Name: ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: למדו שיטת electroporation של morpholinos לרשתית דג הזברה המבוגר לחקירת תפקודי חלבונים ברегенרציה הרטינית. טכניקה זו מאפשרת הכבדת ביטוי מותנית של חלבוני מטרה ומסייעת בפיתוח טיפולים למחלות ניווניות ברשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות מדעי החיים פריימן מרכז מרכז צוות מחקר דג הזברה לטיפול שלהם ותחזוקה של דג הזברה.

1. Morpholino הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל oligos morpholino צריכה להיות אישית מעוצבת והורה דרך GeneTools (Philomath, OR). אנו משתמשים באופן חיובי טעון lissamine-tagged morpholinos לכונן morpholinos electroporated לכיוון האלקטרודה השלילית. ניסינו, ללא הצלחה, יעד שלילי טעון והעמסת-tagged morpholinos אל האלקטרודה החיובית באמצעות טכניקה זו. מדולל 300 nmol של morpholino לתוך 100 μl מים nuclease ללא להניב פתרון 3 מ&quot;מ. Aliquot morpholino לתוך פרפין אטום צינורות מרובים microcentrifuge. אחסן הרחק אור בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז morpholino על ידי דילול 5 μl של morpholino (או מים המשמשים לדלל את morpholino כמו ריק) ב 95 μl של 0.1 N HCl. קבע את אורך הגל ספקטרופוטומטר (λ) עד 265 ננומטר. חשב את קבוע morpholino באמצעות המשוואה הבאה: משקל קבוע = מולקולרית מיוחדת morpholin שלךo X 1000/molar ספיגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכלו למצוא את משקל מולקולרי ונתונים על ספיגת טוחנת את גיליון &quot;אוליגו מאפיינים&quot; מסופק עם כל morpholino. נתח את ריק כדי לוודא קריאה בסיסית לקחת קריאות של כל morpholino בדילול מלא. הכפל את ספיגת ב 265 ננומטר של כל morpholino נקבע על ידי קבוע שלה על ידי פקטור התימהול כדי לקבל את ריכוז ng / μl. מחלקים את המספר הזה על ידי משקל מולקולרי כדי לקבוע את הריכוז מ&quot;מ. לדלל את morpholino, במידת הצורך, כדי ריכוז בעבודה. </li></ol> 2. הסרת השכבה הקרנית החיצונית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 6-12 מבוגר בן חודש דג הזברה ב Tricaine או 2-phenoxyethanol על 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מים טנק דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף דג הזברה תוך לחלח פיסת מגבת נייר, המכסה את הזימים, אבל משאיר בעין חשופה. דג עטוף ממוקם תחת stereoscope ואת ההגדלה הוא גדל עד קוטר של העין ממלא כשליש שלשדה הראייה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש דומון # 5 פינצטה, לתפוס את הקרנית החיצונית ליד הסדק אופטיים. רקמה זו היא בצבע אדום מסומן &quot;OC&quot; באיור 1. יש בליטה קלה או שפתיים מסומנים בחץ שכותרתו &quot;CL&quot;. משוך בזווית נמוכה (כלומר 10 מעלות) על פני העין להסיר את הקרנית החיצונית. עם תרגול, זה יכול להסתיים בתנועה אחת. אם להחליק פינצטה, לתפוס מחדש את רקמת ושוב למשוך בזווית נמוכה עד הוסרו. קרנית היטב המצורפת יכולה לגרום לעין להיעקר מהשקע כאשר שלף. אתה יכול לשמור את העין מן המועתקת ידי מייצבת עם קבוצה נוספת של פינצטה. </li></ol> 3. חיתוך הקרנית הזרקת morpholino: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הסרת הקרנית החיצונית, לעשות חתך קטן בקרנית היכן התלמיד עונה על קשתית (איור 2). הדבר נעשה באמצעות להב ספיר אזמל (ראו חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 0.5 μl של הפתרון mM morpholino 3.0 לתוך Hamiltעל מזרק מצויד במד 33 נשלף, בוטה לקצה המחט (ראו חומרים). פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר בתוך הקו. בזהירות להכניס את המחט אל תוך הזגוגית דרך חתך (איור 2). אל תכניס את המחט עמוק מדי או