בעקבות Cell-גורל ב
14 באוקטובר 2011
מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום של א coli חיידקים, בעקבות תוצאת הזיהום מתחת למיקרוסקופ, וניתוח של תוצאות זיהום.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לעקוב אחר סולפט ב-e coli בזמן אמת לאחר הדבקה על ידי פאג lambda. התחילו ביצירת ליזאט גס של פאג lambda. לאחר מכן, טהרו את הפאג והדביקו e coli באמצעות פאג lambda בתוך מבחנה.
המשיכו לעקוב אחר גורל התאים החיידקיים תחת המיקרוסקופ. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות בזמן אמת גורלים תאיים שונים ב-e coli באמצעות ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים שונים הקשורים לצמיחת תאים או למותם. באופן כללי, שלב בדיקה בשיטה זו הוא יצירת מלאי מpurified front ו-FI מסומן.
כדי למנוע התגבשות במהלך ההכנה והטיהור, יש לאפיין גם את פרמטרי הדמיון תחת המיקרוסקופ כדי לאפשר צמיחה תקינה של התאים. יש להחדיר תרבית לילה של E 3 92 Lambda LZ one PPL star D למצע LBM בצפיפות תאים של OD 600 סביב 0.6, ולהשרות את הליגן באמבט מים רועד בטמפרטורה של 42 °C.
המשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 °C עד להופעת הליזיס. התרבית תהפוך לשקופה. כעת הוסיפו 2% כלורופורם, ולאחר מכן דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, העבירו את הליזט של הפאג לבקבוקים של 250 מיליליטר וסובבו את התרבית בצנטריפוגה. לאחר מכן, אספו את העילוי המכיל את חלקיקי הפאג ובצעו סבוב שני בצנטריפוגה להסרת שיירי תאים נראים, בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים לטיטרציה של פאגים. מדדו את ריכוז הפאג, ולאחר מכן טהרו את הפאג באמצעות גרדיאנט של cesium chloride ובדקו את הפעילות באמצעות DPI לצורך הכנת לוחות aro.
נקה שש זכוכיות מיקרוסקופ באמצעות 70% ethanol. סדר חמש זכוכיות כפי שמוצג וקבע אותן בעזרת סרט דביק. כעת, שפוך תמיסה של 1.5% aros במדיום על הזכוכיות המקובעות.
הניחו את השקופית האחרונה למעלה, תוך הימנעות זהירה מבועות אוויר. הניחו משקולת מעל והמתינו ש-AROS יתקרר במשך כ-30 דקות. הסירו את ארבע השקופיות מהצד ועטפו את מקבץ השקופיות בניילון נצמד.
בעזרת תרבית לילה של חיידקים שעברו טרנספורמציה כאינוקולום, גדלו תרבית ב-LBMM, רססו מיליליטר אחד של חיידקים ותלו אותם מחדש. השעו את התאים לתוך 20 µL של LBMM קר במקרר בעזרת טיפ רחב של פיפטה.
הוסיפו 20 µL של פאג' מטהר. ערבבו בעדינות והדגירו תחילה על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר ספיגת פאג'ים. לאחר מכן, הדגירו באמבט מים בטמפרטורה של 35 °C למשך חמש דקות.
כדי להניע את הזרקת ה-DNA של הפאג', הפרידו אגרגטים של תאים באמצעות ערבוב. דללו את התערובת ביחס של 1 ל-10 ב-LBMM. כעת, הניחו לוח אגרו LBM.
הוסיפו זכוכית כיסוי מיקרומטרית מיקרוליטר אחד של תערובת הפאג' והתאים. לאחר הספיגה, הניחו בעדינות זכוכית כיסוי נוספת מעל. התחילו ברכישת סט תמונות דרך ערוץ ה-YFP עבור מסגרת הזמן הראשונית.
