בעקבות Cell-גורל ב א coli לאחר זיהום על ידי phage מבדה
14 באוקטובר 2011
מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום של א coli חיידקים, בעקבות תוצאת הזיהום מתחת למיקרוסקופ, וניתוח של תוצאות זיהום.
המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לעקוב אחר סולפטים ב-e coli בזמן אמת לאחר הדבקה על ידי פאג lambda. התחל ביצירת ליזט גולמי (crude lysate) של פאג lambda. לאחר מכן טהר את הפאג והדבק e coli באמצעות פאג lambda בתוך מבחנה.
המשיכו לעקוב אחר גורל התאים הבקטריאליים תחת המיקרוסקופ. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות בזמן אמת גורלות תאים שונים ב-e coli באמצעות ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים שונים הקשורים לצמיחת התא או למותו. באופן כללי, בדיקה אחת לשיטה זו היא יצירת מלאי FI מטוהר ומסומן.
כדי למנוע שיתוף של סגמנטים במהלך ההכנה והטיהור, יש גם לאופטימיזציה את פרמטרי ההדמיה תחת המיקרוסקופ כדי לאפשר צמיחה בריאה של תאים. תמים תרבית לילה של E 3 92 Lambda LZ one PPL star D לתוך מצע LBM. כאשר צפיפות התאים היא OD 600 בסביבות 0.6, השרא את הlygen במכשיר ניעור בתוך מקבץ מים בטמפרטורה של 42 °C.
המשיכו לדגירה בטמפרטורה של 37 °C עד להופעת ליזיס. התרבית תהפוך לשקופה. כעת הוסיפו 2% chloroform, ולאחר מכן דגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
בשלב הבא, העבירו את הליזט של הפאג' לבקבוקים של 250 milliliter וסובבו את התרבית בצנטריפוגה. לאחר מכן, אספו את העילאי המכיל את חלקיקי הפאג' ובצעו סבב צנטריפוגה שני להסרת שאריות נראות בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים לדילול פאג'ים. מדדו את ריכוז הפאג', טהרו את הפאג' באמצעות מדרג צסיום כלורי ובחנו את הפעילות באמצעות DPI לצורך הכנת לוחות aro.
נקה שש זכוכיתות מיקרוסקופ באמצעות 70%ethanol. סדר חמש זכוכיתות כפי שמוצג והדבקן בעזרת סרט דביק. כעת, שפוך תמיסה של 1.5%aros במדיום על הזכוכיתות המקובעות.
הנח את השקופית האחרונה למעלה, תוך הימנעות זהירה מיצירת בועות אוויר. הנח משקולת מעל והמתן לקירור ה-AROS במשך כ-30 דקות. הסר את ארבע השקופיות מהצד ועטוף את גוש השקופיות בניילון נצמד.
בעזרת תרבית לילה של חיידקים שעברו טרנספורמציה כאינוקולום, גדלו תרבית ב-LBMM, צנטריפוגו מילליטר אחד של חיידקים למשקע ובצעו רספנסיה. השעו את התאים ב-20 microliters של LBMM קר בקרח באמצעות טיפ פחית רחב.
הוסיפו 20 µL של פאג' מופק. ערבבו בעדינות והדגירו ראשית על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר ספיגה של הפאג'. לאחר מכן, הדגירו באמבט מים בטמפרטורה של 35 °C למשך חמש דקות.
כדי להפעיל את הזרקת ה-DNA של הפאג', הפרד את מקבצי התאים על ידי ערבוב. דלל את התערובת ביחס של 1 ל-10 ב-LBMM. כעת הנח לוח LBM agro.
הוסיפו זכוכית כיסוי אחת של מיקרוליטר של תערובת תאי הפאג'ים על זכוכית כיסוי. לאחר הספיגה, מקמו בעדינות זכוכית כיסוי נוספת מעל. התחילו ברכישת סט תמונות דרך ערוץ ה-YFP עבור מסגרת הזמן הראשונית.