שאתה תהיה לנקב את הרשתית או לעקור את העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק את הפתרון morpholino לחלל vitreal. בהתאם לגיל של הדג, המרחב vitreal תקיים ~ 0.5 μl. אתה צריך לדמיין זגוגי צבוע דולף מתוך החתך כפי שהוא שנעקרו על ידי הפתרון morpholino. עד להזריק כמות קטנה של דליפות morpholino פתרון מתוך החתך. אתה צריך בבירור לדמיין את morpholino lissamine-tagged בתוך העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הזריקה, להחזיר את הדגים לאקווריום להתאושש. בדרך כלל אנחנו רק להזריק את עינו השמאלית, תוך שימוש בעין ימין כפקד uninjected, אבל electroporation של שתי העיניים אפשרי. </li></ol> 4. Electroporation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבאהזרקה של דגים כ 10, מחדש להרדים דגים מוזרק ועוטפים אותו בחתיכת לחלח של מגבת נייר, רק מכסה את הזימים, אבל משאיר בעין חשופה. מעבירים את הדג בצלחת פטרי. לבשי כפפות לטקס או דומה, כדי למנוע חשיפה ההרדמה. בעוד מחזיק בעדינות את הדגים אל החלק התחתון של התבשיל, למלא את הצלחת עם הרדמה (איור 3, פאנל משמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 מ&quot;מ בקוטר צלחת פלטינה אלקטרודה (ראו חומרים) localizes פולסים electroporation למחצית בקירוב של הרשתית. אנחנו בדרך כלל המטרה הרשתית הגבי. לחץ בעדינות את האלקטרודה החיובית כלפי מטה על מחצית הגחון של העין. עם הקרנית החיצונית מוסרת, העין בקלות לסובב, חושף את החלק הגבי של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם עדיין לוחצת על הצד הגחוני של העין, במקום אלקטרודה שלילית ליד (~ 1-2 מ&quot;מ) חצי הגב החשוף של העין. היזהר שלא לגעת אלקטרודה שלילית ישירות לעין, אשר תגרום נזקהרשתית הגבי. ברגע שאתה לקבוע את המרחק הראוי בין האלקטרודות, השתמש בורג התאמה על ידית של אלקטרודות, כדי לשמר את התפשטות כאשר electroporating. דבר זה שומר את האלקטרודה השלילית המרחק האופטימלי של גלגל העין, כאשר האלקטרודה החיובית נלחץ מטה בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate את העין באמצעות Electroporator CUY21 Square Wave (ראו חומרים). הפרמטרים electroporation יש להגדיר שני ברציפות של 50 msec קטניות, ב V 75 עם הפסקה 1-sec בין פולסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור דגים לאקווריום. אנחנו בדרך כלל מתחילים פרוטוקול שלנו ניוון אור המושרה קבוע ברשתית מיד לאחר electroporation. </li></ol> 5. נציג תוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 3-5 ימים לאחר electroporation (בהתאם ליציבות morpholino), את התווית lissamine ניתן דמיינו בכל שכבות הרשתית ברשתית מחולק (איור 4). זו משמשת אישור נוכחות שלשכותרתו morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו יכולים להשיג מציאה חלבון מלא עד 3-5 ימים לאחר electroporation, בהתאם ליעילות של morpholino (איור 5). בדרך כלל, במהלך לימודי טיפול באור, אנחנו הקציר עיניים 3 או 4 ימים לאחר electroporation morpholino. הדבר נעשה על ידי הסרת העין כולה עם מלקחיים דומון # 5B עם קצוות מעוגלים (איור 6; חומרים) ועיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה 15. כמו עם טכניקה כל מציאה, הפגנה של מציאה יעיל יש להראות על מנת לאמת את הפנוטיפ. לכן, אנו ממליצים antisera השגת חלבון העניין שלך. לחלופין, אם הנוגדן אינו זמין ואת morpholino מופנה גם את acceptor אחוי או אתר התורמות mRNA מראש, זה יחסום שחבור יעיל של ה-mRNA. במקרה זה, ניתן להשתמש הפוכה transcriptase-PCR כדי להגביר את רצפי איגוף ב RNA morphant ולקבוע את היעילות של חסימת splic נורמלידפוס ing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הרשתית