Name: בעקבות Cell-גורל ב א coli לאחר זיהום על ידי phage מבדה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: למדו שיטה לצפייה בזיהום E. coli על ידי בקטריופאג' למבדה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרוטוקול כולל הכנת ליזט גולמי, טיהור בגרדיאנט צזיום כלוריד, ומעקב אחר גורל התאים הליטי או הליזוגני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים למיכאל Feiss וז&#39;אן עם הקש להדרכה על יצירת phage וטיהור. אנו מודים למיכאל Elowitz לאספקת תוכנה לזיהוי התא, Schnitzcell. עבודה במעבדת גולדינג נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (R01GM082837), הקרן הלאומי למדע (082265, PFC: מרכז לפיסיקה של תאי חיים), קרן וולש (גרנט Q-1759) ומדע Frontier אנוש התכנית (RGY 70/2008).

<ol><li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switches+in+bacteriophage+lambda+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+genetic+switch+%3A+phage+lambda+revisited%22">A genetic switch : phage lambda revisited</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendrix%2C+RW+%22Lambda+II%22">Lambda II</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1983).</li>
<li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHershey%2C+AD+%22The+Bacteriophage+lambda%22">The Bacteriophage lambda</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1971).</li>
<li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. , John Wiley & Sons. (1994).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFasman%2C+GD+%22Practical+handbook+of+biochemistry+and+molecular+biology%22">Practical handbook of biochemistry and molecular biology</a>. , CRC press. (1989).</li>
<li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li>
<li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.</li>
<li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host%3A+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

