Name: דלדול של רנא ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: למד פרוטוקול לדלדול רנ"א ריבוזומלי מדגימות מעי יתושים כדי להעשיר mRNA ל-RNA-seq. השיטה מסירה 90-99% מרנ"א הריבוזום ומשפרת את איכות הנתונים לניתוח מטא-טרנסקריפטומי של מיקרוביום המעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1SC2GM092789-01A1, והטרשת הנפוצה הייתה תלמיד מחקר של תוכניות NMSU הווארד יוז רפואי מכון מחקר לתואר ראשונות. הסרטון ביים והפיק על ידי איימי Lanasa ומתואם על ידי ד&quot;ר פיליפ לואיס עם מדיה מכון קריאייטיב ב NMSU.

נוהל 1. חקר גידול יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתח אחורי יתוש האנופלס gambiae G3 בinsectary ב27.5 מעלות צלזיוס עם לחות 80% ומחזור שעות 12:12 אור / חושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את הזחלים במזון חתולי קרקע עם שמרי בירה ביחס 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את היתושים בוגרים בדם עכברים ביום 3 לאחר הופעתה לייצור ביצים. </li></ol> 2. Dissection גוט יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי נתיחת חיטוי (שקופיות ומלקחיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 50 יתושים באמצעות aspirator ומניח אותם על מיטת זרימה 2 CO (Flypad האולטימטיבי). שטוף דגימת יתושים ברצף בשלוש צלחות פטרי המכילים 70% אתנול לניקוי משטח גוף היתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדגימה בשקופית זכוכית תחת stereomicroscopy. הסר את המעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 50 אומץ לתנאים לבידוד דנ&quot;א metagenomic. אסוף 50 אומץ לתנאים לבידוד RNA metagenomic. </li></ol&gt; 3. בידוד דנ&quot;א Metagenomic הערה: ה-DNA Metagenomic מבודדת באמצעות Meta-G-DNA נום בידוד הקיט (יוטכנולוגיות Epicentre) עם השינוי המתואר להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 50 קרבים נגד יתושים ב300 TE μl. הומוגני לדקות 1 באמצעות Bio-Gen PRO200 homogenizer (PRO המדעית Inc, ארה&quot;ב) בשעת 2000 סל&quot;ד מהירות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של פתרון Lysozyme המוכן lyse וμl 1 מתוך RNase להשעית התא. מיקס ידי vortexing ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של פתרון Meta-תמוגה (2X) וμl 1 מתוך proteinase K לצינור. מערבב על ידי vortexing. בקצרה דופק סרכזת הצינור כדי להבטיח שכל הפתרון הוא בתחתית של תחתית, ולדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, מצנן לטמפרטורת חדר, ואז מקום על קרח במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 350 μl של מגיב משקעי חלבון MPC לצינור והתמהיל ידי vortexing נמרץ למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה לאהוא הפסולת ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב12000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור נקי 2-מ&quot;ל, וזורק את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 570 μl של isopropanol לsupernatant. מערבב על ידי היפוך כמה פעמי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת דנ&quot;א ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב12000 XG ב 4 ° C. הסר את isopropanol בלי להינתק DNA הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של אתנול 75% כדי לשטוף את הגלולה. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב12000 XG ב 4 ° C. הסר אתנול מבלי להפריע גלולת דנ&quot;א. מזגן מייבש את הגלולה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. הערה: אל על יבש DNA הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend DNA גלול ב 50 μl של מאגר TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת את גודלו של ה-DNA המבודד בהשוואה ל-DNA בקרת Fosmid (40 ק&quot;ג; 100 ng / μl) המסופק בערכה, באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה על 1% agarose ג&#39;ל. </li></ol> 4. בידוד RNA סה&quot;כ שימו לב: יש לנקות את שטח העבודהעם RNaseZap כדי למזער את זיהום RNase. רנ&quot;א Metagenomic היה מבודד מדגימות מעי יתושים באמצעות מגיב בידוד TriPure (רוש) עם שינויים קלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 50 קרבים נגד יתושים בצינור 2-מ&quot;ל עם מגיב הבידוד TriPure μl 500. הומוגני ל1 דקות במהירות 2000 סל&quot;ד על קרח באמצעות homogenizer. תן לו לשבת בRT למשך 5 דקות כדי לאפשר ניתוק של קומפלקסי nucleoprotein. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כלורופורם 100 μl ומערבולת עבור 12 שניות, ותן לו לשבת בRT עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב -10,000 למשך 10 דקות. זהירות להוציא את הצינורית ללא שלבים מופרדים מטרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שלב מימי לצינור חדש, להוסיף 250 isopropanol μl, מערבב היטב, ולשים ב -20 ° C למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 12000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי רנ&quot;א משקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מבלי להינתק גלולה. שטוף את הכדור עם אתנול 75% 750 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את supernatant מבלי להפריע הגלולה.IR ייבוש הצינור עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend RNA עם מים חינם nuclease μl 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את רנ&quot;א הסך הכל עם DNase על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן לנטרל את DNase ידי הדגרה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. רנ&quot;א הנחפז ואתנול וResuspend RNA במים חופשיים nuclease μl 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות של RNA כלל באמצעות NanoDrop. </li></ol> 5. דלדול רנ&quot;א ריבוזומלי הערה: הפרוטוקול פותח על בסיס שיטות שתוארה קודם לכן 12,13,15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגברת PCR של שברי RNA ריבוזומלי גנים צעד זה יוצר ברכות מדגם ספציפיות rRNA, אשר ישמש כתבניות לשעתוק במבחנה כדי לייצר חלליות אנטי תחושת ריבוזומלי RNA (arRNA) כי הם מחמיאים לrRNA במדגם RNA המוחלט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנן ולסנתז סטי פריימר לrRNA בר PCR (1 טבלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל PCR ב 50תגובת μl באמצעות DNA פולימראז תקי (Qiagen) בתבנית 50 ng-DNA, 1 x-PCR חיץ, Mg 1.5mm 2 Cl, 0.2 פריימרים מיקרומטר עם 35 מחזורים של denaturing ב 94 ° C עבור 10 שניות, 15 שניות בחישול 40 ° C עבור amplicon חיידקים 23s, ו50 ° C לamplicons האחרים, והארכה ב 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 (רחבה סופית ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו במוצרי PCR ב% agarose ג&#39;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR QIAquick עם elution במאגר elution 50 μl. לכמת את הריכוז באמצעות NanoDrop. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעתוק במבחנה של בדיקות rRNA אנטי תחושת ביוטין שכותרת-(arRNA). הערה: בשלב זה, בדיקות ספציפיות לדוגמה מתוך amplicons rRNA השונה מסונתזות באמצעות MEGAscript T7 הערכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובת μl 20 עבור כל amplicon rRNA מדגם מסוים על ידי ערבוב את המרכיבים הבאים (טבלה 2). דגירת הלילה בשעת 37 ° C. <strong&gt; הערה: בדרך כלל תשואות התגובה&gt; 50 RNA מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 DNase אני μl (כלול בערכה) לתגובה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להסיר את תבנית ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אתנול 100 μl 100% לתגובה, בצנטריפוגה XG 12000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי לזרז מסונתז arRNA. בטל supernatant ולשטוף את הגלולה עם אתנול 75% 750 μl. בדיקות resuspend RNA במים חופשיים nuclease μl 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ריכוז RNA באמצעות NanoDrop. בדיקות בחנויות ב-80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> rRNA חיסור עם arRNA biotinylated. הערה: בשלב זה מעסיק arRNA biotinylated להכליא לrRNA במדגם RNA המוחלט. כלאי rRNA-arRNA נתפסו על ידי חרוזים מגנטיים streptavidin מצופים. ההליך מבוסס על הפרוטוקול מתואר בהתייחסות 13 עם שינויים קלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1 N NaOH, chlor נתרן 20XIDE-ציטרט (SSC) ו-X SSC 1 עם פוראמיד 20%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי 1 RNA מיקרוגרם כלל עם 16S חיידקים ובדיקות 23s (0.75 מיקרוגרם כל אחד), 18S יתושים ובדיקות -28 (0.75 מיקרוגרם כל אחד), מעכב 1 μl RNase, 2.5 μl 20X SSC חיץ, 10 פוראמיד 100% μl בצינור PCR 200 μl , מי nuclease ללא תוספת ל 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצינור בתגובת Cycler ולדגור תרמית על 70 המעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפתוח מבנה משני וכבשו עד 25 מעלות צלזיוס באמצעות 5 ° C מרווחים לכל 1 דקות C ° לאפשר ההכלאה של בדיקות rRNA וarRNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת rRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 300 חרוזים מצופים streptavidin μl לתוך צינור מ&quot;ל 1.7. הנח את השפופרת על מדף הפרדה מגנטית, כדי לשתק את החרוזים. הסרת supernatant. Resuspend את החרוזים ב300 μl של 0.1N NaOH ומייליםx כן. הנח את הצינור בחזרה למדף המגנטי ופיפטה את supernatant. Resuspend את החרוזים ב300 μl של 1X SSC, מערבב היטב, לשתק את החרוזים ופיפטה את supernatant. חזור על לשטוף עם 300 μl זמן 1X SSC אחד יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 3 aliquots של חרוזים, 100 μl כל אחד, בצינורות 1.7 מ&quot;ל. הנח את הצינור על המתלה המגנטית, ולהסיר את supernatant ידי pipetting. הערה: aliquots של חרוזים משמשים ל3 סיבובים של לכידת כלאי biotinylated rRNA-arRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 1X SSC μl עם פוראמיד 20% לתגובת ההכלאה 50 μl. להעביר את התגובה לתוך צינור aliquot החרוז הראשון, ומערבב היטב. לדגור על RT למשך 10 דקות על מנת לאפשר למכוניות ההיברידיות biotinylated חללית-rRNA שנכבשו בידי חרוזי streptavidin. פליק הצינור כל 2 דקות כדי לערבב במהלך הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצינור על המתלה המגנטית, כדי לשתק את החרוזים, להעביר את supernatant לaliq 2uot של חרוזים, מערבב היטב והדגירה כאמורה לעיל. לנהל לכידה השלישית על ידי העברת supernatant לתוך הצינור השלישי של חרוזים. לערבב ודגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant הלא rRNA לתוך צינור חדש וטיהור התנהלות באמצעות ערכת MinElute RNeasy להסיר פוראמיד בעקבות ההוראות של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את יעילות דלדול rRNA באמצעות ערכת Agilent RNA 6000 פיקו שבב על Bioanalyzer (איור 4). </li></ol></li></ol></li></ol> הערה: דוגמאות rRNA המדולדלות RNA כפופות לmRNA הגברה במידת הצורך 8.