הם מחולק מן האף אל הזמני על הציר הגבי הגחון, את הקופסאות הכחולות מוצל (איור 6) מייצג את אזורים של הרשתית אשר ניזוקים לרוב מהאירוע electroporation עצמו. תיבת ורוד מוצל מייצג את האזור כי הוא ממוקד מבוא morpholino לתאי הרשתית על ידי electroporation. </li></ol><img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי המתאר את הסרת שכבות האפיתל של הקרנית. הלוח השמאלי מציג את המאפיינים המבניים העיקריים של העין, כולל העדשה (L), הזגוגית (Vit), הרשתית (R), את הקרנית החיצונית (OC), את הקרנית הפנימית (IC), ואת בליטה קרנית ( CL). האוריינטציה של העין מוצג בפינה הימנית התחתונה של הפאנל הראשון מסומן קדמית (A), אחורי (P), הגבי (ד), ועל הגחון (V). צבע אדום מעיד על הקרנית החיצונית מוסר. הפאן השני<html> אל מראה כיצד מלקחיים המשמשים לתפוס את הבליטה הקרנית למשוך את הקרנית החיצונית על פני העין בזווית נמוכה (לוח ג&#39;). הפאנל הימני מראה כיצד זוג נוסף של מלקחיים ניתן להשתמש בעין יציב תוך משיכת הקרנית. <img alt="באיור 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> באיור 2. סכמטי של המעורבים הזריקה intravitreal של morpholino. חתך קטן עשה בעין היכן התלמיד עונה על איריס (פאנל משמאל). הפער שנוצר צריך להיות גדול מספיק עבור 33 מחט מד, אשר מתמלא הפתרון morpholino, להיות מוכנס (פאנל באמצע). לאט לאט להזריק 0.5 μl של פתרון לתוך הזגוגית (פאנל מימין). אתה צריך לדמיין כמות קטנה של פתרון vitreal לצאת החתך כמו הזגוגית מוחלפת בחלקה על ידי עם lissamine-tagged morpholino (פאנל מימין). ig3.jpg &quot;/&gt; באיור 3. סכמטי של ההליך electroporation בכלל. הדגים בהרדמה, אשר הוזרקו intravitreally עם morpholino, עטוף בעדינות במגבת נייר לחה (פאנל משמאל). מגבת נייר יש לכסות את הזימים, אך לא לחסום את העין (פאנל באמצע). לחץ בעדינות את האלקטרודה החיובית על החלק הגחוני של העין, מה שמאפשר חצי הגבי של העין כדי לסובב מתוך השקע. מניחים את האלקטרודה השלילית כ ​​1 מ&quot;מ מהמחצית הגבי של העין ולהתחיל את electroporation (פאנל מימין). <img alt="איור 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> איור 4. תמונה Confocal השוואת הרשתית electroporated ללא intravitreally הזרקת lissamine-tagged morpholino (א), וכן ברשתית מוזרק intravitreally ו electroporated עם lissamine-tagged morpholino (B). התווית lissamine נמצא בכל שכבות הרשתית סוגי תאים. ROS, מוט החיצונימגזרים; שכבת ONL, הגרעין החיצונית, שכבת INL, הגרעין הפנימי; GCL, תא שכבה גנגליון. <img alt="איור 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> איור 5. תמונות Confocal השוואת immunolocalization PCNA ב הרשתיות electroporated עם morpholino שליטה (פאנלים משמאל) הרשתיות electroporated עם morpholino אנטי PCNA (לוחות מימין) לפני מותו אור המושרה תא photoreceptor. Dark המותאמות דג הזברה לבקן מבוגר הושמו אור חזק מתמיד 1, 2, או 3 ימים לאחר electroporation של morpholino. Morpholino השליטה לא להדחיק ביטוי PCNA גוברת אור פגומים הרשתיות. אנטי PCNA morpholino ביעילות הפילו הביטוי PCNA חלבון דרך שלושה ימים של נזק קבוע אור חזק. <img alt="איור 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> סכמטי באיור 6. (פאנל משמאל) מראה enucleation של העין עבור processing ו cryosectioning, אשר נעשית לאורך הציר הגבי הגחון. תיבת מוצל ורוד (פאנל מימין) מראה את האזור ברשתית עם הסכום הגדול ביותר של חלבון מציאה באמצעות טכניקה זו. תיבות מוצלות כחול מייצגים אזורים שנפגעו לרוב על ידי האירוע electroporation. האוריינטציה של העין מתויג קדמית (A), אחורי (P), הגבי (ד), ועל הגחון (V).