זני חיידקים, וphage פלסמידים: מתח LE392 הוא supF. הוא נבחר כדי לדכא Sam7 המוטציה בגנום phage (ראה טבלת מס &#39;1 לפרטים נוספים). לפיכך, lysogens המושרה סופו של דבר lyse ושחרור חלקיקי phage, כפי שיהיה גם תאים נגועים שבחרו מסלול מוסס. התאים גדלים Lysogenic של 30 ° C בשל הנוכחות של הטמפרטורה הרגישה CI 857 אלל בגנום פאג. לאחר אינדוקצית חום, GPD-EYFP והפראי הסוג GPD הם שיתוף המתבטאים מהגנום של λ LZ1 וpPlate פלסמיד * D בהתאמה. כתוצאה מכך, של capsid החדש שנוצר phage λ LZ2 מכיל תערובת של חלבוני GPD GPD-EYFP ו. phage פסיפס זה הוא יציב מבחינה מבנית ומספיק ניאון כדי לאפשר זיהוי של פאגים בודדים 5. PP רי - mCherry הוא כתב פלסמיד המשמש לאיתור בחירת lysogenic pathway. RE P האמרגן מופעל על ידי כת&quot;ש בהקמת lysogeny 1,11. PP רי - mCherry 5 נגזר מPE-GFP 11 על ידי החלפת GFP עם 12 mCherry. לפרטים נוספים ראה את העבודה שלנו לפני 5. פרמטרי מצב צמיחה: במהלך אינדוקצית lysogen (סעיף 1), רעידות קלות ב 180 סל&quot;ד נותנות תשואת וירוס טובה 13. השימוש בגלוקוז במדיום הגידול יש להימנע ככל שחילוף חומרים של הגלוקוז מייצר מוצרים מטבוליות חומציים, וחלקיקי מבדה בוגרים אינם יציבים ב pH חומצי 13. התוספת של 4 MgSO נועדה לייצב phage 3 capsid. לפאגים נושאים סוג CI הפרוע (במקום CI 857), lysogen יכול להיגרם באמצעות mitomycin הסוכן ה-DNA ניזק 3 ג&#39;. בשלב 1.3, הדגירה על 37 המעלות צלזיוס צריכה בדרך כלל לא תעלה על 90 דקות. זה usef<html> אול כדי לבדוק את צפיפות התא על ידי OD 600 בכל 30 דקות. לlysate טוב, OD 600 יורד לכ 0.2 או פחות, ונותר 600 OD הוא תוצאה של פסולת תא. דגירה ארוכה מדי עלולה לגרום לתשואה נמוכה מאז phage phage החדש שנוצר יכול להתחיל להזריק DNA שלהם לתוך תא פסולת. כדי להשיג להקת phage גלויה (לפחות 1 10 11 חלקיקי phage x) בשלבים ו2.11 2.13, לגדול תרבות מ&quot;ל לפחות 500 בשלב 1.2. התוספת של 0.2% למלטוז מדיום גידול בצעדי 5.1 ו 5.2 מיועדת לזירוז ביטוי של כבש, הקולטן לפאג מבדה ספיחת 3,14. דילול 1000-לקפל במקום 100-לקפל בשלב 5.2 נועד להקטין את רמת רקע mCherry מRE הכתב פלסמיד PP - mCherry. בשלב 5.5 להזרקת דנ&quot;א phage מפעיל, 35 ° C נבחר כדי להימנע מגיוס של אלל cI857 הרגיש לטמפרטורה. טיהור phage: jove_content &quot;&gt; שלבי טיהור phage (שלבים 2.1 עד 2.11) יכולים להיות מוחלפים עם פרוטוקולי טיהור אחרות 5, אבל ultracentrifugation הסופי דרך שיפוע שיווי המשקל CsCl (צעדים ו2.12 2.13) הוא בלתי נמנע. הרוטורים דלי Swinging יש צורך בצעדי 2.10 2.12 ועד להבטיח להקות phage גלויות חדות. קבלת מניות phage טהורות יכולה בקלות לקחת עד שבוע, ולכן יש צורך לבדוק את כייל phage לאורך הדרך כדי לוודא ששום דבר משתבש במהלך שלבי ביניים. טיפול phage: במהלך כל הליכי הטיהור בסעיף 2, זה קריטי לטפל phage lysate עדינות, כדי למנוע הטית זנבות phage מראשי phage. במהלך הדבקת תא בסעיף 5 (למשל, צעדי 5.5 דרך 5.7), הוא גם קריטי כדי למנוע ההטיה של חלקיקי phage מהתא הנגוע. שים לב שאם phage הוא טעון מהתא הנגוע לאחר הזרקת ה-DNA שלו, התוצאה היא זיהום &quot;אפל&quot;, כלומר בתוצאת fection תהיה נצפתה בניסוי, אבל phage מדביק לא. כדי למזער את בעיות כאלה, אנו משתמשים קצה פיפטה רחבה בכל פעם שטיפול פאגים או תערובת phage / תא. DAPI בדיקה: מכתים את מניות phage עם DAPI (סעיף 4) היא שיטה מהירה ויעילה כדי לבדוק את הטוהר של מניית פאג. זה גם יכול לשמש כדי לבדוק לפירוק אפשרי של מניות phage קיימות לאורך זמן. למניות טהורות, שיתוף הלוקליזציה של אותות YFP וDAPI תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי צריכה להיות קרוב ל 100%. אנחנו בדרך כלל לצפות כי פחות מ 1% מנקודתי YFP אינם מכילים DAPI (המייצג capsids ללא הגנום הנגיפי), המצביע על כך שהחלקיקים אלה לא לארוז את ה-DNA הנגיפית בהצלחה או כבר הזריק DNA שלהם במקום אחר. פחות מ 1% מנקודתי DAPI אינם מכילים YFP (מתאים לפאגים שאינם ניאון). אם זה לא המקרה, צעדי 2.12 דרך 2.14 צורך לחזור בorder לטהר שוב. בכל קשורים