Name: Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: למד שיטת הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בנוירואפיתל עוברי עכברים. טכניקת מיקרוסקופיית קונפוקל טיים-לאפס מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תהליכי התפתחות עצבית ודינמיקה תאית בדגם עכברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט מחקר זה נתמך על ידי מוסף ערה, 5 R01 NS056380. תמיכה נוספת מסופקת באמצעות וקטור ויראלי הליבה והליבה מיקרוסקופית של אמורי Neuroscience NINDS Core מתקני המענק, P30NS055077. אנו מודים לעכבר המהונדס אמורי וCore מיקוד גן הנובע מקו עכבר GENSAT; גרג Pazour לשורת התאים היציב SSTR3-GFP IMCD3; ובראדלי Yoder לlentiviral Sstr3-GFP לבנות. נוגדנים חד שבטיים, התקבלו ממחקרי Hybridoma הבנק התפתחותית, שפותח בחסות NICHD, ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, מחלקה למדעי ביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242. נהלי כל החיה שאושר על ידי ועדת IACUC והבטיחות הביולוגית באוניברסיטת אמורי.

עכברים בוגרים מורדמים על ידי נקע בצוואר רחם מכאני. נהלי כל החיה שאושר על ידי ועדת IACUC והבטיחות הביולוגית באוניברסיטת אמורי. 1. דור עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרוס טמוקסיפן מושרה Cre קו, CAGGCreER, וקו כתב dsRedCre (TG (CAG-Bgeo, DsRed *-MST) 1Nagy) (איור 1) 5,6. כדי לפקח על התזמון היחסי של תגובה ששש בתאי הבת, צלב CAGGCreER וקו DsRed עם BAC Olig2-eGFP המהונדס העכברים (TG EK23Gsat (Olig2-EGFP)) (איור 1) 7,8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים בטמוקסיפן 100% אתנול, ולבצע זריקת intraperitoneal של 2.5 מ&quot;ג לטמוקסיפן 40 גרם של משקל גוף לנשים בהריון בעוברי 6.5 (E6.5) כדי לגרום לביטוי Cre וסימון DsRed בקבוצה קטנה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות מאוחר יותר לנתח עוברים, לזהות עוברים חיוביים dsRed באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להעביר אותם לצלחת התרבות וobservדואר חלוקות תא יחידה במהלך לשעבר vivo ההדמיה (ראה להלן). </li></ol> 2. תרבות העובר עכבר כולו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח E8.5 עוברים במדיום לשטוף מחומם מראש המכיל DMEM/F12 (1:1) בתוספת 10% בסרום יילוד עגל ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הנתיחה, עובר מקום על 37 מעלות צלזיוס מתחת שלב חימום מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולזהות כGFP ו / או DsRed חיובי (ראה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה של עד 2 עובר לירידת 500 μl של תקשורת בתרבות מראש equilibrated המכיל 50% עכברוש סרום מזכר ספראג-Dawley ו -50% DMEM/F12 (1:1) בלי פנול אדום בתוספת L-גלוטמין ו -1% של 1 HEPES ז 0.85% NaCl ו-P / S 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח שכבה דקה (0.1 ס&quot;מ) שמן מינרלי אור equilibrated של למעלה מ בינונית על מנת למנוע אידוי ולהעביר את צלחת התרבות המכילה את העוברים ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. </li></ol> 3.זיהום ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ריסי תווית בneuroepithelium, להוסיף μl 5-10 של Sstr3-GFP lentivirus, כ -2 מיליון virions, לירידת equilibrated μl 500 של מדיום התרבות המכילה E8.5 עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 18 שעות של התרבות, חזרת עוברים נגועים לכמה טיפות של מדיום לשטוף לשטוף את הווירוס ולהכין פרוסה צינור עצבית. </li></ol> 4. הכנה פורסים צינור עצבית עבור הדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח צינור עצבי של עובר E8.5 במדיום לשטוף מחומם מראש באמצעות מ&quot;מ מיקרו סכין גודל 0.025, על צלחת מצופה אגר 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צד הצינור העצבי המבודד הגחון למטה בירידת 150 μl של מדיום תרבות equilibrated ללא פנול אדום על צלחת 35 מ&quot;מ פולי-L-ליזין המצופה הזכוכית התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמויות קטנות של תערובת 01:01 עשויים 100% טהורים