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+the+Bemisia+tabaci+Transcriptome+Reveals+a+Highly+Diverse+Bacterial+Community+and+a+Robust+System+for+Insecticide+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance.</a> PLoS One. 7, e35181(2012).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+metatranscriptome+of+the+protistan+community+in+Coptotermes+formosanus+with+emphasis+on+the+lignocellulolytic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system.</a> Genomics. 99, 246-255 (2012).</li>
<li>Gosalbes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomic+approach+to+analyze+the+functional+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota.</a> PLoS One. 6, e17447(2011).</li>
<li>Urich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+assessment+of+soil+microbial+community+structure+and+function+through+analysis+of+the+meta-transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome.</a> PLoS One. 3, e2527(2008).</li>
<li>Gilbert, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large+numbers+of+novel+sequences+in+the+metatranscriptomes+of+complex+marine+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities.</a> PLoS One. 3, e3042(2008).</li>
<li>Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+a+deeply+sequenced+marine+microbial+metatranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome.</a> ISME J. 5, 461-472 (2011).</li>
<li>Poretsky, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+day%2Fnight+metatranscriptomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+North+Pacific+subtropical+gyre%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre.</a> Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).</li>
<li>Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activity+of+paddy+soil+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities.</a> Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).</li>
<li>Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+mRNA+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extraction of mRNA from soil.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+two+ribosomal+RNA+removal+methods+for+microbial+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.</a> Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).</li>
<li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+mRNA+purification+by+magnetic+capture-hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method.</a> Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).</li>
<li>Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+quantitative+analyses+of+a+universal+rRNA-subtraction+protocol+for+microbial+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics.</a> ISME J. 4, 896-907 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Gilbreath, T. M. 3rd, Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PLoS One. 6, e24767(2011).</li>
<li>Su, C., Sordillo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+enrich+mRNA+from+total+prokaryotic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA.</a> Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).</li>
<li>Gusmao, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-dependent+and+culture-independent+characterization+of+microorganisms+associated+with+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+%28L.%29+and+dynamics+of+bacterial+colonization+in+the+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut.</a> Acta Trop. 115, 275-281 (2010).</li>
<li>Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li>
<li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analyses%3A+past+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401(2009).</li>
<li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