<ol><li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li>
<li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li>
<li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li>
<li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li>
<li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li>
<li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li>
<li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis%2C+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li>
<li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li>
<li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li>
<li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li>
<li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li>
<li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li>
<li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+excitability%2C+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות

לאחרונה, שני ניתוחים microarray בדקו את ביטוי הגנים השינויים שחלו במהלך רגנרציה של הרשתית או אור פגום או תיקון רשתית בניתוח נכרת 10, 16. שני המחקרים גילה גנים רבים אשר הציג שינויים משמעותיים הביטוי, או להגדיל או להקטין, כי סביר נדרשים עבור אירועים שונים המתרחשים במהלך התחדשות הרשתית, כגון כניסה מחדש של גליה מולר לתוך מחזור התא, המשך התפשטות והגירה של אבות העצבית על השכבה הרשתית פגום, ואת הבידול של אבות העצבית לסוג התא לתקן את עצבי. אמנם השוואה ישירה של שתי קבוצות microarray נתונים לגלות גנים מועמדים שעשויים להיות מעורבים האירועים הללו הסלולר, בסופו של דבר הגנים הללו החלבונים המקודדים שלהם חייבים להיבדק כדי לקבוע אם הם נחוצים התחדשות הנוירונים. כאן, אנו מתארים גישה חזקה אובדן-of-פונקציה conditionally מציאה חלבונים עניין ברשתית דג הזברה מבוגר. טכניקה זו שימשה ללמוד שני חלבונים תאיים ו תאיים, וכן מולקולות איתות, גורמי שעתוק וחלבונים הדרושים שכפול הדנ&quot;א 17-19. לכן, שיטה זו סייעה רבות להבנת המנגנון המולקולרי שבבסיס התחדשות הרשתית הבוגרת דג הזברה. בדקנו פרמטרים electroporation מרובים (, מתח מספר פולסים, זמן בין הפולסים), לפני פרוטוקול מוצלח הושג. בדו&quot;ח הקודם של electroporating morpholinos לתוך סנפיר הזנב דג הזברה התחדשות בשימוש 10 פולסים במתח נמוך (15 V) 20. מכיוון הרשתית דג הזברה מבוגר מוקף שכבות תאים מרובים אינו נגיש בקלות אלקטרודות פינצטה, הפרמטרים המשמשים סנפיר צלחו בשעה ביעילות electroporating morpholinos לתוך הרשתית מבוגר. לעומת זאת, מתח גבוה (100 V) לעיתים קרובות מילulted מוות לדגים. לאחרונה, 5 פולסים של 80 V תוארה electroporate פלסמיד דנ&quot;א לתוך הרשתית עכבר שזה עתה נולד גור 21. מצאנו כי מעט פחות אינטנסיבי 2 פעימות של 75 הביא V ב electroporation מוצלח של morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה מבוגרים עם הישרדות של 100% מהדגים טופלו. בנוסף, גילינו כי הסרת החיצונית ביותר (או החיצונית ביותר) מרכיב של הקרנית בצורה ניכרת את יעילות electroporation. הגדלת מספר פעימות עשוי לבטל את הצורך הסרה של רקמה זו, אך עלולים גם הם לגרום נזק לרקמות גדולה יותר. מחקרים מקיפים הראו כי שליטה בפרמטרים הללו לא גרמו למוות משמעותי כל תא ברשתית או לשנות את התגובות הסלולר ספציפיים שנצפה במהלך photoreceptor התחדשות 19. Gain-of-לתפקד בלימודים אינם אפשריים כיום באמצעות טכניקה זו in vivo, בשל חוסר היכולת שלנו באופן עקבי electroporate חומצות ריבונוקלאית גדול לתוך כל retinal תאים. עם זאת, ההצלחה של electroporating פלסמידים לתוך הרשתית עכבר in vivo ו הרשתית דג הזברה ב explants מציע זה עדיין אפשרות של דג הזברה 21, 22. אחד היתרונות של טכניקה זו היא electroporation נראה ביעילות להציג את morpholino לתוך כל סוגי תאים ברשתית. עם זאת, חולשה פוטנציאלית היה electroporation ביעילות סיפק את morpholino לתוך רק באזורים ברשתית הגב מרכזי. אירוע electroporation second לקראת המחצית הגחון של תוצאות הרשתית בשנת מיקוד טוב כל השכבות, אבל לעתים קרובות גורם לנזק. זו מגבלה מרחבית סביר נבעה הצורה והמיקום של האלקטרודות. השימוש אישית מעוצבת בצורת כוס אלקטרודות שניתן להציב סביב העין עשוי לשפר את החולשה הזאת. זו מגבלה המרחבי של מסירת morpholino מגביל את השימוש בטכניקה זו מונע את השימוש של suc assayh כמו ניתוח ERG כי ידרוש הערכה גלובלית של הרשתית. יצוין כי כמו כל ניסוי morpholino, רצוי לאשר את התוצאות באמצעות שנייה, שאינן חופפות morpholino ל-mRNA היעד. במקרים מסוימים, ניתן גם electroporate two morpholinos שונים בו זמנית מציאה את הביטוי של שני חלבונים שונים. הראינו את זה על ידי דריסה ביטוי הן את Pax6a וחלבונים Pax6b, בנפרד או ביחד 18. למרות שאנו הדגימו את השימוש בטכניקה זו עם מודל נזק האור שלנו, זה יכול להיות בשימוש סביר ללמוד התחדשות במודלים של נזק אחר 2-8 או להשתמש כדי לבחון את תפקודם של חלבונים פגומים ברשתית. לדוגמה, electroporation של morpholinos יכול לשמש מציאה הביטוי של ערוצים ספציפיים או התמרה מולקולות איתות בתוך הגנגליון או תאים amacrine ולאחר מכן ללמוד את הפונקציה של אותות אלההמסלולים בעיבוד חזותי. עם זאת, כפי morpholinos רק להשפיע על התרגום של חלבון חדש, אפשר היה לחכות עד מחזור חלבון אנדוגני מתרחשת לפני assay ניתן לבצעו. תלוי ביציבות של החלבון, שיכול לנוע בין 18 שעות עד ימים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT או CUY21-SC Square גל electroporator </td><td> Protech הבינלאומי </td><td> CUY21EDIT או CUY21SC </td><td> יחידות שניהם עובדים עבור פרוטוקול זה </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ קוטר ההנעה אלקטרודות </td><td> Protech הבינלאומי </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino צריכים להיות מותאמים אישית שנועדו חלבון העניין שלך </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> סיגמא </td><td> 77861-1L </td><td> הרדמה: 1:1000 לדלל במים מערכת דגים ההליך, 1:500 עבור המתת חסד </td></tr><tr><td> דומון # 5 פינצטה </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td>14095 </td><td> כל # 5 פינצטה עם העבודה </td></tr><tr><td> דומון # פינצטה 5B עם טיפים זוויתי </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> 500234 </td><td> משמש המתת חסד העין enucleate הבאה </td></tr><tr><td> ספיר להב, קצה כפול רומח, 1 מ&quot;מ רחב, עם ידית סכין ספיר </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> Blade: 500314 לטפל: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> המילטון עם מזרק נשלף 33 מד בוטה סוף מחט </td><td> המילטון החברה </td><td> מזרק: 87930 מחט: 7762-06 </td><td> הסר את מחט המזרק שמגיע עם ולהחליפו 33-מד בוטה קצה מחט </td></tr></tbody></table>