וזלין ושעוות נר נמס (נר מאיקאה) סביב הצינור העצבי רכוב, ולחץ בעדינות על ידי פיסה צרה של coverslip זכוכית כדילשתק את המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את התבנית בשכבה דקה (~ 0.1 ס&quot;מ) שמן מינרלי אור equilibrated של (איור 2). </li></ol> 5. חי הדמיה ומיקרוסקופיה confocal זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת תחת ניקון A1R לייזר סריקת מיקרוסקופ הפוך Confocal מצויד בחדר סביבתי המווסת את הטמפרטורה, שנקבעה ל -37 מעלות צלזיוס, ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מטרת נפט הטבילה 60x להקליט ריסי שכותרת GFP ותאים חיוביים dsRed, תוך שימוש מטרת נפט הטבילה 40x לעקוב אחר תאים חיוביים dsRed Olig2-GFP ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת שקל האלמנטים להגדיר תנאי הדמיה זמן לשגות. כל 10 דקות לרכוש Z-ערימות של עד 25 מיקרומטר עם מרווח של 1.5 מיקרומטר (אובייקטיבי 40X) ועד 8 מיקרומטר עם מרווח של 0.4 מיקרומטר (60x אובייקטיבי). השתמש 488 561 ננומטר ואת אורכי גל העירור וערוץ משודר במידת צורך. לרכוש תמונות בגודל 512 x 512. הגדרת אזורים מרובים למשתמש מוגדר של interest לבצע בו זמנית הקלטה. חשיפה אופטימלית לכוח לייזר ובהירות של התמונה הותאמה על ידי שימוש בעוצמה נמוכה לייזר (עד 11% לmCherry 561; עד 4.5% EGFP 405/488), סריקה מהירות 1, 2 קו ממוצע וגודל של חור סיכה (61 מיקרומטר לDsRed; 28.1 מיקרומטר עבור Olig2; 72 מיקרומטר לSSTR3GFP; 61.3 מיקרומטר עבור DsRed וSSTR3GFP; 58 מיקרומטר לDsRed וOlig2). השימוש בכתבי ניאון מקודדים גנטי אפשרו לנו לזהות את הבהירות עם כוח לייזר נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים שנרשמו באמצעות תוכנת שחזור 3D Imaris. </li></ol> 6. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העוברים או צינורות עצביים מבודדים בparaformaldehyde 4% / מאגר M 0.1 פוספט על קרח (4 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1 בצלחת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות שעה 2 בPBS על קרח (4 מעלות צלזיוס) (שינוי PBS כמה פעמים) ולשים בסוכרוז 30% / מאגר M 0.1 פוספט על הלילה או עד שכיור עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ באוקטובר, הקפאת קרח יבש וחנות ב-80 ° C. Perform חתך בcryostat (10 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות למשך 10 דקות בתמיסה המכילות 1% לשטוף סרום כבשים חום מומת ו0.1% טריטון X-100 ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדנים עיקריים בפתרון לשטוף בבעקבות ריכוזים: העכברוש (5F8,) 1:200 אנטי RFP חד שבטי; ארנב נגד Arl13b סרום 1:1500 ועכבר חד שבטיים אנטי Arl13b 01:05 (295B/54); ארנב נגד Olig2 1:300; monoclonals עכבר Pax6, ששש וכל Nkx2.2-01:10; וארנב polyclonal Ki67 1:500. הוסף סביב 150 μl לכל שקופית בתא humidified שטוח, לכסות עם parafilm כדי למנוע התייבשות ולהשאיר על הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בפתרון לשטוף שלוש פעמים, 20 דקות בכל פעם בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל המשני נוגדני אלקסה פלואוריד 488, 568, 350 בפתרונות לשטוף ב1:200 ריכוז. השתמש Hoechst 1:3,000 או TO-PRO-3 1:500 להכתים גרעינים. הוסף 150 μl לכל שקופית, להשאיר שעה 1 בטמפרטורת חדר בתא humidified המוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בפתרון לשטוף TWפעמים O, 30 דקות בכל פעם בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מחליק ב80% להאריך מגיב אנטי לדעוך זהב ותצוגה בתוך 24 שעות. </li></ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מערכת vivo לשעבר שלנו מאפשרת לנו להתבונן חלוקות תא בודדות ישירות בתוך neuroepithelium הפיתוח בזמן אמת. כדוגמה נבחנו חלוקות תא בתוך הצינור העצבי העוברי בעכבר והפיקוח או היווצרות cilium או תגובה ששש. אנחנו אישר את תוצאות ההדמיה שלנו (n = 24) עלינו בקנה אחד עם תוצאות מסעיפים קבועים (n = 178) המצביעים על הטכניקה שלנו מספקת נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. הטכניקה שלנו מסתמכת על האינדוקצי...