קהילת חיידקים מורכבת מתגוררת במערכת האקולוגית בטן יתוש 14,16,17. Metatranscriptomic רצף (RNA-seq) יכול לחשוף מידע פונקציונלי תלוי בהקשר של חקירה כל חיידקי transcriptome 4,18. מבחינה טכנית, העשרת Oligo-ד (ט) בתיווך של mRNA פרוקריוטי אינה ישימה בשל העדר (A) זנבות של השליחים פולי היציבים. לחלופין, דלדול rRNA כבר בשימוש להעשרה-mRNA. הנה, אנחנו פתחנו פרוטוקול חיסור מבוסס כדי לרוקן rRNA rRNA באמצעות בדיקות דנ&quot;א שנעשו מmetagenomic עצמו מאוד בקהילת חיידקי מעי הי...

טכנולוגיית הדור הבא של רצף התקדמה מחקר metagenomics מאוד על ידי המאפשר להעריך את ההרכב הטקסונומי והפונקציונלי גנטיים של מכלול של חיידקים. RNA-רצף (RNA-Seq) 1 יכול לעקוף שיטות תרבות מבוססת לחקור metatranscriptomes מיקרוביאלי ב2-5 הקשרים שונים. מכשול עיקרי לחיידקי RNA-seq הוא הקושי בהעשרה-mRNA, כמין mRNA פרוקריוטים אינו polyadenylated ביציבות. לכן, העשרת Oligo ד (ט) בתיווך שליח אינה ישימה. הסרת rRNA שפע היא גישה חלופית להעשרה-mRNA. ערכות מסחריות rRNA דלדול, כגון ערכת Microexpress קטריאלי mRNA העשרה (Ambion), RiboMinus transcriptome בידוד קיט (חיידקים) (חי טכנולוגיות), ורק mRNA-ערכה פרוקריוטים mRNA בידוד (Epicentre) שמעדיפים מדרדרת rRNA עם exonuclease, היו בשימוש להסרת rRNA 6-8. עם זאת, בדיקות ללכוד בMicroexpressאו RiboMinus טוב להסרת rRNA הידוע מחיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים טיפוסיים (ראה מפרטים של יצרנים), אבל פחות מתאים עם rRNA מחיידקים לא ידועים. כתוצאה מכך, ההסרה עשויה להיות פחות יעילה עבור 8-10 דגימות metagenomic. חוץ מזה, נאמנות שפע mRNA הייתה מוטלת בספק, כאשר טיפול exonuclease יושם 11. בסך הכל, דלדול rRNA חיסור מבוסס היה פחות מוטה ויעיל יותר בהעשרת mRNA בהגדרות metagenomic 10-13. בטן היתוש להכיל חיידקי קהילה דינמית 14. אנו מעוניינים באפיון הפונקציה של microbiome בטן היתוש באמצעות RNA-Seq. במדגם RNA המבודד מאומץ היתושים, שני RNA היתושים וחיידקים הם הווה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול הותאם לשימוש בדיקות rRNA ספציפיות קהילתיות יעילות כדי לרוקן rRNA יתושים וחיידקים על ידי הכלאת חיסור. MRNA כתוצאהדגימות מועשרות מתאימות לRNA-Seq. העבודה הכוללת מתוארת באיור 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>מגיב / חומר< / חזק> </td></tr><tr><td>ערכת בידוד DNA Meta-G-Nome</td><td>Epicentre</td><td>MGN0910</td><td>בידוד DNA מטגנומי</td></tr><tr><td>TriPure </td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>Mdetagenomic</td></tr><tr><td>RNA בידוד ערכת MEGAscript T7 אמביון</td><td></td><td>AM1334</td><td>סינתזה חוץ גופית של בדיקות</td>RNA</tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>RNase אזור עבודה חופשי </td></tr><tr><td>ביוטין-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td>סינתזה במבחנה של RNA</td></tr><tr><td>ביוטין-11-CTP</td><td>Roche</td><td>4739205001</td><td>סינתזה במבחנה של</td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים של RNA Streptavidin</td><td>NEB</td><td>S1420S</td><td>לכידת היברידיות rRNA</td></tr><tr><td>מתלה הפרדה מגנטית</td><td>NEB</td><td>S1506S</td><td>לכידת היברידיות rRNA</td></tr><tr><td>RNeasy מיני kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>טיהור RNA</td></tr><tr><td>נטול RNase סט</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>הסרת זיהום DNA </td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>5067-1513</td><td>אלקטרופרוגרמה של RNA</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק> </td></tr><tr><td>Bio-Gen PRO200 Homogenizer</td><td>PRO Scientific</td><td>01-01200</td><td>הומוגניזציה של רקמת מעיים של יתושים</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>DNA & כימות RNA</td></tr><tr><td>2100 ביואנלייזר</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>G2940CA</td><td>אלקטרופרוגרמה של RNA</td></tr></tbody></table>

