חקר ההשפעה של חומרי הדברה על Caenorhabditis elegans נוירונים

התחל עם צלחת אגר המכילה Caenorhabditis elegans טרנסגני המבטא חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים או GFPs בנוירונים שלהם.

הוסף מים סטריליים לצלחת, סובב אותם כדי להרים את התולעים והעביר אותם לצינור.

הניחו לתולעים להתיישב, ואז הסירו את עודפי המים והשעו אותם מחדש.

העבירו את התולעים המרחפות לצלחת מצופה חומרי הדברה ולצלחת בקרה ללא חומר הדברה, ולאחר מכן דגרו.

בהתבסס על פעולותיהם, חומר ההדברה פוגע באופן ספציפי בנוירונים מסוימים וגורם לנפיחות עצבית, מה שמפחית את ביטוי ה-GFP.

העבירו את התולעים על כרית אגרוז המכילה חומר הרדמה, ולאחר מכן הניחו כיסוי.

התקן את השקופית על מיקרוסקופ פלורסנט. ראשית, דמיין את התולעים באמצעות מצב ניגודיות פאזה, ולאחר מכן עבור למצב פלואורסצנטי.

בתולעים שטופלו בחומרי הדברה, נוירונים מציגים פלואורסצנטיות מופחתת, סומות נפוחות ופערים בתהליכים עצביים, מה שמעיד על השפעות ניווניות של מערכת העצבים.

בזמן הביקורת, נוירונים בריאים מראים סומה שלמה עם פלואורסצנטיות בהירה.

בעזרת מקום מיקרופיפטה, 1 מיליליטר מים סטריליים על צלחת הנמטודות. לאחר מכן, סובבו את המים סביב כדי להרים את הנמטודות. לאחר מכן, הסר את הנוזל עם הנמטודות לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר 10 דקות, כאשר הנמטודות מתיישבות על ידי כוח הכבידה, הסר בזהירות לפחות 500 מיקרוליטר מהמים והשליך.

לאחר מכן, השעו מחדש את הנמטודות, ובעזרת קצה פיפטה צהוב חתוך, הסירו 50 עד 100 מיקרוליטר של תולעים תלויות לכל צלחת טיפול, וודאו שבכל צלחת יש לפחות 10 תולעים בוגרות. הכן שתי שקופיות על ידי הנחת פיסת סרט תווית בצד אחד בלבד של השקופית ליצירת כרית בעובי אחיד.

לאחר מכן, מקם מגלשה נקייה ולא בשימוש ביניהם על הספסל. הניחו טיפה של 10 מיקרוליטר של אגרוז מומס על מרכז המגלשה באמצעות מיקרופיפטור לאחר מכן, שטחו את הטיפה על ידי הנחת שקופית נקייה נוספת בניצב למגלשה עם הטיפה והפעילו לחץ כך שיטיפת האגרוז תיצור את עובי סרט התיוג.

לאחר מכן, הפעל לחץ יציב כדי להפריד בין שתי המגלשות. לאחר מכן, הניחו את המגלשה כשצד האגר כלפי מעלה על הספסל, והניחו לה להתייבש במשך דקה עד שתיים לפני השימוש. כדי להוסיף נמטודות לשקופית המוכנה עם כרית האגרוז, הוסיפו טיפת מים של 5 מיקרוליטר המכילה 1 טוחנת של נתרן אזיד לכרית האגר, שתרדים את התולעים ותגייס אותן.

לאחר מכן, העבירו לפחות 10 נמטודות לכל שקופית טיפול לטיפה באמצעות קיסם תולעים, אותו יש לעקר לפני ואחרי העברת הנמטודות. לאחר מכן, הוסף כיסוי באמצעות מלקחיים על ידי הנחתו בזווית והורדתו לאט.

לאחר מכן, הנח את התושבת הרטובה המוכנה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להתבונן בתולעים, תחילה בהגדלה של פי 10 וניגודיות פאזה, ולאחר מכן בהגדלה של פי 40 עם ניגודיות פאזה ותאורה פלואורסצנטית.

הנח תושבת רטובה מוכנה אחת בכל פעם על המיקרוסקופ stage ואבטח אותו במקומו באמצעות מהדקי המיקרוסקופ stage. לאחר מכן, התחל view התושבות הרטובות עם מטרת ההגדלה הנמוכה ביותר, שהיא בדרך כלל פי 10. והשתמש בשדה בהיר או בניגודיות פאזה כדי לדמיין ולהתמקד בנמטודות.

ברגע שנמטודה ממוקמת בשדה הראייה, התמקדו בה באמצעות כפתור המיקוד העדין במיקרוסקופ. לאחר מכן, העבר את התאורה לפלואורסצנטיות על ידי סיבוב החוגה והפנה את האור למצלמה כדי ללכוד את התמונות הדיגיטליות.

לאחר מכן, התאימו את התאורה באמצעות תוכנת ההדמיה כך שתאי העצב יהיו מוארים בבהירות, אך לא רוויים יתר על המידה. בשלב מסוים, השג תמונה נפרדת של סרגל באותה הגדלה כמו תמונות התא כדי לספק סולם הגדלה לדמותם.