<table><tbody><tr><td>קו Z/RED (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>קו Olig2-eGFP (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd)</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td><td>סיגמא</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>סרום מעגל עגלים הרך</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייסין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>סרום של חולדה זכר מסוג SD</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי קל </td><td>סיגמא</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>לנטי-וירוס Sstr3-GFP </td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-סכין, גודל 0.025 מ"מ </td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית (Electron Microscopy Sciences)</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>צלחת עם תחתית זכוכית מצופה ב-poly-L-lysine, 35 מ"מ</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>100% וזלין (Petroleum Jelly)</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך עם סריקת לייזר A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Imaris 3D</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT (טומוגרפיה קוהרנטית אופטית)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>קריוסטט</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>סרום כבשים שעבר אינאקטיבציה בחום</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>פראפורמאלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>בופר פוספט</td><td>הוכן במעבדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד-סגמי מחולל בחולדה נגד RFP (5F8) </td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>סרום ארנב אנטי-Arl13b</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מונוקלונאלי לעכבר נגד Arl13b בדילול 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן שפנפן נגד Olig2</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים מונוקלונליים לעכברים ל-Pax6</td><td>בנק היברידומות התפתחותי</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים מונוקלונליים לעכבר ל-Shh</td><td>בנק היברידומות התפתחותי</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים מונוקלונליים לעכברים ל-Nkx2.2</td><td>בנק היברידומות התפתחותי</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 פוליקלונלי משפחית</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>גששים מולקולריים</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>גששים מולקולריים</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>גששים מולקולריים</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>הוּוּיָה (H)&amp;#8211;נראה כי השתמשת בקיצור או במונח שאינו ברור. אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם, ואשמח לספק תרגום מדעי מקצועי ומדויק לעברית.</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>סוכן אנטי-פייד (anti-fade) מסוג ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בneuroepithelium מאוס

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

פיתחנו מערכת המשלבת הדמיה חיה של סמני ניאון ופרוסות של culturing neuroepithelium עכבר העוברי. אנחנו ניצל את קווי עכבר קיים לתא גנטי שושלת התחקות: קו Cre טמוקסיפן מושרה וקו כתב Cre מביע DsRed על רקומבינציה Cre בתיווך. על ידי שימוש ברמה נמוכה יחסית של טמוקסיפן, היינו יכול לגרום לרקומבינציה במספר קטן של תאים, המאפשר לנו לעקוב חלוקות תא בודדות. בנוסף, צפו את תגובת תעתיק לקיפוד איתות קולי (ששש) באמצעות Olig2-eGFP מהונדס קו 1-3 ואנחנו במעקב היווצרות של ריסים על ידי הדבקת הפרוסה התרבותית בווירוס המבטאת את סמן הריסים, Sstr3-GFP 4. כדי תמונת neuroepithelium מסקנו עוברים בE8.5, בודד את הצינור העצבי,, רכוב על הפרוסה העצבית בתנאי culturing נכונים לתוך חדר ההדמיה וביצע הדמיה confocal זמן לשגות. האקס שלנושיטת ההדמיה vivo החי מאפשרת לנו לעקוב אחר חלוקות תא בודדות כדי להעריך את התזמון היחסי של היווצרות ראשונית ריסים ותגובה ששש באופן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ניתן להתאים שיטה זו בקלות באמצעות סמני ניאון ברורים ומספקת בתחום הכלים שבם כדי לפקח על התנהגות תא באתר ובזמן אמת.

כאן אנו ביצע הדמיה לחיות vivo לשעבר של חלוקות תא בודדות בתוך neuroepithelium העכבר E8.5. לתייג תאים בודדים, אנחנו מושרה Cre recombinase בתת קבוצה של תאים המכילים שורת כתב Cre שהביע DsRed על רקומבינציה 5,6 (איור 3 א). כך, 48 שעות מאוחר יותר היינו מסוגל להתבונן חלוקות תא בודדות במהלך לשעבר vivo ההדמיה (איורים 4 א-D). במקביל, אנחנו במעקב כאשר התאים שכותרתו הפכו לשש, מגיבים על ידי כולל כתב ששש תעתיק שונה קו Olig2-eGFP BAC ...