ציירו סדרה של 15 תמונות במרווחי ציר Z של 200 nanometer. בנוסף, צלמו תמונה בודדת ממוקדת דרך ערוצי הניגודיות המופעית (phase contrast) ו-m cherry. לאחר מכן, הקליטו סרט time-lapse של גורל התא לאחר הזיהום.
כדי למזער הלבנה (bleaching) ופוטו-טוקסיות במהלך סרט הצילום במרווחי זמן (time lapse), השתמשו בתמונה במיקום Z בודד לכל ערוץ בכל נקודת זמן, כאשר הדגימה נצפית בניגודיות פאזה (phase contrast) ובערוצי YFP ו-M cherry במרווחי זמן של 10 דקות למשך כארבע שעות. התחילו את ניתוח התמונות בספירה ידנית של הפאגים, ורשמו גם את מיקום הפאג ואת אורך התא. במסגרת הזמן הראשונית, רשמו את גורל התאים כליטיים, ליסוגניים או לא מזוהמים.
תעדו בנוסף את זמן הליזיס וכל מידע רצוי אחר באמצעות השמעת סרט ה-time-lapse, והפיקו מידע כמותי נוסף, כגון רמת פלואורסצנציה לאורך זמן בתאים בודדים, באמצעות אלגוריתמים אוטומטיים לזיהוי תאים ומעקב אחר שושלות (lineage tracing). בדרך כלל, הפlaques של הפאג'ים המסומנים פלואורסצנטית קטנים משמעותית מאלו של סוג הפרא (wild type), ואותי YFP ו-DAPI של פאג'ג שסונן בהצלחה ממוקמים יחד (co-localize). נתונים אלה משלבים סדרות תמונות של ערוצי phase contrast, YFP ו-M cherry, ואת התמונות החופפות המתאימות מתוך סרט ה-time-lapse.
הפאג'ים הבודדים נראים בבירור בנקודת הזמן הראשונית. כאן נראים שני תאים, כשכל אחד מהם נגפה על ידי פאג' בודד, ותא אחד נגפה על ידי שלושה פאג'ים. בדרך כלל, נראה מספר של פאג'ים על פני התא בעוד שפאג'ים אחרים אינם נספגים.
עם הזמן, ניתן להבחין בתוצאות ההדבקה. לאחר 80 דקות, שני התאים שהודבקו על ידי פאגים בודדים נכנסו כל אחד למסלול הליטי. בעוד שבתא שהודבק על ידי שלושה פאגים התרחשה ייצור תוך-תאי של פאגים חדשים, הוא נכנס למסלול הליסוגני המאופיין בייצור m Cherry מהפרומוטור.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יוצרים מלאי פאגים מטוהר להדבקת חיידקי e co באמצעות פאג lambda, וכיצד מבצעים דימות של מחזור החיים תחת המיקרוסקופ בזמן אמת.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להכנת בקטריופאג lambda מסומן פלואורסצנטית והדבקה שלו ב-E. coli, המאפשרת תצפית בזמן אמת על תוצאות ההדבקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- וירולוגיה
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- בקטריופאג lambda הוא אורגניזם מודל לחקר תהליכי זיהום נגיפיים.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות של פאגים עם תאי מאחס.
- דימיון בזמן אמת מספק תובנות לגבי גורל התא הבקטריאלי לאחר זיהום.
- הבנת אינטראקציות אלו יכולה לתרום למחקר רחב יותר בתחומי הווירולוגיה והמיקרוביולוגיה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לצפייה בהדבקה של E. coli על ידי בקטריופאג lambda.
- ניתוח גורלן של תאים בקטריאליים במהלך הדבקת פאג באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תיעוד הדינמיקה של הדבקת פאג בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ליזט גולמי של בקטריופאג lambda.
- טיהור חלקיקי פאג באמצעות סנטריפוגציה במדרג צסיום כלוריד.
- הדבקת E. coli בפאג המטוהר ודימוג לאחר מכן.
- מיקרוסקופיה של צילום במרווחי זמן (Time-lapse) למעקב אחר גורל התאים הבקטריאליים ודינמיקת הפאגים.
