5-מתילציטוזין נקודה כתם כדי לקבוע את מידת מתילציה DNA

מתילציה של DNA היא שינוי אפיגנטי הכולל תוספת של קבוצת מתיל לבסיס הציטוזין של ה-DNA ליצירת 5-מתילציטוזין. שינוי זה משנה את ביטוי הגנים.

כדי לכמת מתילציה של DNA באמצעות כתמי נקודות, קח דגימות DNA גנומיות שמקורן בכונדרוציטים אנושיים בשלבים שונים של דה-דיפרנציאציה המציגים רמות שונות של ציטוזין שעבר מתילציה.

טפלו בדגימות ה-DNA בנתרן הידרוקסיד - אלקלי חזק - וחממו אותן. טיפול זה שובר את קשרי המימן בין שני גדילי ה-DNA, וכתוצאה מכך דנטורציה של DNA. הוסף אמוניום אצטט כדי לנטרל את האלקלי, ולמנוע פירוק מוגזם של DNA.

קח קרום ניילון ואתר דגימות DNA מפוגלות כנקודות. ה-DNA הטעון שלילית נקשר לקרום הניילון הטעון חיובית באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, וכתוצאה מכך הוא נמחק על התמיכה המוצקה.

טפל בקרום המוכתם עם מאגר חוסם כדי למנוע קשירה לא ספציפית. לאחר מכן, הוסף נוגדנים נגד 5-מתילציטוזין לממברנה, ודגירה. נוגדנים אלה נקשרים אך ורק לציטוזין שעבר מתילציה ב-DNA.

שטפו כדי להסיר את הנוגדנים הלא קשורים, והוסיפו נוגדנים משניים מצומדים לאנזים כימילומינסנט הנקשרים באופן ספציפי לנוגדנים הראשוניים.

הוסף מצע כימילומינסנט על הממברנה. האנזים על הנוגדן מגיב עם הסובסטרט כדי לייצר כימילומינסנציה - ומניב נקודות בעוצמות שונות.

דמיין את הממברנה ומדוד את עוצמות הנקודות התואמת את מידת המתילציה של ה-DNA בכל דגימה.

התחל הליך זה על ידי דנטורציה של ה-DNA המבודד בנתרן הידרוקסיד 0.1 מולרי למשך 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס. נטרלו את ה-DNA עם אמוניום אצטט מולארי אחד על קרח, ולאחר מכן דללו פי שניים במים מזוקקים כפולים.

השלב הקריטי ביותר בכתם הנקודות הוא איתור הדגימות על הממברנה, עשו זאת לאט ובזהירות. נסה למזער כל אזור מנומר לקוטר של 3 עד 4 מילימטרים.

בעזרת קצה פיפטה צר פה, אתר בזהירות 2 מיקרוליטר של ה-DNA הגנומי המדולל הסדרתי על קרום ניילון טעון חיובית במרכז הרשת. כתם את הממברנה בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, חסום את אתרי קשירת הנוגדנים הלא ספציפיים על ידי השריית הממברנה ב-5% BSA ב-TBST בצלחת פטרי של 10 סנטימטר למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.

לאחר שעה יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ב- TBST למשך 5 דקות בכל פעם. דגרו את הממברנה עם נוגדן חד שבטי אנטי-5-מתילציטוזין של עכבר ב-TBST בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ב- TBST למשך 5 דקות בכל פעם.

לאחר מכן, דגרו עם נוגדן משני - אימונוגלובולין כבשים מצומד חזרת פרוקסידאז נגד עכברים G ב-TBST למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הממברנה ב- TBST כמו קודם, הוסיפו את מצע האנזים לקרום ודגרו למשך 5 עד 10 דקות. לבסוף, דמיין את אות הנוגדן המשני באמצעות ערכת כימילומינסנציה בהתאם להוראות היצרן.