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לmetagenomic גוט יתוש rna-seq

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

בטן היתוש להכיל קהילות מיקרוביאלי דינמיות על פני שלבים שונים של מחזור החיים של החרק. אפיון של היכולות ותפקודים הגנטיים של קהילת המעיים יספק תובנה לתוך ההשפעות של חיידקי מעיים על תכונות חי יתושים. Metagenomic RNA-Seq הפך כלי חשוב לנתח transcriptomes מחיידקים המצויים בקהילת חיידקים שונים. RNA השליח בדרך כלל מהווה רק 1-3% מכלל רנ&quot;א, בעוד rRNA מהווה כ 90%. זה מאתגר להעשרת RNA שליח ממדגם רנ&quot;א מיקרוביאלי metagenomic כי מיני mRNA פרוקריוטים רוב חסרים (A) זנבות פולי יציבים. זה מונע בידוד Oligo ד (ט) בתיווך-mRNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שמעסיק מדגם נגזר rRNA ללכוד בדיקות כדי להסיר rRNA ממדגם RNA סך metagenomic. כדי להתחיל, גם יתושים וברי rRNA של חיידקים קטנים וגדולים למקטע הם מוגברים מדגימת DNA קהילת metagenomic. ואז, commuבדיקות nity ספציפיות biotinylated antisense RNA ריבוזומלי מסונתזות במבחנה באמצעות RNA פולימראז T7. בדיקות rRNA biotinylated הם הכלאה לרנ&quot;א בסך הכל. הכלאיים נתפסו על ידי חרוזי streptavidin מצופים והוצאו מכלל רנ&quot;א. פרוטוקול חיסור מבוסס ביעילות מסיר גם יתושים וrRNA של חיידקים מדגימת RNA המוחלטת. המדגם המועשר mRNA עובר עיבוד נוסף להגברת RNA ו-RNA-Seq.

הפרוטוקול כולל שלושה חלקים: (1) הכנת תבניות DNA metagenomic לrRNA PCR, (2) יצירת בדיקות rRNA לכידה ספציפיות לדוגמה: (3) דלדול של rRNA מרנ&quot;א כלל על ידי הכלאת חיסור. בידוד של metagenomic DNA ו-RNA באיכות הגבוהה הוא חיוני לכל התהליך. פרוטוקול בידוד דנ&quot;א Meta-G-נום השונה מניב דנ&quot;א באיכות גבוהה metagenomic מבטן יתושים, כפי שמוצג באיור 2. זה יכול להיות מאתגר לבודד RNA כלל באיכות גבוהה מבטן יתושים. סביר להניח שסיבה לנוכחותם של אנזימים שונים, לרבות RNase, ב...

פרוטוקול ריבוזומלי רנ&quot;א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