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים ל<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; הדמיה לחיות להתחקות חלוקות תא בודדות בneuroepithelium עכבר E8.5

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

פיתחנו מערכת המשלבת הדמיה חיה של סממנים פלואורסצנטיים ותרבית של פרוסות נוירואפיתליום עוברי של עכבר. ניצלנו את...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לשלב דימות חי של סממנים פלואורסצנטיים עם תרביות של פרוסות נוירו-אפיתל מעוברי עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי הכלאה של קו עכברי Cree הניתן להשראה עם קו ה-Cree reporter כדי לסמן גנטית תאים המתחלקים באופן נראה. לאחר מכן, עוברים שלמים של עכברים מבודלים ומגודלים in vitro בנוכחות לנטי-וירוס.לאחר מכן, העובר נחתך ונתח מהצינור העצבי מוכן לדמיון חי. לבסוף, נתח הצינור העצבי נדגם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בשיטת time-lapse. בסופו של דבר, ניתן להגיע לתוצאות המראות תצפית ישירה על חלוקות של תאים בודדים בתוך הנוירו-אפיתל המתפתח בזמן אמת, באמצעות דמיון חי ex vivo.יתרונה של פרוטוקול זה הוא היכולת לנטר תאים בודדים in vivo, דבר המאפשר לנו לבחון שאלות לגבי אירועי האיתות של כל תא וכן לגבי התנהגותו של כל תא. לתחילת העבודה, יש לבצע הכלאה בין שורת העכברים של Cre המושרה על ידי Tamoxifen, CAGG CRE ER, לבין שורת הדווח (reporter) של DS Red Cree. כדי לנטר את התזמון היחסי של התגובה ל-sonic hedgehog בתאי הבת, יש להכליץ את שורת ה-CAGG CRE ER ds red עם OG two EEG.בעכברים טרנסגניים מסוג FP back, המותמיקסן הומס ב-100% Ethanol ולאחר מכן הוזרק תוך-פריטוניאלית לנקבות הרמיות ביום E 6.5 כדי להשרות ביטוי של CRE וסימון ב-DS red בתת-קבוצה קטנה של תאי עובר. 48 שעות מאוחר יותר, לאחר הפסקת העוברים, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות עוברים חיוביים ל-DS red. העבירו אותם לצלחית תרבית ובחנו חלוקות של תאים בודדים במהלך דימוי ex vivo.בצעו דיסקציה לעוברי E 8.5 אל תוך תמיסת שטיפה שחוממה מראש ומכילה תמיסה ביחס של אחד ለአחד של D-M-E-M-F 12 מועשרת ב-10% newborn calf serum ו-1% penicillin streptomycin. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם במה המחוממת ל-37 °C, או בעבודה לצד פלטה חמה ב-37 °C, זהו באופן מיידי עוברי חיוביים ל-GFP ו/או DS RED. העבירו עד שני עוברי לטיפה של 500 µL של תוצר תרבית ששיווי המשקל שלו הושג מראש.מרחו שכבה דקה של שמן מינרלי קל שעבר שיווי משקל מעל המצע כדי למנוע התאיידות, והדגירו את צלחת התרבית המכילה את העוברים ב-37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide. כדי לסמן את הריסונים (cilia) באפיתל העצבי, הוסיפו 5 עד 10 microliters של S sst, R 3G FP lentivirus, כ-2 מיליון וריאנטים, לטיפה שווית-משקל של 500 microliter של מצע תרבית המכילה עובר. לאחר תרבית של 18 שעות, העבירו את העובר המודבק למספר טיפות של מצע שטיפה כדי לשטוף את הנגיף והכינו פרוסות של צינור העצבים.העבירו עובר לצלחת מצופה באגר 1% והשתמשו במיקרו-סכין של 0.025 מילימטר כדי לנתח את צינור העצבים. הניחו טיפה של 150 מיקרוליטר של מצע גידול מאוזן ללא פנול אדום על צלחת בעלת תחתית זכוכית מצופה פולי-ליזין בקוטר של 35 מילימטר, והניחו את צינור העצבים המבודד כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מטה אל תוך טיפת המצע. הניחו כמויות קטנות של תערובת ביחס של אחד-לאחד של וזלין ושעוות נרות מומסת מסביב לצינור העצבים המקובע, ולחצו בעדינות זכוכית כיסוי לתוך הוזלין כדי לקבע את הדגימה.כסו את הצלחת בשכבה דקה של שמן מינרלי קל שעבר שיווי משקל לצורך הדמיה. השתמשו במיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך המצויד בתא סביבתי המכוון ל-37 °C ו-5% carbon dioxide. השתמשו בעדשה אובייקטיבית עם טבילת שמן של 60x כדי להדמיות של CLIA המסומנים ב-GFP ותאים חיוביים ל-DS red, ובעדשה אובייקטיבית עם טבילת שמן של 40x.כדי לנטר תאי LIC חיוביים ל-GFP ו-DS red, פתח את תוכנת ה-NIS elements להגדרת תנאי הדמיה של צילום רצף זמנים (time-lapse). כל 10 דקות, רכוש מזקות (Z-stacks) בעובי של עד 25 מיקרון ובמרווח של 1.5 מיקרון. בשימוש בעדשה אובייקטיבית 40x ובערימות (stacks) של עד שמונה מיקרון עם מרווח של 0.4 מיקרון עבור עדשה אובייקטיבית 60x, עיין בפרוטוקול הכתוב להוראות נוספות.לאחר קיבוע וטמיעת הרקמה ב-OCT, השתמשו בקריוסטט להכנת חתכים ובצעו אימונופלואורסצנציה בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כאן ביצענו דימוי חי ex vivo של חלוקות תאים בודדים בתוך הנוירו-אפיתל של עכבר ביום E 8.5 כדי לסמן תאים בודדים. השרינו CRE recombinase בתת-קבוצה של תאים המכילה קו דגגל Cree שהביע DS red לאחר רקומבינציה כפי שניתן לראות כאן; 48 שעות מאוחר יותר, נצפו חלוקות של תאים בודדים באמצעות דימוי ex vivo על ידי הכללת דגגל שעתוק של sonic hedgehog, קו modified back transgenic oli two EGFP.הצלחנו לנטר את המועד שבו תאים הפכו למגיבים ל-sonic hedgehog כדי לצפות ביצירת CLIA. לנטיווירוסים של SST R 3G FP יוצרו ושימשו להדבקת עוברים בתרבית; תוצאות מדימגיית קונפוקלי בשיטת time-lapse של עוברי reporter של DS Red Cree המבטאים EG two EGFP, או שהודבקו בלנטיווירוס SSTR 3G FP במהלך תרבית in vitro, מוצגות כאן. אחד היתרונות של גישה זו הוא היכולת לשלב אללים גנטיים מוטנטיים ברקע, מה שמאפשר לנו לבחון את השפעתם של גנים ספציפיים על התנהגות של תאים בודדים ועל אירועי איתות.

