממאירות במערכת העיכול, ולשטוף את חלל הבטן באופן נרחב למשך דקה אחת לפחות. לאחר מכן, ערבבו את מי המלח בתוך החלל והחזירו 200 מיליליטר של נוזל שטיפה עם ארבעה מזרקים של 50 מיליליטר.

במעבדה, העבירו את נוזל השטיפה הצפק דרך מסנן ניילון של 100 מיקרומטר לצינורות בודדים של 50 מיליליטר לצנטריפוגה. השעו מחדש את הכדורים ב-5 מיליליטר PBS בתוספת 0.02% EDTA וכסו בזהירות כל תרחיף תאים על 3 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות. לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות, קצרו 2 עד 3 מיליליטר משכבת הביניים מכל צינור ושטפו את דגימות הנוזל הצפק ב-10 מיליליטר PBS טרי בתוספת EDTA לכל צינור. יוצקים את הכדורים ב-10 מיליליטר PBS טרי בתוספת EDTA לשטיפה נוספת ומדללים את התאים ל-1 כפול 10 לתאים השביעיים לכל 60 מיקרומטר של מיון תאים פעילים מגנטיים, או MACS, ריכוז חיץ.

חסום כל כריכה לא ספציפית עם 20 מיקרוליטר של בלוק Fc למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן תוספת של 20 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים נגד CD66b. לאחר 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, שטפו והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS והוסיפו את התאים לעמוד מגנטי בגודל מתאים בתוך השדה המגנטי של מפריד מגנטי מתאים. כאשר כל התאים השליליים CD66b עברו דרך העמודה, הוסף 15 מיליליטר של מאגר MACS טרי למאגר העמודה והעביר את העמודה מהמפריד המגנטי לצינור חרוטי חדש. לאחר מכן, צללו מיד את העמודה כדי לשטוף את ה-CD66b החיובי המסומן מגנטית לתוך הצינור.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.