ב electroporation vivo של morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

רבים מחלות עיניים תורשתיות הרסנית לגרום לעיוורון מתקדם ובלתי הפיך, משום שבני אדם לא יכולים להתחדש גוסס או חולה הנוירונים ברשתית. לעומת זאת, דג הזברה הרשתית מבוגר בעל יכולת חזקים כדי להתחדש באופן ספונטני כל הכיתה עצבי הולך לאיבוד במגוון רחב של דגמים שונים לנזק ברשתית, כולל לנקב רשתית, אבלציה כימית, חום גבוה ומרוכז, וטיפול אור חזק 1-8. המעבדה שלנו מאופיין בהרחבה התחדשות של photoreceptors בעקבות טיפול קבוע אור עז נוירונים ברשתית הפנימי לאחר intravitreal ouabain זריקה 2, 5, 9. בכל המקרים, תושב גליה מולר להזין מחדש את מחזור התא לייצר אבות העצבית, אשר ממשיכים להתרבות ולהעביר את שכבת הרשתית תקין, שבו הם להתמיין הנוירונים לקוי. אנו מאופיינים חמישה שלבים שונים במהלך רגנרציה של אור Damaהרשתית GED שהיו מודגשת על ידי התגובות הסלולר ספציפיים. זיהינו מספר גנים הביע דיפרנציאלי בכל שלב של התחדשות רשתית על ידי ניתוח ה-mRNA microarray 10. רבים מן הגנים האלה הם גם קריטי להתפתחות העין. כדי לבדוק את תפקידו של גן כל מועמד / חלבון במהלך רגנרציה רשתית, עלינו לפתח שיטה תנאי להגביל את הביטוי של החלבון מועמד רק בזמנים במהלך רגנרציה של הרשתית מבוגר. Oligos Morpholino נמצאים בשימוש נרחב ללמוד אובדן תפקוד של חלבונים ספציפיים במהלך הפיתוח של דג הזברה, Xenopus, אפרוח, עכבר, וגידולים xenografts אנושי 11-14. אלה basepair שונה oligos עם רצף RNA משלים או לחסום את שחבור או התרגום של רנ&quot;א היעד. Morpholinos יציבים בתא והוא יכול לחסל או &quot;מציאה&quot; חלבון ביטוי במשך שלושה עד חמישה ימים 12. כאן,אנו מתארים שיטה יעילה ביטוי חלבון מטרה מציאה ברשתית דג הזברה מבוגר. שיטה זו מעסיקה lissamine-tagged morpholinos antisense כי הם שהוחדר לתוך הזגוגית של העין דג הזברה מבוגר. בעזרת מלקחיים אלקטרודה, morpholino הוא electroporated מכן לתוך כל סוגי התאים של הרשתית הגב מרכזי. Lissamine מספק את האחראי על morpholino עבור electroporation וניתן דמיינו להעריך את הנוכחות של morpholino בתאי הרשתית. מציאה מותנה ברשתית יכול לשמש כדי לבחון את התפקיד של חלבונים מסוימים בזמנים שונים במהלך רגנרציה. בנוסף, גישה זו ניתן להשתמש כדי ללמוד את התפקיד של חלבונים ספציפיים ברשתית ניזוק, בתהליכים כגון התמרה חזותית עיבוד חזותי נוירונים מסדר שני.