ex-vivo-live-imaging-of-single-cell-divisions-in-mouse-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

מקור: Al Omran, A. J.,  et al. הדמיה חיה של הריסים האפנדימליים בחדרים הצדדיים של מוח העכבר. {{}}J. Vis. exp. (2015).  }סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) כדי לצפות בפעימות של ריסים אפנדימליים במקטעי מוח של עכבר סגיטלי. ריסים אפנדימליים מניעים נוזל מוחי שדרתי (CSF), ופעילותם נרשמת בחלקי מוח הנשמרים בתווך עשיר בחומרים מזינים ומצולמים בתא מבוקר אקלים. סרטונים בעלי ניגודיות גבוהה מאפשרים לזהות ריסים פונקציונליים ולכמת את תדירות הפעימות שלהם.

הדמיה חיה של פעילות הריסים של תאים אפנדימליים בקטע מוח של עכבר

מקור: Daynac, M., et. al. מיון תאים של תאי גזע עצביים ותאי אב מהאזור התת-חדרי של העכבר הבוגר והדמיה חיה של דינמיקת מחזור התא שלהם. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים הדמיה בהילוך מהיר של תאי גזע עצביים (NSCs) ממוח של עכבר טרנסגני באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. תאי גזע עצביים זוהרים באדום במהלך שלב G1 ואינם פלואורסצנטיים בשלבים אחרים של מחזור התא. תרבית NSC מודבקת מונחת בתא ההדמיה, נקבעים פרמטרי הדמיה, והתמונות נלכדות במרווחי זמן קבועים למשך הזמן הרצוי.

הדמיית זמן-lapse של חלוקת תאי גזע עצביים של עכבר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), תצפית vivo לשעבר של המכות של cilia ependymal ניע ממוקם בתוך החדרים במוח העכבר באה לידי ביטוי בחי הדמיה. הטכניקה מאפשרת הקלטה של ​​תדר מכות הריסים הייחודי וזווית מכות וכן נכסי צעדה תנודת סידן תוך תאי שלהם.

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

פרוטוקול חזקים כדי לפקח אוכלוסיות עצבית על ידי זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה ואחריו-מבוססות תוכנה שלאחר עיבוד מתואר. שיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה לזיהוי אירועים הביולוגי בקרב אוכלוסיה הנבחר במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

הדמיה חיה Ex vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות ברקמות חיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם מיקרוסקופ של שני פוטונים למעקב חי אחר תאי אפיתל דנטליים בחותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית.

שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למד שיטת הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בנוירואפיתל עוברי עכברים. טכניקת מיקרוסקופיית קונפוקל טיים-לאפס מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תהליכי התפתחות עצבית ודינמיקה תאית בדגם עכברי.

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

גלה סרטונים נוספים