בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולתרבית סיבים חיים בודדים ותאי גזע הקשורים אליהם משריר ה-EDL של עכברים בוגרים. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של ה-EDL באמצעות הליך ניתוח גיד לגיד שאינו פוגע בסיבים. לאחר מכן, מבוצע עיכול שרירים כדי לפרק את הסיבים תוך שמירה על איגוד תאי הגזע של מיופייבר, שהוא צעד ייחודי לפרוטוקול זה.

בשלב האחרון, סיבי מיו בודדים מופרדים בעדינות זה מזה ואילו פסולת או סיבים מכווצים יתר מוסרים על ידי שטיפות עוקבות. בסופו של דבר, סיבי מיו שבודדו בטכניקה זו יכולים להישמר במצב שקט למחצה עם גירוי הפעלה מינימלי או להיות מתורבתים במדיום סרום גבוה לחקר הפעלה והתמיינות של תאי לוויין. בשנים האחרונות, השימוש בסיבי בוץ מתורבתים היה גישה רבת עוצמה לחקר ההפעלה, ההתפשטות וההתמיינות של תאי לוויין בנישה פיזיולוגית רלוונטית.

גישה זו באמת אפשרה לנו להתקדם מאוד, בהבנת התפקוד של תאים אלה ברמה המולקולרית והתאית. עבור כל עכבר שממנו מבודדים EDL, הכינו חמש צלחות פטרי מפלסטיק בגודל 60 מילימטר עם מעיל של פיפטת סרום סוס, ארבעה מילימטרים של סרום סוסים על צלחת וסובבו אותה לציפוי אחיד. לאחר מכן הסר את סרום הסוס השואב את שאריות הסרום, ותן לתבשיל להתייבש לפחות 30 דקות.

לאחר חצי שעה מוסיפים ארבעה מיליליטר של אמצעי כביסה לארבעה כלים. סמן את הכלים כדלקמן, שריר לאחר עיכול, שטוף אחד, שטוף שניים ושטוף שלושה. הוסף ארבעה מיליליטר של מצע תרבית סיבים לצלחת תרבית הסיבים הנותרת.

שמור את הכלים על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% לפני השימוש. לאחר מכן, לבידוד סיבים אחד, הכינו שתי פיפטות סטריליות תחת מיקרוסקופ. הכינו פיפטה גדולה על ידי חיתוך פיפטה קטנה עם עט יהלום כך שהפתח יהיה גדול מספיק כדי לשטוף דרכו את כל השריר.

הפיפטה השנייה היא פיפטה קטנה למניפולציה של MyFi. כעת להבעיר את הפיפטות כדי להחליק את הקצוות ולעיקור באמצעות עקומת הלהבה, קצה הפיפטה הקטנה. זה יעזור לטפל בסיבים בודדים במהלך הבידוד.

לאחר מכן מצפים את שתי הפיפטות בסרום סוסים. לבסוף, הקפידו לנקות את תחנת המיקרוסקופ וכלי הניתוח עם 70% אתנול. להדגמה זו, עכברים טרנסגניים SV 1 29 בני שמונה שבועות.

הורדמו. מרססים את הגפיים האחוריות באתנול 70%. לאחר מכן הצמד את החיה ללוח תמיכה עם הפנים כלפי מעלה.

זה נחוץ כדי לספק אחיזה טובה יותר של הגפיים האחוריות. לאחר מכן, חתוך את כל אורך הגפה וחשוף את השריר הבסיסי. הסר את העור כמו גם כל שיער או פרווה.

בעזרת מספריים עדינים חותכים את הפאשיה הדקה המקיפה את השריר מבלי לפגוע ברקמה הבסיסית. חשוף את הגידים הדיסטליים TA ו-EDL באמצעות כהן חד ואנה. מספריים קפיציים.

חתכו גם את הגידים הדיסטליים של EDL וגם את הגידים הדיסטליים של TA. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, החזיקו את שרירי ה-TA וה-EDL בגידים שלהם ומשכו בעדינות את השרירים כלפי מעלה לכיוון הקצה הפרוקסימלי. בשלב זה, אתה אמור להיות מסוגל לראות בבירור את שריר ה-EDL ממש מתחת לשריר ה-TA.

כעת הפרד את ה-EDL משריר ה-TA על ידי משיכת שני הגידים בכיוונים מנוגדים. הימנע ממתיחת שריר ה-EDL בזמן ביצוע ניתוח זה. מכיוון שהדבר יפגע בסיבי המיו.

חשוף את גיד ה-EDL. בשלב זה, זה עשוי לעזור להסיר את שריר ה-TA כדי לדמיין טוב יותר את הגיד הפרוקסימלי. זה עשוי גם לעזור לנתק חלק מרקמת החיבור סביב הברך.

ברגע שהגיד נראה בבירור, השתמש במספריים חדים של ונוס קפיץ כדי לשחרר את שריר ה-EDL. אם ההליך נעשה כהלכה, אם EDL אמור להיות מסוגל לשמור על צורתו המוארכת, לאחר הוצאתו מהגפה, להחזיק את שריר ה-EDL דרך הגידים שלו, להעביר אותו לתמיסת קולגנאז חמה מראש של שני מיליליטר, ולדגור באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס. חזור על התהליך כדי לבודד את ה-EDL השני ולהעביר אותו לאותו צינור קולגנאז לעיכול לא אחיד.