תוצאות עיקריות
- דימיג בזמן אמת חשף גורלות תאיים מובחנים: ליטי, ליסוגני או לא מזוהמים.
- אותים פלואורסצנטיים העידו על הדבקה ושכפול מוצלחים של פאגים.
- ניתוח כמותי של רמות הפלואורסצנציה סיפק תובנות לגבי בריאות התאים.
- תוצאות ההדבקה השתנו בהתאם למספר הפאגים שהדביקו תאים בודדים.
מסקנות
- השיטה שפותחה מאפשרת תצפית מפורטת על הדבקת פאגים ב-E. coli.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית יעילה לחקר דינמיקה ויראלית בזמן אמת.
- התובנות שיושגו יכולות לתרום להבנת הביולוגיה של הפאגים והאינטראקציות הבקטריאליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מעקב בזמן אמת אחר גורל התאים ב-E. coli לאחר זיהום בפאג למבדה מספק מודל ברזולוציה גבוהה לניתוח החלטות בינאריות על גורל התאים, ומספק מידע ישיר לאישור מטרות ולהפחתת סיכונים מכניסטיים במערכות מיקרוביאליות. גישה זו מאפשרת ניתוח כמותי של תוצאות הזיהום ברמת התא הבודד, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בנקודות השפעה מוקדמות של גילוי וסינון. המתודולוגיה רלוונטית באופן רחב עבור צוותי ביו-פארמה השואפים להבין אינטראקציות בין מאחס לפתוגן ולבצע אופטימיזציה של מערכות מודל תרגומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על החלטות גורל התא ברמת התא הבודד, ובכך מבהיר מסלולים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי הבחנה בין תוצאות ליטיות לליסוגניות בזמן אמת.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות פרמטרי זיהום ותוצאותיו על פני אירועים מרובים.
- משפר את הביטחון החזוי עבור בחינת מסלולים ובחירת מודלים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מגדיר קריאות מבוססות פלואורסצנציה שעברו תיקוף עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מסטנדרט את תנאי הבדיקה לצורך מדידה הדירה של תוצאות זיהום.
- מאפשר ניתוח כמותי בעל תוכן גבוה של גורל התא עבור סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות צינורות עיבוד אוטומטיים של דימוי וניתוח.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מדדי תוצאות זיהום למערכות מודל הרלוונטיות למחלה לצורך רצף תרגומי.
- מספקת סמנים ביולוגיים כמותיים של מצב הזיהום עבור מחקרי תיקוף פרה-קליניים.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי קישור תובנות מכניסטיות לתוצאות פנוטיפיות.
- תומכת בהפחתת סיכונים חזויה בתיקי מחקר של מיקרוביאליים ושל פתוגן-מארח.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך סריקה ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים, ובכך מאפשרת זרימה חלקה של נתונים וקבלת החלטות לאורך כל רצף המחקר והפיתוח (R&D).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרה של מסלולים ביולוגיים על ידי מעקב אחר גורל הזיהום ברזולוציה של תא בודד.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות בעלות תוכן גבוה ותוצרי סטטיסטיקה להשוואת תנאי זיהום.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי התאמת תוצרי הזיהום לרלוונטיות של מערכת המודל.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הדימיון ואנליזה הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים מגוונים של מיקרובים ואינטראקציות מא宿-פתוגן.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בניתוח גורל תאים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקביליות של בדיקות זיהום.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) ויעילות הון באמצעות אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות הקשורות למיקרובים וזיהומים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובניתוח כמותי של תמונות.
- מחייב גישה לפלטפורמות דימוג אוטומטיות ולכלי ניתוח חישוביים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדבקה ועיבוד נתונים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור זני חיידקים או מערכות פאג'ים שונות.
- יש לנהל את תופעות הפוטובליצ'ינג והפוטוטוקסיות במהלך דימוג בשיטת time-lapse.