שיטה א &#39;תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

מחלות עיניים תורשתיות הרסניות רבות מובילות לעיוורון פרוגרסיבי ובלתי הפיך, כיוון שבני אדם אינם מסוגלים לה 재생נרציה של תאי רשתית גוססים או חולים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לעכב או להשתיק (knock down) את הביטוי של חלבון ספציפי ברשתית של דג זברא בוגר. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת הקרנית החיצונית של עין הדג. לאחר מכן, נוקב חור קטן בקרנית הפנימית של העין.לאחר מכן, מוזרק ה-morpho הספציפי לגן אל החלל הזגוגית. לבסוף, ה-morpho מועבר לתאי הרשתית באמצעות אלקטרופורציה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ביטוי מופחת של חלבון המטרה, בין אם באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה של חתכי רקמת רשתית, ובין אם באמצעות immuno blotting.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות ניווניות של הרשתית, כגון retinitis pigmentosa. בשל הפוטנציאל להסביר את המנגנונים העומדים בבסיס השגשוג של תאי מילר גליאליים ברשתית פגומה, עשויים להימצא דרכים להשראת תגובה דומה בנזקים ברשתית האנושית. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התחדשות הרשתית ברשתית של דג זברא בוגר, ניתן לשנות אותה באופן קל כדי לספק מידע על תהליכים אחרים ברשתית, כגון תפקידן של חלבונים ספציפיים בהולכה פוטית או בעיבוד חזותי.הדגמה של הפרוצדורה שפותחה על ידי Dr.Ryan Tummel בעת שהיה פוסט-דוקטורנט במעבדתי, יחד עם Dr.Travis Bailey, פוסט-דוקטורנט נוכחי במעבדה. לפני העבודה עם הדגים, הכינו morphos המסומנים ב-lissamine ובעלי מטען חיובי, שניתן להחדיר לתאים באמצעות אלקטרופורציה, על ידי דילול של 300 NMO של Morpho לתוך 100 µL של מים נקיים מנוקלאז עד לקבלת תמיסה בריכוז 3 mM.כדי להסיר את שכבת הקרנית החיצונית, הרדימו דגי זברה בני שישה עד 12 חודשים ב-1 mg/mL של trica או ב-2% ethanol בתוך מיכל דגי הזברה. עטפו את דג הזברה בחתיכת נייר סופג לחה המכסה את הזימים אך משאירה את העין חשופה. הניחו את הדג העטוף תחת סטראיאוסקופ והגדילו את ההגדלה עד שקוטר העין ממלא כשליש משדה הראייה. לאחר מכן, בעזרת פינצטה Dumont מספר 5, תפסו את הקרנית החיצונית סמוך לסדק האופטי בנקודה של בליטה או שפה קלה כדי למנוע מהעין לצאת ממקומה.בעת הסרת הקרנית, ייצבו אותה בעזרת סט פינצטות נוסף. לאחר מכן, משכו בזווית נמוכה לרוחב העין כדי להסיר את הקרנית. מיד לאחר הסרת הקרנית החיצונית, השתמשו בסכין מנתחים עם להב ספיר כדי לבצע חתך קטן בקרנית, בנקודה שבה האישון פוגש את הקשתית.העבירו 0.5 µL מהתמיסת מורפו למזרק Hamilton המצויד במחט קהה נשלפת בכי মাপ 33. הניעו את התמיסה למעלה ולמטה כדי להוציא בועות אוויר מהקו. הכניסו בזהירות את המחט לתוך הזגוגית דרך החתך.אין להחדיר את המחט עמוק מדי כדי למנוע דקירה של הרשתית או הזזה של העדשה. מזגו לאט את תמיסת ה-morpho לחלל הזגוגית. זגוגית חסרת צבע תדלוף מהחתך ככל שתודח על ידי תמיסת ה-morpho.