שלום לכולם. זוהי פאנה קלה מהמעבדה של ד"ר קסנון זו, המחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ניו מקסיקו. אנו עובדים על המטאגנומיקה של המערכת האקולוגית של מעי היתושים.היום אנו הולכים להדגים את תהליך ה-A שלך לדלדול RNA ריבוזומלי מכלל דגימות ה-RNA כדי להעשיר את השליח, RNA עבור RNA-Seq. RNA-Seq היא טכניקה בשימוש נרחב לחקר התפקודים של הקהילה המיקרוביאלית. ראשית, אני הולך להדגים לכם כיצד לבודד את ה-RNA הכולל ואת ה-DNA המטא-גנומי מהמעי השרירי.יתושי אנליס גמביה מוחזקים במגזר. יתושים ניזונים תחילה מקמח סוכר לפני כן, ולאחר מכן נקבות יתושים מוזנות מעכברים לייצור ACHE. יתושים אלה ניזונים מסוכר ואלה ניזונים מדם עכברים.לפני ההליך, כל כלי הדיסקציה והמגלשות עוקרו. את היתושים מנקים עם אתנול 70% שלוש פעמים בצלחת פטרי, ומניחים אותם בחזרה על מגלשת זכוכית כדי לייבש את האתנול, מניחים את היתושים על מגלשת זכוכית אחרת ומניחים טיפה של תמיסת XPBS סטרילית. לאחר מכן שולפים בעדינות את המעיים.מעי היתושים ישמשו לקבלת DNA מטגנומי ו-RNA כולל בהתאמה. לפני שנתחיל בעבודת ה-RNA, חשוב לנקוט באמצעי זהירות סטנדרטיים כדי למנוע פירוק RNA על ידי שמירה על סביבה נטולת ריבונוקלאז תוך לבישת כפפות, ניקוי פיפטות אזור העבודה וכל המכשירים הנדרשים עם מוהל. לפני ההליך, אספו 50 מעיים והניחו אותם בצינור איינור של 1.5 מיליליטר המכיל ריאגנטים לפוליאורטן.עבור בידוד גנומי כולל של RNA, DNA מבודד מאצווה אחרת של 50 מעיים באמצעות ערכת בידוד מטגנומית. ריכוז ה-RNA או ה-DNA נמדד באמצעות NanoDrop. השתמשנו בחיסור ה-RNA שלנו כדי להסיר RNA ריבוזומלי מדגימת ה-RNA הכוללת.ראשית, מקטעי ה-RRNA הספציפיים לדגימה מוגברים ב-PCR מה-DNA הגנומי, שלקחנו מדגימות המעיים. מוצרי ה-PCR מטוהרים באמצעות ערכת טיהור Qiagen PCR. בשלב זה, ה-T שבע RNA פולימראז משמש לסינתזה של בדיקות RRNA אנטי-סנס.הגדר תגובה באמצעות מוצר ה-PCR משלב ראשון ו-CTP ו-UTP ביוטיניליים. לאחר מכן דגרו את התגובה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. כעת בדיקות ה-RRNA האנטי-סנס מוכנות לשימוש לדלדול RRNA.שלב זה משתמש בבדיקות RRNA ביוטיניליות כדי לתפוס את ה-RRNA המטרה בדגימת ה-RNA הכוללת, ב-RRNA המטרה ובבדיקת ה-RRNA. לאחר מכן נלכדים הכלאות על ידי חרוזים מגנטיים מצופים המחלקים סטרפטוק. הגדר את תגובת ההכלאה בצינור PCR ודגר אותה במחזור תרמי למשך חמש דקות ב-70 מעלות צלזיוס.לאחר מכן הורידו את הטמפרטורה ל-25 מעלות צלזיוס. כדי לאפשר הכלאה של ה-RRNA בזמן שהתגובה פועלת, הכינו את החרוזים. ראשית, עשה שלוש אליקוטים.שימוש בחרוזים של 100 מיקרוליטר לכל צינור. שטפו את החרוזים בתמיסת XSSC אחת שלוש פעמים. ואז השאירו את הצינורות על קרח.לאחר שהתגובה מוכנה, יש לדלל על ידי הוספת 100 מיקרוליטר XSSC אחד עם 20% אמיד צורה. העבירו את תמיסת התגובה לצינור עם החרוזים. מערבבים היטב ואז דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.מלקק את הצינור מדי פעם, סובב את הצינור לזמן קצר והנח אותו על המתלה המגנטי. מעבירים את הסופר נאטין לצינור איסוף. שוטפים את החרוזים פעמיים נוספות כל אחת עם 100 מיקרוליטר.נוספה תמיסת חיץ XSSC אחת. מערבבים היטב ואז תופסים מחדש את החרוזים על המדף המגנטי. העבירו את הסופרנטנטים לצינור האיסוף.כעת יש לנו דגימת RNA מדוללת RRNA בשפופרת. בצע טיהור באמצעות המיני-קיט הקל RN מבית Qiagen. בעקבות ההוראות, כעת אנו בודקים את יעילות הדלדול.דגימות ה-RNA נטענות על שבב Agilent RNA 6, 000 PICO ועוברות דרך הביו-אנלייזר 2100. לפני החיסור. היו שני שיאי RNA ריבוזומליים 16 שניות ו-23 שניות בהתאמה.לאחר החיסור, פסגות ה-RRNA הוסרו ביעילות. ה-RNA הנותר נמצא בטווח הגודל שבין 200 זוגות בסיסים לארבעה קילו-בסיס. כעת דגימת ה-RNA מוכנה ליצור ספריית CD NA לריצוף טרנסקריפטום.אנו פשוט מדריכים אותך בהליך להעשרת השליח, RNA עבור RNA. מחפשים. תודה שצפית בנו.

