בדיקת הסתעפות גליקוגן למדידת מידת הסתעפות הגליקוגן

פוליסכרידים מסועפים, כגון גליקוגן, מורכבים משאריות גלוקוז המקושרות באופן ליניארי באמצעות קשרים אלפא-1,4-גליקוזידיים ובענפים באמצעות קשרים אלפא-1,6-גליקוזידיים.

כדי לקבוע את מידת ההסתעפות בפוליסכרידים, התחל עם מגיב צבע מימי המכיל אשלגן יודיד, יוד וסידן כלורי. בתנאים מימיים, אשלגן יודיד ויוד מניבים יוני יוד.

בצינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים, מערבבים את המגיב עם פוליסכרידים של מבני ענפים ידועים ודגימת גליקוגן עם מבנה לא אופייני.

פוליסכרידים מאמצים מבנים סליליים באמצעות הקשרים האלפא-1,4-גליקוזידיים שלהם. יוני היודיד נקשרים לליבה סלילית זו, ויוצרים שרשראות פוליאודידים ליניאריות. התוצאה היא היווצרות קומפלקס העברת מטען בין הפוליסכרידים לשרשראות הפולייודידים, וכתוצאה מכך קומפלקסים צבעוניים של פוליסכריד-יודיד.

פוליסכרידים לא מסועפים עם שרשראות פוליאודידים ארוכות יותר מפתחים צבע כחול, בעוד שפוליסכרידים מסועפים עם שרשראות פוליאודידים קצרות יותר מפתחים קומפלקסים צהבהבים עד כתומים-חומים. הסידן הכלורי במגיב מעצים את הצבע המורכב.

מעבירים את התערובת לקובטות חד פעמיות. בעזרת ספקטרופוטומטר מודדים את ספקטרום הספיגה בין 330 ל-800 ננומטר.

קומפלקסים לא מסועפים עם צבע כחול סופגים אור באורכי גל ארוכים יותר, ומדגימים תזוזה ימינה במקסימום הספיגה. לעומת זאת, קומפלקסים מסועפים סופגים אור באורכי גל קצרים יותר, כאשר ההסטה שמאלה במקסימום הספיגה מעידה על הסתעפות גבוהה יותר במבנה.

מקסימום הספיגה של דגימת הגליקוגן הלא מאופיינת בכ-450 ננומטר מאשר את המבנה המסועף שלה.

כדי לקבוע את הסתעפות הגליקוגן, שלבו 650 מיקרוליטר של מלאי ריאגנטים צבעוניים של יוד/סידן כלוריד עם 100 מיקרוליטר מים בצינור של 1.5 מיליליטר, וערבבו היטב את התמיסה לפני העברתם לקוביית מתקרילט חד פעמית. הנח את הקובט בספקטרופוטומטר כדי לבצע ריצה במצב סריקת אורך גל לאיסוף ספקטרום הרקע מ-330 עד 800 ננומטר.

בשפופרת נפרדת של 1.5 מיליליטר, שלבו 650 מיקרוליטר של ריאגנט צבע יוד/סידן כלורי עובד עם 50 מיקרוגרם של גליקוגן הצדפות, והרכיבו את הנפח הסופי ל-750 מיקרוליטר עם מים. לאחר ערבוב יסודי של התערובת, העבירו את התמיסה לקובט מתקרילט חד פעמי כדי לאסוף ספקטרום ספיגה מ-330 עד 800 ננומטר.

באופן דומה, השג ספקטרום ספיגה עם 50 מיקרוגרם עמילופקטין ו-30 מיקרוגרם עמילוז כמתואר לעיל.

כדי לקבל אינדיקציה למבנה המסועף של דגימת גליקוגן לא מאופיינת, שלב 25 עד 50 מיקרוגרם של הגליקוגן עם 650 מיקרוליטר של מגיב הצבע יוד/סידן כלוריד העובד, והמשך כפי שהוסבר קודם לכן כדי לרכוש את ספקטרום הספיגה.