יש להשלים את הבידוד של ה-EDL השני תוך חמש דקות מרגע הבידוד. ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמן הדגירה הראשון של EDL בהתאם לפעילות הקולגנוס, גודל השריר, גיל החיה או מצב השרירים. לדוגמה, שריר עם הרבה רקמה פיברוטית עשוי לדרוש זמן דגירה ארוך יותר.

כמו כן, שימו לב כי הוכח כי תסיסה במהלך תקופה זו מפעילה תאי S במהלך זמן העיכול בדוק באופן קבוע את השריר כדי למנוע עיכול יתר. הפסק את העיכול כאשר השרירים מתחילים להשתחרר וסיבי המיו נראים לעין. בעזרת פיפטת הקדח הגדולה, העבירו בזהירות את שני השרירים לצלחת פטרי חמה מראש.

עם ארבעה מיליליטר של חומרי כביסה יש להימנע מעיכול יתר מכיוון שהוא גורם לסיבי מיו מכווצים יתר על המידה. כדי לשחרר את סיבי המיאו, השתמש בפיפטה הזכוכית הגדולה כדי לשטוף את השריר במדיום חם עד שהסיבים מתחילים להשתחרר באופן טבעי. אל תפעילו טריטרציה על השריר מכיוון שהדבר יגרום בהכרח לפגיעה בסיבים.

המשך לשחרר את סיבי המיאו עד להגעה למספר הרצוי. אל תשאיר את המנה בטמפרטורת החדר יותר מעשר דקות. החזירו אותו לחממה למשך חמש דקות כדי לאזן מחדש לפני שתעבדו איתו יותר.

התרבות מכילה כיום תערובת של סיבי מיו בודדים חיים, שהם מבנים צינוריים ארוכים ומבריקים, סיבים מכווצים במיוחד, שהם כהים וקצרים ופסולת. כעת באמצעות פיפטה בגודל קטן, העבירו סיבי MYOP בודדים חיים לצלחת חדשה מתולעת. יש לטפל בכל סיב קוצר ראייה בנפרד.

במקום להעביר את עיקר סיבי המיאו בבת אחת, במידת הצורך, החזירו את המנה לחממה למשך 10 עד 15 דקות כדי לאזן מחדש את המדיום. העבירו את סיבי קוצר הראייה הבודדים פעמיים נוספות כדי להסיר את כל סיבי השריר המתים והפסולת בתום שלוש שטיפות רצופות לפחות. רק סיבי מיו חיים בודדים צריכים להישאר בצלחת לצורך תרבית או ניתוח במורד הזרם.

לסיבים חיים יש מורפולוגיה ארוכה. נהפוך הוא, סיבים מכווצים יתר הם קצרים ועבים יותר. כעת, דגרו את סיבי ה-myo המבודדים באמצעי הכביסה לפחות שעה לפני המעבר למדיום תרבית.

בצלחת חדשה שמחממת מראש, מדיום גבוה יאפשר הפעלת תאי לוויין לתרביות ארוכות. מטריג'ל יכול להתאים ללא קשר למדיום הנבחר. החליפו אותו כל יומיים בזמן הבידוד.

תאי הלוויין בכל MyFi מופיעים כבליטות זעירות על פני השריר כאשר הם נצפים תחת מיקרוסקופ אור. אם סיבי המיאו נשמרים במדיום עשיר בסרום לפרקי זמן ממושכים, צינורות מיו מובחנים לחלוטין נצפים בעיקר בתרבית. זני עכברים מדווחים כגון קו MIFF Five Cree Rosa YFP הם כלים אופטימליים לחקר תהליך התחדשות השרירים.

שפופרות Myo שמקורן בתרבית סיבים של Miff Five Cree Rosa YFP ביטאו את ה-MIFF Five Reporter YFP. זה מצביע על כך שהתחדשות השרירים דורשת הפעלה של Miff five. זן עכברי העגבניות PAX 7 Cree TD הוא קו עיתונאי נוסף.

אות הקרינה של עגבניות TD מזוהה רק על ידי תאי לוויין בעוד שגרעיני myON שליליים בבירור. זה מצביע על כך שגורם השעתוק PAX 7 מתבטא באופן ייחודי על ידי תאי גזע שריר ולא על ידי צאצאיהם המובחנים. ניתן לתקן סיבי מיו ותאי הלוויין הקשורים אליהם במורד הזרם.

אימונופלואורסצנציה PAC שבעה תאי לוויין חיוביים ל-myo D נחשבים באופן קלאסי לאבות שרירים מחויבים לשגשוג. הם ישלימו את תוכנית הבידול על ידי הורדת ויסות PAC 7 תוך שמירה על ביטוי ה-OD שלי או יחזרו לשקט על ידי הורדת ויסות ה-OD שלי ושמירה על ביטוי PAC 7. לטכניקת בידוד הסיבים הבודדים יש את התכונה הייחודית של שימור איגוד תאי הלוויין הפיזיולוגי של Myofiber.

השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא דיסקציה של שריר ה-EDL מגיד לגיד. מניפולציה מינימלית של סיבים מאפשרת גם שמירה על שלמות הסיבים וכדאיותם. בידוד מוצלח של סיבי קוצר ראייה בודדים תלוי במספר גורמים כגון פעילות קולגנית, מצב שרירים או גיל.

והכי חשוב, בידוד השריר מגיד לגיד מאפשר לשמור על שלמות הסיבים. כמו כן, מניפולציה מינימלית של סיבים לאורך ההליך מאפשרת שיעור הישרדות גבוה יותר.