צלמו סדרה של 15 תמונות במרווחי ציר Z של 200 nanometer. בנוסף, צלמו תמונה בודדת ממוקדת דרך ערוצי הניגודיות המופזית (phase contrast) ו-m cherry. לאחר מכן, צלמו סרט time-lapse של גורל התא לאחר ההדבקה.
על מנת למזער הלבנה (bleaching) ורעילות פוטו-כימית במהלך סרט הצילום בשיטת time lapse, השתמשו בתמונה במיקום Z בודד לכל ערוץ בכל נקודת זמן; צלמו את הדגימה בניגודיות פאזה (phase contrast) ובערוצי YFP ו-M cherry במרווחי זמן של 10 דקות למשך כארבע שעות. התחילו בניתוח התמונות באמצעות ספירה ידנית של הפאגים, ורשמו גם את מיקום הפאג ואת אורך התא. בפרק הזמן הראשוני, תיעדו את גורל התא: ליטי, ליסוגני או לא מזוהם.
תעדו בנוסף את זמן הליזיס וכל מידע רצוי אחר על ידי השמעת סרט ה-time-lapse; חלצו מידע כמותי נוסף, כגון רמת פלואורסצנציה לאורך זמן בתאים בודדים, באמצעות אלגוריתמים אוטומטיים לזיהוי תאים ומעקב אחר שושלות תאים. בדרך כלל, הפlaques של הפאגים המסומנים פלואורסצנטית קטנים משמעותית מאלו של סוג הבר (wild type), ואותות ה-YFP וה-DAPI של פאג שנוקה בהצלחה ממוקמים באותו מיקום (co localize). נתונים אלה משלבים סטים של תמונות בערוצי phase contrast, YFP ו-M cherry, ואת התמונות המדורגות התואמות מסרט time-lapse.
הפאג'ים הבודדים נראים בבירור בנקודת הזמן הראשונה. כאן נראים שני תאים שכל אחד מהם נדבק על ידי פאג' בודד, ותא אחד שנדבק על ידי שלושה פאג'ים. בדרך כלל, ניתן לראות מספר פאג'ים על פני התא בעוד שפאג'ים אחרים אינם נספחים.
עם הזמן, תוצאת ההדבקה הופכת למובחנת. לאחר 80 דקות, שני התאים שהודבקו על ידי פאגים בודדים נכנסו each למסלול הליטי. עם ייצור תוך-תאי של פאגים חדשים, התא שהודבק על ידי שלושה פאגים נכנס למסלול הליסוגני, המסומן על ידי ייצור m Cherry מה-pre-motor.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה באופן יצירת מלאי פאגים מטוהר להדבקת חיידקי e co באמצעות פאג lambda, ובביצוע דימוי של מחזור החיים תחת מיקרוסקופ בזמן אמת.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להכנת בקטריופאג lambda מסומן פלואורסצנטית והדבקה שלו ב-E. coli, המאפשרת תצפית בזמן אמת על תוצאות ההדבקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- וירולוגיה
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- בקטריופאג lambda הוא אורגניזם מודל לחקר תהליכי זיהום נגיפיים.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות של פאגים עם תאי מאחס.
- דימיון בזמן אמת מספק תובנות לגבי גורל התא הבקטריאלי לאחר זיהום.
- הבנת אינטראקציות אלו יכולה לתרום למחקר רחב יותר בתחומי הווירולוגיה והמיקרוביולוגיה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לצפייה בהדבקה של E. coli על ידי בקטריופאג lambda.
- ניתוח גורלן של תאים בקטריאליים במהלך הדבקת פאג באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תיעוד הדינמיקה של הדבקת פאג בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ליזט גולמי של בקטריופאג lambda.
- טיהור חלקיקי פאג באמצעות סנטריפוגציה במדרג צסיום כלוריד.
- הדבקת E. coli בפאג המטוהר ודימוג לאחר מכן.
