בדיקת זרימת סידן למדידת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתאים בתרבית

הספיגה המיטוכונדריאלית של יוני סידן ציטוזוליים דרך קומפלקס הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית שלו היא חיונית לתפקודו.

כדי למדוד את זרם הסידן המיטוכונדריאלי, התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה כיסוי מצופה ECM בתחתית הבאר שלה. צלחו את תרחיף הפיברובלסטים על הכיסוי, ואפשרו לתאים להיצמד ל-ECM.

הוסיפו תערובת צבעים המכילה צבע אדום-פלואורסצנטי לא פעיל, אדום-פלואורסצנטי רגיש לסידן וצבע ירוק-פלואורסצנטי סלקטיבי למיטוכונדריה. דגירה כדי לאפשר למולקולות הצבע להיכנס לציטוזול התא.

הצבע הרגיש למיטוכונדריה מתפזר באופן סלקטיבי דרך הממברנה שלו ומתמקם במטריקס המיטוכונדריאלי. הצבע הרגיש לסידן מתפשט בכל המיטוכונדריה ובחללים החוץ-מיטוכונדריים. בתוך הלומן המיטוכונדריאלי, אסטרזות אנדוגניות מבקעות את חלק האסטר מהצבע האדום, ומשחררות פלואורופור אדום אטום לממברנה שנשאר כלוא בתוך המיטוכונדריה.

הוסף תמיסת חדירות המכילה חומרים פעילי שטח. בריכוזים נמוכים, מולקולות פעילי שטח ממיסות באופן מגביל את כולסטרול קרום הפלזמה של התאים, משאירות את המיטוכונדריה שלהם שלמה ויוצרות חללים שדרכם מולקולות צבע רגישות לסידן דולפות החוצה מהציטופלזמה. זה שומר באופן סלקטיבי על הפלואורופורים האדומים הרגישים לסידן והפלואורופורים הירוקים הספציפיים למיטוכונדריה במיטוכונדריה.

העבירו את הכיסוי לתא הדמיה קבוע במיקרוסקופ קונפוקלי, והוסיפו מאגר המכיל סידן. בתוך התאים החדירים, אתר אזורים המציגים פלואורסצנציה אדומה וירוקה במיקום משותף, מה שמעיד על סידן מקומי במיטוכונדריה. הקרינה האדומה גדלה בהדרגה, ומתארת ספיגת סידן מיטוכונדריאלית מתקדמת.

הכן את פתרון העבודה של Rhod-2/AM-MitoTracker Green על ידי ערבוב של 20 מיקרוליטר של Rhod-2/AM, 0.2 מיקרוליטר של MitoTracker Green, 2.5 מיקרוליטר של 20% F-127 פלורוני ו-1 מיליליטר של התמיסה של Tyrode. על כיסוי שהוכן בעבר מצופה בתאי NIH 3T3, הוסף את תמיסת Rhod-2/AM-MitoTracker Green טיפה עד לכיסוי. כדי שהתאים יטענו עם הצבעים, דגרו את הכיסוי, מוגן מפני אור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי להסיר את האסטריפיקציה של Rhod-2/AM, הסר בעדינות את תמיסת Rhod-2/AM-MitoTracker Green, והחלף אותה בכ-300 מיקרוליטר של תמיסת Tyrode טרייה לכיסוי התאים. דגרו את הכיסוי המוגן מפני אור, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

כעת, העבירו את הכיסוי לתא ההדמיה של המיקרוסקופ, ומלאו את החדר בתמיסת כביסה. התאם את המיקוד כדי להתבונן בתאים ובניגודיות הפאזה בהגדלה של פי 40.

כדי לחדור את קרום הפלזמה של תאים טעונים ירוקים של Rhod-2/AM-MitoTracker, הסר את תמיסת הכביסה מהכיסוי, והחלף אותה בכ-300 מיקרוליטר של תמיסת חדירות לכיסוי התאים.

עקוב אחר מורפולוגיה של קרום הפלזמה במהלך תהליך זה. כאשר הם חדורים, התאים יפתחו משטח מחוספס. הסר את תמיסת החדירה מיד, לאחר חדירות מלאה, והחלף אותה בתמיסה פנימית אפס סידן.

לאחר מכן, התמקדו בתאים חדירים המציגים לוקליזציה משותפת ברורה של Rhod-2 ו-MitoTracker Green, כדי לדמות את הקרינה של Rhod-2 ו-MitoTracker Green בו זמנית.

לאחר מכן, הקטינו את לייזר המיקרוסקופ והשגו הגדרות כדי להפוך את הקרינה המיטוכונדריאלית Rhod-2 לעמומה ובקושי נראית.

כדי ללכוד את הקינטיקה של שינויי סידן במיטוכונדריה, בחר "הגדרות מיקרוסקופ" כדי לרכוש סריקות דו-ממדיות בקצב פריימים ומסלול זמן מתאימים. הסר את התמיסה הפנימית של אפס סידן, הקפד לא להפריע לתאים ולמיקוד המיקרוסקופ, ולאחר מכן, התחל ברכישת תמונה.

באמצעות מזרק, הוסף ידנית תמיסה פנימית גדושה בסידן בנקודת הזמן של 10 שניות. לבסוף, בתוכנת רכישת התמונות, בחר אזורים מעניינים כדי להקיף אזורים של לוקליזציה משותפת של האות הירוק Rhod-2 ו-MitoTracker.