לפרמטרי הדמיה, התקנת מיקרוסקופ בשלב 4.3 היא לא קריטית כמו בסעיף 5, כי אין הדמיה ארוכת טווח חי תאים נדרשת כאן. עם זאת, שמירה על הגדרות מיקרוסקופיה כמו בסעיף 5 היא שימושית אם רוצה לכייל את עוצמת הקרינה של חלקיק phage אחת. אם לוח PBS-agarose הוא לא מאוד נקי, או יותר מדי DAPI צבע משמש, כמה נקודות מתאימות ל-DNA phage DAPI עשויות להיות מוקפות ב&quot; הילה &quot;. אם צבע DAPI מעט מדי נעשה שימוש, את האות מערוץ DAPI עשויה להיות חלשה מאוד. מערכת מיקרוסקופ: להדמיה בסעיף 6, נסתכל במיקרוסקופ epifluorescence הפוך מסחרי (Eclipse TE2000-E, ניקון) עם מטרת 100x (התכנית Fluo, צמצם מספרי 1.40, טבילת שמן) וקובע מסנן רגיל (ניקון). מקור האור פלואורסצנטי הוא מנורת קשת עם שליטה בעוצמת אור. התכונות הבאות הן מבוקר מחשב: X, Y ו Z position; שדה בהיר ותריסי קרינה; ובחירת מסנן קרינה. תכונת פוקוס אוטומטי נדרשה. אחרת, ייתכן שההתמקדות בקלות להיסחף במהלך סרט זמן לשגות (בדרך כלל 4 שעות ארוכות). היכולת לרכוש מרובות (x, y) עמדות בכל נקודת זמן היא שימושית, שכן היא מאפשרת לעקוב אחר אירועי זיהום מרובים במקביל. אנחנו בדרך כלל לרכוש 8 עמדות במה בכל סרט, בעקבות אירועים עד 100 זיהום. המצלמה אנו משתמשים היא מקורר 512x512 CCD עם פיקסל מצלמת מיקרומטר 16x16 עם טווח דינמי של 16 סיביים (Cascade512, Photometrics). רכישה מתבצעת באמצעות MetaMorph תוכנה (התקנים מולקולריים). מיקרוסקופ צריך להיות ממוקם בחדר עם הטמפרטורה מבוקרת, או לחלופין, את שלב המיקרוסקופ צריך להיות מוקף בחדר עם בקרת הטמפרטורה. יבוא תמונות: עבור הדמית חית תאים, זה הוא קריטי כדי למנוע חשיפה מיותרת של המדגם, אשר עלול להוביל להלבנה ופtotoxicity. לכן, הדרך טובה ביותר לאפיין את המערכת שלך כדי למצוא את חשיפת אור אופטימלית המאפשרת זיהוי פלואורסצנטי ואילו לא מוביל לצמיחת תאי הלבנה מוגזמת או עיכוב. כדי לקבל תמונה טובה פלואורסצנטי, לשחק עם עוצמת האור המרגש, זמן חשיפה ורווח מצלמה. בצעדים 6.2-6.3, מרווח המסגרת 10 דקות נבחר למטרה למזער חשיפה לאור. בכל מסגרת, רק תמונה אחת בפוקוס יש צורך בשלב ניגוד (להכרת תא) וערוצי ניאון (לקביעת גורל תא). בנקודת הזמן הראשונה, לעומת זאת, תמונות מרובות Z-עמדה דרך ערוץ YFP נדרשות כדי ללכוד את כל פאגים מדביקים על פני התא. זמן חשיפת YFP במסגרת הראשונית עלול גם צריך להיות גבוה יותר מזו המשמשת לסרט זמן לשגות במסגרות הזמן מאוחר יותר. ניתוח תמונה: ספירת חלקיקי phage בזהירות רבה מסביב לתא השטח בשלב 7.1. כמואמור לעיל, לנקוט בשורה של Z-ערימות דרך ערוץ YFP בשלב 6.2. עם זאת, זה עדיין עשוי להשאיר כמה חלקיקי ניאון phage מחוץ למיקוד, המאתגר את הספירה. אורך התא במסגרת הזמן הראשונית נמדד באמצעות תוכנת Metamorph. אורך התא גם יכול להימדד ImageJ או כלי תוכנה אחרות. בנוסף, תכנית נבנתה Matlab אוטומטית בית יכולה להיות מאוד שימושית בקבלת מידע כגון שינוי פלואורסצנטי לאורך הזמן לאורך שושלות תאים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> סיגמא </td><td> R4642-10 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM חיץ </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> סיגמא </td><td> C3011-250 </td></tr><tr><td> מזרק </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> מחט </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> קלטת דיאליזה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> שקופית מיקרוסקופ </td><td> קורנינג </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> צינור SW40Ti אולטרה ברור </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> צינור SW60Ti אולטרה ברור </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti הרוטור </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti הרוטור </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refractometer </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ Epifluorescence </td><td> ניקון </td><td> ליקוי TE2000-E </td></tr></tbody></table> טבלת 2. ריאגנטים וציוד.