- מיקרוסקופיה של צילום במרווחי זמן (Time-lapse) למעקב אחר גורל התאים הבקטריאליים ודינמיקת הפאגים.
תוצאות עיקריות
- דימיג בזמן אמת חשף גורלות תאיים מובחנים: ליטי, ליסוגני או לא מזוהמים.
- אותים פלואורסצנטיים העידו על הדבקה ושכפול מוצלחים של פאגים.
- ניתוח כמותי של רמות הפלואורסצנציה סיפק תובנות לגבי בריאות התאים.
- תוצאות ההדבקה השתנו בהתאם למספר הפאגים שהדביקו תאים בודדים.
מסקנות
- השיטה שפותחה מאפשרת תצפית מפורטת על הדבקת פאגים ב-E. coli.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית יעילה לחקר דינמיקה ויראלית בזמן אמת.
- התובנות שיושגו יכולות לתרום להבנת הביולוגיה של הפאגים והאינטראקציות הבקטריאליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מעקב בזמן אמת אחר גורל התאים ב-E. coli לאחר זיהום בפאג למבדה מספק מודל ברזולוציה גבוהה לניתוח החלטות בינאריות על גורל התאים, ומספק מידע ישיר לאישור מטרות ולהפחתת סיכונים מכניסטיים במערכות מיקרוביאליות. גישה זו מאפשרת ניתוח כמותי של תוצאות הזיהום ברמת התא הבודד, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בנקודות השפעה מוקדמות של גילוי וסינון. המתודולוגיה רלוונטית באופן רחב עבור צוותי ביו-פארמה השואפים להבין אינטראקציות בין מאחס לפתוגן ולבצע אופטימיזציה של מערכות מודל תרגומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על החלטות גורל התא ברמת התא הבודד, ובכך מבהיר מסלולים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי הבחנה בין תוצאות ליטיות לליסוגניות בזמן אמת.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות פרמטרי זיהום ותוצאותיו על פני אירועים מרובים.
- משפר את הביטחון החזוי עבור בחינת מסלולים ובחירת מודלים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מגדיר קריאות מבוססות פלואורסצנציה שעברו תיקוף עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מסטנדרט את תנאי הבדיקה לצורך מדידה הדירה של תוצאות זיהום.
- מאפשר ניתוח כמותי בעל תוכן גבוה של גורל התא עבור סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות צינורות עיבוד אוטומטיים של דימוי וניתוח.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מדדי תוצאות זיהום למערכות מודל הרלוונטיות למחלה לצורך רצף תרגומי.
- מספקת סמנים ביולוגיים כמותיים של מצב הזיהום עבור מחקרי תיקוף פרה-קליניים.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי קישור תובנות מכניסטיות לתוצאות פנוטיפיות.
- תומכת בהפחתת סיכונים חזויה בתיקי מחקר של מיקרוביאליים ושל פתוגן-מארח.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך סריקה ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים, ובכך מאפשרת זרימה חלקה של נתונים וקבלת החלטות לאורך כל רצף המחקר והפיתוח (R&D).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרה של מסלולים ביולוגיים על ידי מעקב אחר גורל הזיהום ברזולוציה של תא בודד.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות בעלות תוכן גבוה ותוצרי סטטיסטיקה להשוואת תנאי זיהום.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי התאמת תוצרי הזיהום לרלוונטיות של מערכת המודל.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הדימיון ואנליזה הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים מגוונים של מיקרובים ואינטראקציות מא宿-פתוגן.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בניתוח גורל תאים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקביליות של בדיקות זיהום.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) ויעילות הון באמצעות אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות הקשורות למיקרובים וזיהומים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובניתוח כמותי של תמונות.
- מחייב גישה לפלטפורמות דימוג אוטומטיות ולכלי ניתוח חישוביים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדבקה ועיבוד נתונים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור זני חיידקים או מערכות פאג'ים שונות.
- יש לנהל את תופעות הפוטובליצ'ינג והפוטוטוקסיות במהלך דימוג בשיטת time-lapse.
