בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

אנו מספקים פרוטוקול תרבות מטוהרים מאוד נוירונים בהיפוקמפוס של המוח עכבר טרום לידתי ללא שימוש שכבת תא גלייה מזין.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולתרבות. נוירונים בהיפוקמפוס מטוהרים מאוד מעכברים לפני הלידה. זה מושג על ידי בידוד וניתוח תחילה של ההיפוקמפוס מרקמת עכבר עוברית.

השלב השני של ההליך הוא פירוק תאים בודדים על ידי כוח מכני, ואחריו טריפסין, איזציה וטיפול זהיר של רקמת המוח. לבסוף, התאים המנותקים נספרים ומתורבתים באמצעות מדיה נוירו-בזאלית ותוסף B 27. בסופו של דבר ניתן להשתמש בנוירונים מטוהרים בהיפוקמפוס בתרבית בטכניקות מולקולריות שונות כגון אימונופלואורסצנטיות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לדמיין את תהליך האיטרציה. הנטייה היא להיות נמרצים מדי בעת הפרדת התאים הבודדים מרקמת המוח. נדרשת תאים כלליים מוצלחים כדי להשלים את הליך התרבית העצבית כדי ליצור גורים טרום לידתיים לקצירת נוירונים.

קבעו רבייה בין עכברים בוגרים 19 יום לפני יום בידוד הנוירונים. ניתן לאשר הזדווגות מוצלחת על ידי זיהוי פקק נרתיקי בדפיקות הלב הנשיות או אישור חזותי להריון יום לפני בידוד הנוירונים. עבור יישומים אימונופלואורסצנטיים, כיסוי זכוכית מעיל מחליק בצלחת 24 בארות עם ציפוי קל של שלושה קולגן זנב עכברוש אחד, תמיסת פולי דה ליזין אחת מפזרת את התמיסה באופן שווה על החלקת הכיסוי, מניחה את הלוחות המצופים חשופים במכסה מנוע תרבית רקמות מתחת לאור UV למשך הלילה.

למחרת, שטפו את הצלחות עם HBSS סטרילי או אחסנו את הצלחות עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס בחושך. השריית HBSS קריטית לפעולה זו. עקר את כל המכשירים והשתמש רק בגזה סטרילית תוך הקפדה על הטכניקה.

ניתן להשלים את החיתוך והקציר של רקמה עצבית מחוץ למכסה זרימה למינרית. התחל את קצירת הרקמות על ידי עריפת ראשה של העכברה ההרה בערך 19 יום לאחר ההפריה. בעזרת מספריים ומלקחיים מנתחים צרו פתח בצד הגחון האמצעי של העכבר כדי לחשוף לחלוטין את חלל הגוף של העכבר.

גורים טרום לידתיים ימוקמו לכיוון החלק האחורי של חלל הגוף של העכבר וצריכים להיראות בקלות ברחם בעזרת מלקחיים. פתחו את הרחם והוציאו גורים. ערפו את ראשי הגורים במספריים והניחו את הראש על גזה מתחת למיקרוסקופ מנתח.

כדי לפתוח את הגולגולת, חתכו בזהירות את העור והגולגולת בעזרת אזמל סטרילי חד או מספריים מנתחים הסירו בזהירות את כל המוח בעזרת מלקחיים והניחו את המוח על גזה. בעזרת אזמל, הסר את המוח הקטן וחתך במורד קו האמצע של המוח. כדי להפריד אותו לשני חצאי כדור, אחזו בחלק קטן של קרומי המוח המקיפים את ההיפוקמפוס בעזרת מלקחיים ומשכו אותו בעדינות כדי להקל על דיסקציה של ההיפוקמפוס.

ההיפוקמפוס הוא מבנה מעוקל שמתחיל בחלק הדיסטלי של חצי הכדור ומתכופף בגחון. הצד הקעור הפנימי פונה לחדר, הוא הצד הקודאלי והוא כבר חופשי. כדי לבודד את ההיפוקמפוס, הרם בעדינות כל היפופוטם קמפי עם מלקחיים והעביר אותם לתבנית תרבית רקמה של 100 מילימטר.

עם שלושה מיליליטר של HBSS מחומם מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים, ניתן לשלב רקמת מוח ממספר גורים תוך שימוש בכל אמצעי הזהירות הסטריליים האפשריים. מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים, השתמש באזמל כדי לטחון בעדינות את רקמת המוח ב-HBSS. העבירו את רקמת הטחון ואת HBSS לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

הוסף 1.5 מיליליטר HBSS ו-0.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין של 0.25% לנפח כולל של חמישה מיליליטר. יש לכסות ולהפוך בעדינות את השפופרת ארבע או חמש פעמים. הימנע מייצור בועות או שהרקמה עלולה להילכד על הבועה ולא להתיישב בתחתית הצינור.

דגרו על הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. צינור הפוך כמו קודם כל חמש דקות לאחר הדגירה, הוצא בזהירות את התמיסה, והשאיר את הרקמה בתחתית ללא הפרעה. כעת שטפו את הרקמה עם חמישה מיליליטר HBSS.