depletion-of-ribosomal-rna-for-mosquito-gut-metagenomic-rna-seq

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: ליו, X. ואחרים. בדיקת האכלה חיידקית דרך הפה עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון הזה מדגים את הפחתה של מיקרוביום המעי הטבעי ביתושים באמצעות תמיסת סוכרוז המכילה אנטיביוטיקה. לאחר מכן מתבצעת התיישבות מבוקרת עם השעיה חיידקית המועברת דרך מערכת הזנה ממברנלית ליצירת אוכלוסיית חיידקים מוגדרת במעי היתושים.

קביעת אוכלוסיית חיידקים מוגדרת במעיים ביתושים בוגרים

ניתוחי RNA-Seq הופכים חשובים יותר ויותר לזיהוי היסודות המולקולריים של תכונות הסתגלות באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, מתואר פרוטוקול לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין יתושי Aedes albopictus שאינם דיאפאוזה, מגידול יתושים, ועד לריצוף RNA וניתוחים ביואינפורמטיים של נתוני RNA-Seq.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים, אדס המפוספס

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

מסופק פרוטוקול לכימות גנים ותעתיקים של חיידקים 16S rRNA ממשקעי חוף באמצעות PCR בזמן אמת. המתודולוגיה כוללת מיצוי משותף של DNA ו-RNA; הכנת RNA נטול DNA; וכימות גן rRNA 16S וכימות תעתיק באמצעות RT-q-PCR, כולל בניית עקומה סטנדרטית.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

כאן אנו מציגים פרוטוקול הדור הבא רצפי עבור מטוסי אף-16 rRNA רצף המאפשרת זיהוי ואפיון של קהילות חיידקים בתוך וקטורים. שיטה זו כרוכה DNA החילוץ, הגברה, barcoding דגימות באמצעות PCR, רצף תאים זרימה, ביואינפורמטיקה כדי להתאים את רצף נתונים למידע פילוגנטי.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים בודדים מעיים יתוש, כולל בידוד וזיהוי של חיידקים midgut יתושים, דלדול אנטיביוטיקה של חיידקים מעיים יתוש, ולהחזן מחדש מין אחד חיידקים ספציפיים.

תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה

פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

צואה (מיקרו) בידוד RNA

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

קהילות מיקרוביאליות ביתושים טומנות בחובן הבטחה גדולה לאסטרטגיות הדברה ביולוגית וקטורית. רוב הסימביונטים אינם ניתנים לטיפוח, ודורשים ניתוחים מטגנומיים. אנו מתארים שיטה לנתח נקבות יתושים ולהפריד בין השחלות, המעי התיכון ובלוטות הרוק למניעת זיהום צולב, להקל על מחקרי מיקרוביום ברמת האיברים, ולשפר את ההבנה של תפקידי המיקרואורגניזמים בביולוגיה של יתושים.

דיסקציה של שחלות יתושים, מעי האמצע ובלוטות הרוק לצורך ניתוח מיקרוביום ברמת האיברים

למד פרוטוקול לדלדול רנ"א ריבוזומלי מדגימות מעי יתושים כדי להעשיר mRNA ל-RNA-seq. השיטה מסירה 90-99% מרנ"א הריבוזום ומשפרת את איכות הנתונים לניתוח מטא-טרנסקריפטומי של מיקרוביום המעי.

דלדול של רנ"א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

גלה סרטונים נוספים