בעקבות cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

המערכה המהווה bacteriophage (פאג) למבדה וחיידק E. coli שמש זמן רב כדוגמה לנחישות 1,2 תא גורל. בעקבות הזיהום בו הזמני של התא על ידי מספר פאגים, אחד משני מסלולים נבחר: 3,4 מוסס (ארסי) או lysogenic (רדום). לאחרונה פתחנו שיטה לתיוג פאגים בודדים fluorescently, והצליחו לבחון את ההחלטה לאחר פגיעה בזמן אמת מתחת למיקרוסקופ, ברמה של 5 פאגים ותאים בודדים. כאן, אנו מתארים את ההליך המלא לביצוע ניסויי הזיהום המתוארים בעבודתנו הקודמת 5. זה כולל יצירה של פאגים ניאון, זיהום של התאים, הדמיה מתחת למיקרוסקופ וניתוח נתונים. Phage הניאון הוא שיתוף מבטא-גרסות &quot;היברידיות&quot;, סוג פרוע וYFP היתוך של חלבון GPD capsid. Lysate phage גולמי הושג לראשונה על ידי גרימת lysogen של GPD-EYFP (Enhanced חלבון) phage פלורסנט הצהוב, חסת סוג הבעת GPD פראי פלסמיד. סדרה של שלבים לטיהור הם בצעו אז, אחרי DAPI תיוג והדמיה מתחת למיקרוסקופ. הדבר נעשה במטרה לאמת את האחידות, יעילות אריזת ה-DNA, אות פלואורסצנטי ויציבות מבנית של מניית פאג. הספיחה הראשונית של פאגים לחיידקים מתבצעת על קרח, ואז אחרי דגירה קצרה ב 35 ° C כדי לעורר הזרקת DNA נגיפית 6. Phage / תערובת חיידקים ואז עבר למשטח של גוש דק תזונתי אגר, מכוסה coverslip וצלם תחת מיקרוסקופ epifluorescence. התהליך שלאחר הזיהום במעקב במשך 4 שעות, במרווח דקות 10. עמדות שלבים מרובות מעקב כזה ש~ 100 זיהומים סלולריים יכולים להיות נעוצים בניסוי אחד. בכל נקודת זמן ומקום, תמונות שנרכשו בשלב הניגוד והערוצים אדומים וירוקים זרחניים. תמונת שלב הניגוד משמשת מאוחר יותר לאוטומטי celהכרת l בעוד ערוצי הניאון משמשים לאפיין את תוצאת הזיהום: ייצור של פאגים ניאון חדשים (ירוק) ואחרי תמוגה תא, או ביטוי של גורמי lysogeny (אדום) ואחריו צמיחה וחלוקת תאים התחדש. את הסרטים שנרכשו זמן לשגות מעובדים באמצעות שילוב של שיטות ידניות ואוטומטיות. תוצאות ניתוח נתונים בזיהוי פרמטרי זיהום לכל אירוע זיהום (מספר דוגמה ועמדות של הדבקת פאגים), כמו גם תוצאת זיהום (תמוגה / lysogeny). פרמטרים נוספים ניתן לחלץ במקרה צורך.

מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים, בעקבות תוצאת הזיהום מתחת למיקרוסקופ, וניתוח של תוצאות זיהום.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