הזריקו עד שכמות קטנה של morpho דולפת מהחתך. ה-morino המסומן ב-lissamine צריך להיות גלוי בבירור בתוך העין. לאחר ההזרקה, החזירו את הדג למכל כדי שיתאושש, תוך שימוש בעין השנייה כביקורת לא מזורקת; הגדירו את פרמטרי האלקטרופורציה לשני פולסים רצופים של 50 millisecond במתח של 75 volts.בהפסקה של שנייה אחת בין הפולסים לאחר הזרקה לכ-10 דגים. הרדימו מחדש דג שהוזרק ועטפו אותו בחתיכת נייר לחה. המגבת צריכה לכסות רק את הזימים, אך להשאיר את העין חשופה.העבירו את הדג לצלוחית פטרי מלאה בחומר הרדמה. בעזרת כפפות, החזיקו בעדינות את הדג לתחתית הצלוחית המלאה בחומר ההרדמה, תוך הקפדה על טבילה מלאה של העין. כדי להתמקד ברשתית הגבית (dorsal retina), לחצו בעדינות את האלקטרודה החיובית כלפי מטה על החצי הגבני (ventral) של העין, ובכך גרמו לעין להסתובב ולחשוף את החלק הגבי של גלגל העין; בעודכם לוחצים על הצד הגבני, מקמו את האלקטרודה השלילית במרחק של 0.5 עד 1 מילימטר מהחצי הגבי החשוף של העין.הימנעו מהנחת האלקטרודה השלילית ישירות על העין, שכן הדבר יגרום לנזק לרשתית הגבית (dorsal retina). לאחר קביעת המרחק המתאים בין האלקטרודות,כווננו את הבורג הממוקם על ידית האלקטרודות כדי לשמור על מרווח קבוע עבור תהליכי אלקטרופורציה עוקבים. בצעו אלקטרופורציה לעין והחזירו את הדג למכל עם מי מכל טריים להתרעננות; מיד לאחר מכן, הכפיפו את הדג להליך הגורם לשינויים בביטוי גנים ברשתית, כגון דגנרציה רשתית המושרה על ידי תאורה קבועה.כאשר הרשתיות נחתכות מהצד הנחיר לצד הרקתי על פני הציר הגבי-בטני, המלבנים הכחולים המוצלים מייצגים את אזורי הרשתית שנפגעים לרוב מהאלקטורפורציה עצמה. המלבן הוורוד המוצל מייצג את האזור המיועד להחדרת מורפולינו לעתודת תאי הרשתית באמצעות האלקטרופורציה. כפי שניתן לראות כאן בתמונה מימין שלושה ימים לאחר האלקטרופורציה, סימון הליסמין עדיין נראה בכל השכבות ובכל סוגי התאים ברשתית נחתכת, כולל המקטעים החיצוניים של תאי המקל, השכבה הגרעינית החיצונית, השכבה הפנימית (inner plexiform layer) ושכבת תאי הגנגליון.התמונה הריקה משמאל היא מהעין שלא הוזרקה, שבה חסר lisamine tagged morino; ניתן להשיג השתקה מלאה של החלבון תוך שלושה עד חמישה ימים לאחר electroporation, בהתאם ליעילות של ה-morpho. בדוגמה זו, negative control morpho או A-P-C-N-A morpho הועברו ב-electroporation לרשתית, והרשתית הוסרה לאחר חשיפה לאור למשך יום אחד, יומיים או שלושה ימים; לאחר מכן הרקמה עובדה ונצבעה בשיטת immunostain עם נוגדני anti PCNA. תאים רבים חיוביים ל-PCNA (בירוק) נצפו בכל שלוש רשתית הבקרה, אך ביטוי ה-PCNA הופחת באופן משמעותי ברשתית שעובדה עם morphino.לאחר שתשלטו בטכניקה זו, אתם אמורים להיות מסוגלים לבצע את הפרוצדורה על כ-20 דגים בשעה אחת. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לא לגעת עם האלקטרודות ישירות בעין של הדג לאחר ביצוע הפעולה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון immunohistochemistry, situ hybridization, real time PCR ו-immuno blotting, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו מסלולים גנטיים נדרשים ברגנרציה של הרשתית.

