בעקבות Cell-גורל ב א coli לאחר זיהום על ידי phage מבדה

מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום של

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר סולפט באי קולי בזמן אמת לאחר הדבקה על ידי פאג' למבדה. התחל ביצירת ליזאט גולמי של פאג' למבדה. לאחר מכן יש לטהר את הפאג ולהדביק אי קולי על ידי פאג' למבדה בצינור.

המשיכו לעקוב אחר גורל תאי החיידקים תחת המיקרוסקופ. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות בזמן אמת שומנים שונים בתאים באי קולי באמצעות ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים שונים הקשורים לצמיחה או למוות של תאים. בדרך כלל, בדיקה אחת לשיטה זו היא ביצירת חזית מטוהרת ומלאי FI מסומן.

כדי להימנע משיתוף תאנים במהלך ההכנה והטיהור, בצע אופטימיזציה גם של פרמטרי ההדמיה תחת המיקרוסקופ כדי לאפשר חיסון בריא לצמיחת תאים. תרבות בן לילה של E 3 92 Lambda LZ כוכב PPL אחד D לתוך LBM. מדיה בצפיפות תאים של OD 600 בסביבות 0.6 גורמת לליגן בשייקר אמבט מים של 42 מעלות צלזיוס.

המשך לדגור ב-37 מעלות צלזיוס עד לניכר ליזה. התרבות מתבהרת. כעת הוסיפו 2% כלורופורם, ולאחר מכן דגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו את הפאג ליזט לבקבוקי 250 מיליליטר וצנטריפוגה את התרבות. לאחר מכן שחזר את הסופרנטנט המכיל את חלקיקי הפאג'ים ובצע צנטריפוגה שנייה כדי להסיר פסולת גלויה עם פרוטוקולי טיטרציה סטנדרטיים של פאג'ים. מדוד את ריכוז הפאג', ולאחר מכן טהר את הפאג דרך שיפוע צזיום כלוריד ובדוק את הפעילות עם DPI להכנת לוחות ארו.

נקה שש שקופיות מיקרוסקופ עם 70% אתנול. סדרו חמש שקופיות כפי שמוצג ואבטחו בעזרת סרט. כעת שפכו תמיסה של 1.5% ארוס בבינוני על המגלשות המאובטחות.

מקם את המגלשה האחרונה למעלה, הימנע בזהירות מבועות אוויר. מניחים משקולת מעל ומניחים ל-AROS להתקרר כ-30 דקות. הסר את ארבע השקופיות בצד וארוז את לוח השקופיות בניילון נצמד.

באמצעות תרבית לילה של חיידקים שעברו טרנספורמציה כחיסון, גדלו תרבית בכדור LBMM מיליליטר אחד של חיידקים והחייאה. השעו את התאים ל -20 מיקרוליטר קר כקרח. LBMM עם קצה פיפטה רחב.

הוסף 20 מיקרוליטר פאג' מטוהר. יש לערבב בעדינות ולדגור תחילה על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר ספיגת פאג'ים. ואז באמבט מים של 35 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

כדי להפעיל הזרקת DNA של פאג'ים, הפרד את כל אגרגטי התאים על ידי ערבוב. מדללים את התערובת מ-1 עד 10 ל-LBMM. עכשיו הניחו לוח אגרו LBM.

על פתק כיסוי, הוסף מיקרוליטר אחד מתערובת תאי הפאג'. לאחר הספיגה, הניחו בעדינות כיסוי נוסף מעל. התחל ברכישת ערכת תמונה דרך ערוץ YFP עבור מסגרת הזמן הראשונית.

צלם סדרה של 15 תמונות במרווחי ציר Z של 200 ננומטר. בנוסף, צלם תמונה אחת במיקוד דרך ניגודיות הפאזה וערוצי הדובדבן m. לאחר מכן רכשו סרטון זמן-lapse של גורל התא לאחר ההדבקה.

כדי למזער הלבנה ופוטוטוקסיות במהלך סרט ה-time lapse, השתמש בתמונת מיקום Z בודדת לכל ערוץ לכל תמונת נקודת זמן, הדגימה בניגודיות פאזה תעלות דובדבן YFP ו-M בכל פעם, מרווחים של 10 דקות למשך כארבע שעות. התחל לנתח את התמונות עם ספירה ידנית של פאג'ים, וגם רשום את מיקום הפאג'ים ואת אורך התא. במסגרת הזמן הראשונית, רשום את גורל התאים של ליטיים, ליזוגניים או לא נגועים.

תעד גם את זמן הליזיס וכל מידע רצוי אחר על ידי הפעלת סרט הזמן-lapse, חלץ מידע כמותי יותר כמו רמת הקרינה לאורך זמן בתאים בודדים באמצעות אלגוריתמים אוטומטיים לזיהוי תאים ומעקב אחר שושלת. בדרך כלל, הפלאקים של הפאג'ים המסומנים בפלואורסצנט קטנים משמעותית מאלה של סוג הבר ואותות YFP ו-DAPI של פאג'ים מטוהרים בהצלחה מתמקמים. נתונים אלה משלבים ערכות תמונות של ערוצי דובדבן YFP ו-M עם ניגודיות פאזה, ותמונות הכיסוי המתאימות מסרט דולג זמן.

הפאג'ים הבודדים נראים בבירור במסגרת הזמן הראשונית. כאן נראים שני תאים שכל אחד מהם נגוע בפאג' יחיד, ותא אחד נגוע בשלושה פאג'ים. בדרך כלל, מספר פאג'ים נראים על פני התא בעוד שפאג'ים אחרים אינם נספגים.

עם הזמן, ניתן להבחין בתוצאת ההדבקה. 80 דקות לאחר מכן, שני התאים הנגועים בפאג'ים בודדים נכנסו כל אחד למסלול הליטי. עם ייצור תוך-תאי של פאג'ים חדשים, התא הנגוע בשלושה פאג'ים נכנס למסלול הליזוגני המסומן על ידי ייצור m Cherry מהקדם-מוטורי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מלאי פאג'ים מטוהר כדי להדביק חיידקי e על ידי פאג' למבדה, ולבצע הדמיית אורח חיים תחת מיקרוסקופ בזמן אמת.