המערכת המורכבת מבקטריופאג (פאג) למדא ומחיידק ה-E. coli שימשה מזה זמן רב כפרדיגמה לקביעת גורל התא1,2. בעקבות ה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לעקוב אחר סולפט ב-e coli בזמן אמת לאחר הדבקה על ידי פאג lambda. התחילו ביצירת ליזאט גס של פאג lambda. לאחר מכן, טהרו את הפאג והדביקו e coli באמצעות פאג lambda בתוך מבחנה.המשיכו לעקוב אחר גורל התאים החיידקיים תחת המיקרוסקופ. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות בזמן אמת גורלים תאיים שונים ב-e coli באמצעות ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים שונים הקשורים לצמיחת תאים או למותם. באופן כללי, שלב בדיקה בשיטה זו הוא יצירת מלאי מpurified front ו-FI מסומן.כדי למנוע התגבשות במהלך ההכנה והטיהור, יש לאפיין גם את פרמטרי הדמיון תחת המיקרוסקופ כדי לאפשר צמיחה תקינה של התאים. יש להחדיר תרבית לילה של E 3 92 Lambda LZ one PPL star D למצע LBM בצפיפות תאים של OD 600 סביב 0.6, ולהשרות את הליגן באמבט מים רועד בטמפרטורה של 42 °C.המשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 °C עד להופעת הליזיס. התרבית תהפוך לשקופה. כעת הוסיפו 2% כלורופורם, ולאחר מכן דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, העבירו את הליזט של הפאג לבקבוקים של 250 מיליליטר וסובבו את התרבית בצנטריפוגה. לאחר מכן, אספו את העילוי המכיל את חלקיקי הפאג ובצעו סבוב שני בצנטריפוגה להסרת שיירי תאים נראים, בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים לטיטרציה של פאגים. מדדו את ריכוז הפאג, ולאחר מכן טהרו את הפאג באמצעות גרדיאנט של cesium chloride ובדקו את הפעילות באמצעות DPI לצורך הכנת לוחות aro.נקה שש זכוכיות מיקרוסקופ באמצעות 70% ethanol. סדר חמש זכוכיות כפי שמוצג וקבע אותן בעזרת סרט דביק. כעת, שפוך תמיסה של 1.5% aros במדיום על הזכוכיות המקובעות.הניחו את השקופית האחרונה למעלה, תוך הימנעות זהירה מבועות אוויר. הניחו משקולת מעל והמתינו ש-AROS יתקרר במשך כ-30 דקות. הסירו את ארבע השקופיות מהצד ועטפו את מקבץ השקופיות בניילון נצמד.בעזרת תרבית לילה של חיידקים שעברו טרנספורמציה כאינוקולום, גדלו תרבית ב-LBMM, רססו מיליליטר אחד של חיידקים ותלו אותם מחדש. השעו את התאים לתוך 20 µL של LBMM קר במקרר בעזרת טיפ רחב של פיפטה.הוסיפו 20 µL של פאג' מטהר. ערבבו בעדינות והדגירו תחילה על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר ספיגת פאג'ים. לאחר מכן, הדגירו באמבט מים בטמפרטורה של 35 °C למשך חמש דקות.כדי להניע את הזרקת ה-DNA של הפאג', הפרידו אגרגטים של תאים באמצעות ערבוב. דללו את התערובת ביחס של 1 ל-10 ב-LBMM. כעת, הניחו לוח אגרו LBM.הוסיפו זכוכית כיסוי מיקרומטרית מיקרוליטר אחד של תערובת הפאג' והתאים. לאחר הספיגה, הניחו בעדינות זכוכית כיסוי נוספת מעל. התחילו ברכישת סט תמונות דרך ערוץ ה-YFP עבור מסגרת הזמן הראשונית.ציירו סדרה של 15 תמונות במרווחי ציר Z של 200 nanometer. בנוסף, צלמו תמונה בודדת ממוקדת דרך ערוצי הניגודיות המופעית (phase contrast) ו-m cherry. לאחר מכן, הקליטו סרט time-lapse של גורל התא לאחר הזיהום.כדי למזער הלבנה (bleaching) ופוטו-טוקסיות במהלך סרט הצילום במרווחי זמן (time lapse), השתמשו בתמונה במיקום Z בודד לכל ערוץ בכל נקודת זמן, כאשר הדגימה נצפית בניגודיות פאזה (phase contrast) ובערוצי YFP ו-M cherry במרווחי זמן של 10 דקות למשך כארבע שעות. התחילו את ניתוח התמונות בספירה ידנית של הפאגים, ורשמו גם את מיקום הפאג ואת אורך התא. במסגרת הזמן הראשונית, רשמו את גורל התאים כליטיים, ליסוגניים או לא מזוהמים.תעדו בנוסף את זמן הליזיס וכל מידע רצוי אחר באמצעות השמעת סרט ה-time-lapse, והפיקו מידע כמותי נוסף, כגון רמת פלואורסצנציה לאורך זמן בתאים בודדים, באמצעות אלגוריתמים אוטומטיים לזיהוי תאים ומעקב אחר שושלות (lineage tracing). בדרך כלל, הפlaques של הפאג'ים המסומנים פלואורסצנטית קטנים משמעותית מאלו של סוג הפרא (wild type), ואותי YFP ו-DAPI של פאג'ג שסונן בהצלחה ממוקמים יחד (co-localize). נתונים אלה משלבים סדרות תמונות של ערוצי phase contrast, YFP ו-M cherry, ואת התמונות החופפות המתאימות מתוך סרט ה-time-lapse.הפאג'ים הבודדים נראים בבירור בנקודת הזמן הראשונית. כאן נראים שני תאים, כשכל אחד מהם נגפה על ידי פאג' בודד, ותא אחד נגפה על ידי שלושה פאג'ים. בדרך כלל, נראה מספר של פאג'ים על פני התא בעוד שפאג'ים אחרים אינם נספגים.עם הזמן, ניתן להבחין בתוצאות ההדבקה. לאחר 80 דקות, שני התאים שהודבקו על ידי פאגים בודדים נכנסו כל אחד למסלול הליטי. בעוד שבתא שהודבק על ידי שלושה פאגים התרחשה ייצור תוך-תאי של פאגים חדשים, הוא נכנס למסלול הליסוגני המאופיין בייצור m Cherry מהפרומוטור.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יוצרים מלאי פאגים מטוהר להדבקת חיידקי e co באמצעות פאג lambda, וכיצד מבצעים דימות של מחזור החיים תחת המיקרוסקופ בזמן אמת.