שלוש פעמים אפשר לרקמה להתיישב לחלוטין בתחתית הצינור בין כל שטיפה ולהסיר בזהירות את תמיסת הכביסה לאחר הכביסה הסופית. השעו מחדש את הרקמה בשני מיליליטר של HBSS לפני תחילת שלבי הביצוע. הכינו פיפטות מרעה מלוטשות באש.

החזיקו קצה פיפטה מרעה סטרילי בגודל תשעה אינץ 'בלהבה עד לקוטר הפיפטה. הפתיחה היא כ- 0.5 מילימטרים והקצוות מעוגלים מעט. שניים גדולים.

פתח יהפוך את הטאטציה ללא יעילה וקטנה מדי. פתח יפגע בתאים, לכן היזהר באמצעות פיפטת מרעה סטרילית רגילה בגודל תשעה אינץ'. יש לשלש בעדינות את הרקמה בסך הכל שבע פעמים.

אם תהליך זה מבוצע בצורה נמרצת מדי, התאים עלולים להינזק ולמות. אפשר לחתיכות רקמה גדולות יותר להתיישב בתחתית הצינור לפני המעבר לשלב הבא. העבירו את ה-S supernatant לצינור חרוטי סטרילי טרי של 50 מיליליטר לרקמה הנותרת.

הוסף שני מיליליטר של HBSS סטרילי וטרטר בסך הכל חמש פעמים. באמצעות פיפטת מרעה לק אש. אפשרו לכל חלקי הרקמה הגדולים הנותרים להתיישב בתחתית הצינור ולשלב את הסופרנטנט עם הסופרנטנט הקודם לסך של ארבעה מיליליטר.

תאי עצב מנותקים סופרים את התאים המנותקים באמצעות ציטומטר המו. ככלל, לאחר קביעת מספרי התאים, הפחיתו 20% מהמספר הסופי כדי לקחת בחשבון כל מוות תאי שעלול להתרחש. לאחר הציפוי, מערבבים את התאים עם אמצעי ציפוי נוירו-בזאלי למשך 24.

צלחות באר מתכוננות להוסיף 60, 000 תאים לבאר ב 0.5 מיליליטר מדיה עבור צלחות תרבית של 60 מילימטר. התכוננו להוסיף 400, 000 תאים בשלושה מיליליטר מדיה עבור צלחות תרבית של 100 מילימטר. התכוננו להוסיף 6 מיליון תאים בשישה מיליליטר של צלחות מערבולת מדיה בעדינות כדי להפיץ תאים באופן שווה.

מקם נוירונים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה. למחרת, הסר מחצית מנפח המדיה מהתאים והחלף אותו באותו נפח של אמצעי הזנה נוירו-בסיסיים. בניגוד לחומרי ציפוי, מדיה זו חסרה גלוטמט וסוס תורם גבוה.

יש להזין נוירונים בסרום כל ארבעה ימים על ידי הסרת מחצית מהמדיה הישנה והחלפתה באותו נפח של הזנה נוירו-בסיסית טרייה. מדיה. תהליכים עצביים אמורים להתחיל להיות גלויים ביום הראשון ולהיות נרחבים ומסועפים עד היום העשירי. לפעמים יכול להתרחש זיהום על ידי תאי גליה.

ניתן להבחין ביניהם בקלות מנוירונים בתרבית ובמקרה זה, הם מקשים על ניתוח של תהליך עצבי המבטא תהליך עצבי GFP lc 3 כדי להפחית את זיהום תאי הגליה. טפל בתרבית עם עוזר ציטוזין לפני היום הרביעי של התרבית במינון היעיל הנמוך ביותר שלה. אם התרבית מזוהמת על ידי תאי מיקרוגליה תגובתיים פיברובלסטיים, טפל בה ב-FRDR כדי להקטין את שיעורם.

נוירונים בהיפוקמפוס גודלו במשך שבעה ימים ונצבעו בצבע חיוני לסימון מיטוכונדריה פעילה ותאי תרבית רקמות. התאים קובעו ב-4% אלדהיד פרפורמי, PBS, והודגמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדיאטה עצמה אינה פלואורסצנטית עד שהיא מתחמצנת במיטוכונדריה.

ניתן לראות מיטוכונדריה פעילה בכל התהליכים העצביים. תאים מתרבית שבעת הימים תוקנו גם עם 4% אלדהיד פרפורם, PBS וכתם חיסוני עם נוגדן חד שבטי נגד טובולין ואחריו נוגדן משני נגד US עז עם תווית ירוקה של אורגון ופלואורסצנטי שהודגם על ידי מיקרוסקופיה. תרביות עצביות בהיפוקמפוס גודלו במשך חמישה ימים והועברו עם מבנה DNA G FP lc שלוש בטא באמצעות כריתת שומן בשנת 2000.

ביום השביעי, התאים תוקנו באמצעות 4%Paraform Aldehyde, PBS ו-MICROSOMES עם GFP מתויג lc שלוש בטא המשולבות בממברנה החיצונית שלהם הודגמו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אקרוזומים ממוקמים בכל גוף התא והנויריטים ומסומנים בחיצים בעת ניסיון לבצע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לבצע את ההליך במהירות אך בזהירות ולהיות עדינים עם התאים במהלך תהליך האיטרציה. תשומת לב למשתנים אלה תשפר מאוד את היכולת שלך לתרבות מוצלחת.

נוירונים בהיפוקמפוס של עכבר.