JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio

Full Text

21,979 Views

06:43 min

September 30, 2011

DOI: 10.3791/3165-v

Corinna Singleman¹, Nathalia G. Holtzman¹

¹Department of Biology,Queens College, City University of New York

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

שיטה ברורה, תקנית לנתיחה ובידוד של הלב דג הזברה בשלבים התפתחותיים מרובים מתוארים. טכניקות ביאור וכימות הם דנו גם.

Transcript

המטרה הכוללת של הליך זה היא להסיר את הלב מדגי הזברה. זה מושג על ידי איסוף ותיקון דגי זברה תחילה. לאחר מכן, חלל הגוף נפתח כדי לדמיין את הלב.

לאחר מכן מסירים את הלב ומנקים אותו מרקמה שאינה לבבית. לבסוף, הלב מצולם. בסופו של דבר, ניתן לראות את המורפולוגיה של הלב לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה, חתך וצילום.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמפתח לדיסקציה. קשה ללמוד סטות מכיוון שדגי הזברה קטנים והרקמות אינן מובהקות בצבע ויכולות להיות קשות לזיהוי כדי ליצור דגי זברה מהזחלים דרך שלבים בוגרים. עבור ניסויים אלה, בצע הזדווגות אגס בודד או קבוצתי עם דגים בוגרים.

נקו את העוברים ואחסנו אותם באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס. חמישה ימים לאחר ההפריה, הפרד דגים למכלים בצפיפות של 10 עד 15 דגים והכניס אותם למתקן הדגים. הוציאו את הדג מהמיכל שלו בגיל המתאים והניחו אותו ב-0.2% טריקה להרדמה.

מניחים את הדג המורדם במי קרח למשך 15 דקות להמתת חסד. בינתיים, הוסף 4% פרה פורמלדהיד או PFA ב-XPBS אחד למנה. דגירה על דגים שנאספו ב-4% PFA למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר, ואז לילה בארבע מעלות צלזיוס בצלחת פטרי עטופה בפרפיל.

זה שומר על הדג שטוח ומקל על הנתיחה לאחר הקיבוע. יש לשטוף פעמיים ב-PBS עם 0.1% Tween או PBT ניתן לשמור דגים ב-PBT ב-4 מעלות צלזיוס עד 10 ימים. מניחים דג בודד בצלחת פטרי, חצי מלאה ב- PBS טרי ומניחים אותו על צדו הימני.

מדוד את אורך הדג מהחוטם ועד בסיס הזנב, לא כולל סנפירי הזנב באמצעות קליפר מילימטר דיגיטלי. זהו האורך הסטנדרטי או sl. הקצו לכל דג צירוף אותיות מספרים כדי לאפשר מעקב אחר דג בודד והלב המנותח שנוצר לניתוח מאוחר יותר.

הזן את כל הנתונים, כולל כל המדידות בגיליון אלקטרוני ומאורגן על סמך תוויות אלה לפני החיתוך. סמן רצועות צינור PCR עם מספר מעקב שהוקצה ומלא צינורות עם PVT או פתרון אחר המתאים לניתוח נוסף. כוונו את אתר הגחון של הדג כלפי מעלה בצלחת פטרי תוך ייצוב הגוף במלקחיים, החזקת הראש בין העיניים והזימים לדגים קצרים מ-12 מילימטרים באורך סטנדרטי.

שימוש במלקחיים חדים או במיקרו-מחט במחזיק סיכה. הסר את שרירי החזה והסנפירים מהגוף כדי לחשוף את הלב. התנועה המתמדת של המלקחיים במהלך הדיסקציה עלולה לגרום לזרמים ב-PPT שמניעים את הדגים.

זה בעייתי במיוחד עבור דגים קטנים יותר. לפיכך, יש להשתמש במיקרו-מחט כדי להסיר את שרירי החזה והסנפיר ולפתוח את חלל הגוף. השתמש במלקחיים כדי להוציא בעדינות את הלב מהחלל מתחת לאטריום.

אם הדג מכיל סמן לב פלואורסצנטי, השתמש במשקף פלואורסצנטי לדיסקציה וודא את הסרת הלב על ידי פלואורסצנטיות. לאחר הוצאת הלב מהחלל, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלב ובמיקרו-מחט כדי להסיר רקמה נוספת שאינה לבבית ואת רירית האפיקרדיאל מהחלק החיצוני של הלב. לדגים שאורכם עולה על 12 מילימטרים באורך סטנדרטי.

בעזרת מספריים מיקרו עם ידית קפיץ, בצע שלושה חתכים. ראשית, בצע חתך רוחבי דרך הזימים. שנית, בצע חתך רוחבי נוסף בבטן הקדמית.

ושלישית, בצע חתך סגיטלי בצד הגחון המחבר את שני החיתוכים הרוחביים. בעזרת מלקחיים חדים, הסר את שרירי החזה והסנפירים מהגוף כדי לפתוח את חלל הגוף ולחשוף את הרקמה הכסופה של קרום הלב. הסר את רקמת קרום הלב הזו והלב ייראה לעין.

השתמש במספריים המיקרו כדי לחתוך את העורק המחובר לעורק הבולבוס הממוקם מעל הלב. לאחר חיתוך העורק הזה, הניחו את קצות המלקחיים מתחת לאטריום והשתמשו במלקחיים כדי להוציא את הלב מהחלל. אם יש רקמה נוספת שמגיעה עם הלב, זה בסדר כי ניתן להסיר אותה מאוחר יותר.

לחלופין, בחלק מהדגים אפשר להסיר את הלב על ידי משיכת הבולבוס בעדינות החוצה ושאר הלב יבוא בעקבותיו. היזהר ממיקום האטריום אם אתה משתמש בטכניקה החלופית מכיוון שהוא עלול להינזק בקלות. אם יש רקמה נוספת שמגיעה עם הלב, זה בסדר וניתן לנקות אותו לאחר מכן.

לאחר הוצאת הלב מהחלל, השתמש בשני המלקחיים כדי להחזיק את הלב ולהסיר את הרקמה הנוספת או זוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את הלב ומיקרו-מחט כדי להסיר רקמה נוספת שאינה לבבית. כדי לצלם את לב דג הזברה, הכינו צלחת אגר פטרי מזינה של 23 גרם לליטר וכסו את האגר המוצק ב-PBS. השתמש במלקחיים כדי ליצור באר באגר המאפשרת ללב להתאים לכיוון הנכון.

הסר את הלב מצינור ה-PCR על ידי החזקת קצה הבולבוס. עם המלקחיים בחוזקה. מניחים את הלב בצלחת האגר.

כוון את הלב באגר כדי לצלם. ניתן לסובב את הדגימה לאחר כל תמונה לכל הכיוונים האפשריים. השתמש בזמני חשיפה עיליים, אור וקצרים כדי לצלם את הלבבות.

בצע התאמות לאיכות האור באמצעות החשיפה לפי הצורך כדי להשיג את הצילום הטוב ביותר. דוגמה ללב נקי מנותח היטב מוצגת כאן. לכל לב יהיו כמה הבדלים במורפולוגיה הכוללת, אך הלב צריך להיות שלם ולהכיל פרוזדור חדר שלם ועורקים בולבוסיים לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התפתחות הלב של דג הזברה לחקור את התבגרות הלב בשלבים שונים של התפתחות דג הזברה.

Explore More Videos

לביולוגיה התפתחותית גיליון 55 דג הזברה Danio rerio לב דיסקציה מורפולוגיה לב אנטומיה נוער מבוגרים