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

אנו מתארים שיטה להפיל ביטוי גנים באוכלוסייה הולכת וגדלה של תאי E. coli באמצעות קלטות ביטוי sRNA ממוקדות רצף המועברות על ידי וקטור פגמיד M13.

משלוח בתיווך הפאג של ממוקדת Srna בונה להפיל Gene Expression ב<em&gt; E. coli</em

דור חדש של פלטפורמות תרגום תמלול חופשי תא תוכנן לבנות מערכות ביוכימיות במבחנה באמצעות הביצוע של ג'ין מעגלים. במאמר זה, אנו מתארים איך הם bacteriophages, כגון MS2, ΦΧ174 ו- T7, מסונתז מן הגנום שלהם באמצעות e. coli כל ללא תא TXTL המערכת.

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

בקטריופאג'ים (פאגים), נגיפים שמדביקים חיידקים, הם מרכיב אינטגרלי של מיקרוביום המעי. אף על פי שהתושבים הסימביוטיים האלה מניעים את הכושר החיידקי ואת דינמיקת האוכלוסייה, מעט מאוד מובן על האופן שבו הם משפיעים על הומאוסטזיס מעיים ומחלות. פרוטוקול זה חוקר פאגים T4 מבודדים בתוך מודל עכברי, הניתן להתאמה לזוגות פאגים-חיידקים אחרים.

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

בקטריופאג'ים, הנמצאים בכל מקום ומגוונים על פני כדור הארץ, מדביקים ומשתכפלים בתוך פונדקאים חיידקיים, וממלאים תפקיד מכריע במערכות אקולוגיות מיקרוביות. למרות חשיבותם, נוכחותם עלולה לשבש תהליכים תעשייתיים. פיתחנו שיטה המשתמשת בליפופוליסכרידים חיידקיים לסילוק בקטריופאג'ים מתרביות סלמונלה .

הסרת בקטריופאג' מתרביות סלמונלה נגועות

כאן אנו מתארים assay הרומן לניטור ספיגת הפריון וסחר על ידי תאים חיסוניים מיד לאחר חיסון intraperitoneal ידי מטהרים fluorescently תיוג מוטות הפריון מצטבר חומר במוח נגועים אז ניטור ספיגת שלהם תנועה מאתר ההזרקה ואפיון התאים לתווך את האירועים הללו.

ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג'ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

למדו שיטה לצפייה בזיהום E. coli על ידי בקטריופאג' למבדה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרוטוקול כולל הכנת ליזט גולמי, טיהור בגרדיאנט צזיום כלוריד, ומעקב אחר גורל התאים הליטי או הליזוגני.

בעקבות Cell-גורל ב

גלה סרטונים נוספים