יצירת גנגליון שורש גבי, חציל ותרבית תאים מנותקת

התחל עם גנגליון שורש גבי או רקמות DRG במדיום נטול סרום. רקמת ה-DRG מכילה נוירונים חושיים ותאי גליה לווייניים המשובצים במטריצה החוץ-תאית, ECM.

זרעו אותם על צלחת תרבית מצופה בתערובת חלבון ג'לטינית כדי לשפר את הידבקות הרקמות.

עם הזמן, תאי גליה משחררים גורמי גדילה נוירוטרופיים המאפשרים הרחבות עצביות, ויוצרים תרבית אקספלנט DRG.

כדי לפתח תרבית תאים מנותקת, קח את צמחי ה-DRG הללו בשפופרת. טפלו בהם בקולגנאז כדי לפרק ECM ולאחר מכן בטריפסין, המשבש את קשרי התאים, ומשחרר נוירונים ותאי גליה.

הוסף מדיום מועשר בסרום כדי לעצור את התגובה האנזימטית.

פזרו את התכולה שוב ושוב כדי ליצור מתלה חד-תאי וסננו אותו כדי להסיר פסולת.

צנטריפוגה תרחיף תא זה והסר את הסופרנטנט המכיל אנזים.

השעו מחדש את התאים בתווך נוירו-בסיסי והעבירו אותם לצלחת מצופה למינין.

תאי גליה לווייניים ונוירונים חושיים נצמדים לצלחת המצופה למינין, ויוצרים תרבית תאים מנותקת.

מעבירים כל DRG לצלחת פטרי יבשה מזכוכית. תחת מיקרוסקופ כירורגי, נקה וחתוך עודפי סיבים ורקמת חיבור שעדיין מחוברים ל-DRG באמצעות להב. ניתן לזהות בקלות את ה-DRG כמבנה בולט ושקוף לאורך עצב עמוד השדרה הלבן וכלי דם נמצאים לעתים קרובות סביב ה-DRG.

לאחר מכן, הניחו את הניקוי ל-DRG בצלחת פטרי חדשה המכילה חומר קר כקרח ונטול סרום. יש לדלל את תערובת החלבון הג'לטינית במצע קר כקרח ונטול סרום ביחס של 1 ל-1. לאחר מכן, צלחו את ה-DRG ex vivo בצלחות של 12 בארות, מצופות מראש ב-10 או 20 מיקרוליטר של תערובת חלבון ג'לטיני, ושמרו אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות.

כעת, הוסף בעדינות 1.5 עד 2 מיליליטר של מדיה נטולת סרום למערכת התרבית כדי לכסות את כל האקספלנט ולשמור על האקספלנטים בתנאי גידול. החלף את מצע הגידול DRG כל 72 שעות. ולתת ל-DRG לצמוח כל עוד צריך.

זהו שלב קריטי מכיוון ש-DRG מעוגן לצלחת הזכוכית באמצעות תערובת החלבון הג'לטיני. לכן, זמן של פילמור ומיומנויות פיפטינג הם קריטיים כדי למנוע ציפה.

בהליך זה, הניחו את כל ה-DRG שנאסף בצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר עם חומר F12 המכיל קולגנאז IV, ודגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר מכן, החליפו את החומר הטרי המכיל קולגנאז IV, ודגרו על הדגימה למשך 45 דקות נוספות. לאחר מכן, טפל בצמחים עם 2 מיליליטר של חומר F12 המכיל 0.025% טריפסין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

מיד לאחר הטיפול בקולגנאז IV, דגרו אותם עם 2 מיליליטר של חומר F12 המכיל סרום בקר עוברי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את האקספלנטים שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של מדיה F12, והמשיכו לנתק אותם מכנית עם פיפטה מזכוכית, עד שהמדיה הופכת לעכורה.

לאחר מכן, סנן את תרבית התאים המנותקת דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר זיהומים ועודפי רקמת חיבור. לאחר מכן, צנטריפוגה של התא המסונן ליזאט למשך שתי דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מדיה נוירו-בסיסית. הנח את התאים המנותקים על מגלשות כיסוי מצופות למינין בצפיפות תאים מועדפת.