in-vivo-electroporation-of-morpholinos-into-the-adult-zebrafish-retina

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה כדי לספק morpholinos ישירות otocyst דג הזברה ב 24hpf פותחה. שימוש microinjection של morpholinos לתוך לומן של שלפוחית ​​otic ו electroporation אפקט חדירה, הצלחנו לעקוף את ההשפעה של morpholinos על המוח ולקבל השפעות ספציפיות באוזן הפנימית.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

הפרוטוקול מתאר הפלה ממוקדת של ביטוי גנים בדגי זברה על ידי הזרקת מורפולינו בזנב.

הזרקת מורפולינו: שיטה להפיל ביטוי גנים במטרה לחקור תפקוד בדגי זברה

סרטון זה מתאר אלקטרופורציה in vivo, שהיא טכניקה להעברת דנ"א לתאים אפנדימוגליים בדגי זברה בוגרים.

ב Vivo אלקטרופורציה: שיטה ספציפית לאתר להעברת דגי זברה

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה למניפולציה של ביטוי גנים בתאי חדריות של telencephalon דג הזברה המבוגר באמצעות oligonucleotides morpholino antisense. אנו מציגים שיטה זו כפרוטוקול יעיל ומהיר שיכול לשמש למחקרים תפקודיים במוח החולייתנים המבוגר.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

אנו מציגים שיטה לניתוח אלקטרורטינוגרפי (ERG) של זחלי דג הזברה תוך שימוש בטכניקות מיקרומניפולציה ואלקטרורטינוגרפיה. זוהי שיטה פשוטה ופשוטה לבדיקת תפקוד חזותי של זחלי דג הזברה in vivo.

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

מוצג כאן הוא שיטת אלקטרופורציה עבור משלוח ה-DNA של הפלזמה ותיוג תא ependymoglial במבוגר בלדג טלנצאלון. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להמחיש ולעקוב אחר תאים ependymoglial בודדים ופותחת אפשרויות חדשות להחיל אלקטרופורציה על מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.

שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

למדו שיטת electroporation של morpholinos לרשתית דג הזברה המבוגר לחקירת תפקודי חלבונים ברегенרציה הרטינית. טכניקה זו מאפשרת הכבדת ביטוי מותנית של חלבוני מטרה ומסייעת בפיתוח טיפולים למחלות ניווניות ברשתית.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

גלה סרטונים נוספים