בדיקת פעילות קולטן-מדווח אסטרוגן לבדיקת פעילות פיטואסטרוגן אסטרוגנית

אסטרוגנים הם הורמונים סטרואידים הפועלים כמולקולות איתות אנדוקריניות ונקשרים לקולטנים גרעיניים - קולטני אסטרוגן בטא, ויוצרים קומפלקסים של קולטני אסטרוגן-בטא.

קומפלקסים אלה של קולטני ליגנד מתעמעמים ויוצרים הומודימרים בציטופלזמה של התא. ההומודימר שנוצר נכנס לגרעין, נקשר לאלמנט תגובת האסטרוגן, ERE - רצף DNA ספציפי בתוך מקדם גן המטרה - ויוזם שעתוק.

כדי לקבוע את הפעילות האסטרוגנית של פיטואסטרוגנים - מטבוליטים משניים שמקורם בצמחים המחקים את תפקוד האסטרוגן - התחל בצלחת מרובת בארות המכילה תאים מדווחים תלויים בתווך מתאים.

תאי הדיווח מהונדסים לבטא יתר על המידה את קולטני האסטרוגן בטא ומועברים עם גן לוציפראז המותך למקדם ERE. הוסף את תמיסת הדגימה המכילה פיטואסטרוגנים ודגירה.

במהלך הדגירה, הפיטואסטרוגן נקשר לקולטני האסטרוגן, בטא - המתבטא בתאי המדווח. לאחר שנקשרו, קומפלקסי קולטני הפיטואסטרוגן מתעמעמים ועוברים לתוך הגרעין.

בתוך הגרעין, הקומפלקס הדימרי נקשר ל-ERE. הקישור יוזם שעתוק גן לוציפראז, ומייצר את האנזים לוציפראז. לאחר מכן, הסר את המדיום והוסף מגיב המכיל מצע ללוציפראז. דגירה כדי לאפשר לאנזים לוציפראז המתבטא לחמצן את המצע שלו ולייצר זוהר.

מדוד את הזוהר, המאשר את הפעילות האסטרוגנית של התרכובת בדגימה.

מערבולת הדגימות. לאחר מכן, הוסף 4 מיקרוליטר מכל דגימה ל-496 מיקרוליטר של מדיום סינון תרכובות, כדי להניב תמיסת DMSO של 0.8%.

יש לחטא את המשטח החיצוני של צינור מדיום לשחזור תאים שחומם מראש עם 70% אתנול, ולהעביר 10 מיליליטר מהמדיום לצינור של תאי דיווח קפואים כדי להפשיר אותם. סגור את הצינור של תאי הדיווח, והנח אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 10 דקות.

לאחר החזרת התאים מאמבט המים, הפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי לפרק אגרגטים של תאים, ולייצר תרחיף הומוגני. לאחר מכן, נקו את פני הצינור עם 70% אתנול.

השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוציא 100 מיקרוליטר של מתלה תא הכתב לכל באר של צלחת של 96 בארות. לאחר מכן, הוצא 100 מיקרוליטר של דגימות בשלוש פעמים לבארות המתאימות. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 22 עד 24 שעות.

רגע לפני סיום הדגירה של הצלחת, הסר את מצע הזיהוי ואת מאגר הזיהוי מהמקרר, והנח אותם באזור עם תאורה חלשה עד לאיזון לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הפוך בעדינות כל צינור כדי לערבב את התמיסות.

מיד לפני השלמת הדגירה של הצלחת, שפכו את כל תכולת מאגר הזיהוי לתוך הצינור של מצע הזיהוי, כדי ליצור מגיב לזיהוי לוציפראז. מערבבים את הצינור בעדינות, כדי לא לייצר קצף.

השליכו את תכולת לוחית הדגימה למיכל פסולת מתאים, והקישו עליה בעדינות על מגבת נייר סופגת נקייה כדי להסיר את הטיפות האחרונות מהבארות. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב זיהוי הלוציפראז לכל באר, ואפשר ללוחית הבדיקה לנוח בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, כמת את הזוהר באמצעות לומינומטר קריאת 96 בארות.