בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס אורגנואידים ראשוניים של גידול במעי הגס. זה מושג על ידי איסוף רקמת גידול במעי הגס של עכבר. השלב השני הוא ניתוק אפיתל המעי הגס הרגיל הסמוך.

לאחר מכן, תאי הגידול במעי הגס מתעכלים לתאים בודדים. השלב האחרון הוא להטמיע תאי גידול במטריג'ל ולתרבית אותם באופן סלקטיבי עם תנאים תזונתיים מוגבלים. בסופו של דבר, מיקרוסקופ אור משמש להצגת מהלך הזמן של היווצרות אורגנואידים של גידול במעי הגס.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון קווי תאי סרטן המעי הגס שעברו טרנספורמציה, הוא שתרביות אורגנואידים מחקות מקרוב את המצב in vivo ומייצרות נתונים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית. לאחר המתת חסד של העכבר בפחמן דו חמצני ואיסוף המעי הגס, יש לשטוף את המעי הגס עם PBS. השתמש במספריים כדי לפתוח את המעי הגס לאורך, ואז הנח אותו מתחת למיקרוסקופ סטריאו והשתמש במספריים כדי להסיר אזורים המכילים גידולים.

אוספים ושוטפים את רקמת הגידול עם PBS. לאחר השטיפה, העבירו את שברי המעי לכלציה של EDTA, בופר ודגירה על קרח למשך 60 דקות לאחר הכלציה, רוב תאי האפיתל הרגילים של המעי ינותקו בעוד שתאי הגידול יישארו מחוברים למכין. שאפו את מאגר הקלציה המכיל תאי אפיתל תקינים ושטפו את שברי הגידול הנותרים.

עוד פעם. עם חמישה מיליליטר של מאגר כלציה קר. לאחר שאיבת מאגר הכלציה, שטפו את שברי הגידול בחמישה מיליליטר של XPBS קר.

לאחר השאיבה האחת XPBS מוסיפים חיץ עיכול לשברי הרקמה ודוגרים במשך שעתיים. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, אפשר לשברי הגידול להתיישב תחת כוח משיכה רגיל למשך דקה אחת ולאחר מכן לאסוף את הסופרנטנט S בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. גלולה את תרחיף הגידול של תא בודד על ידי צנטריפוגה ב 200 פעמים G למשך שלוש דקות.

לאחר מכן יש לשטוף פעם אחת עם חמישה מיליליטר PBS וצנטריפוגה. שוב, רווח השהה מחדש את כדור הגידול עם 500 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן ספור תאי גידול בודדים מבודדים באמצעות ציטומטר המו.

לאחר מכן, דחה את תאי הגידול על ידי צנטריפוגה ב-200 פעמים G למשך שלוש דקות ושלח שוב חמישה מיליגרם למיליליטר מטריג'ל על קרח. לאחר מכן צלחת 15,000 תאים בנפח של 50 מיקרוליטר מטריג'ל לבאר בצלחת של 24 בארות. לאחר שאפשרתם לתערובת תאי המטריג'ל להתפלמר במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית בסיס המכיל 50 ננוגרם למיליליטר EGF שתן לכל מדיום תרבית בסיס המכיל EGF כל יומיים ועסו אורגנואידים אחד עד חמישה פעם בשבוע לעיסוי.

לאחר החלפת מדיום התרבות במדיום בסיסי טרי, השתמש בפיפטה P 1000 עם קצה פיפטה חתוך כדי לשבש מכנית את האורגנואידים והמטריג'ל. העבירו את תרחיף האורגנואיד לתוך צינור בז של 15 מיליליטר. השתמש בפיפטה פסטה מלוטשת באש כדי לשבש עוד יותר את האורגנואידים.

שוטפים אורגנואידים מנותקים עם חמישה מיליליטר תרבית בסיסית, בינונית וצנטריפוגה 200 פעמים G למשך שתי דקות. לאחר מכן השליכו את הסופינאט, השעו מחדש את הגלולה עם ג'ל מאטרי וצלחת כפי שתואר קודם לכן כדי להקפיא אורגנואידים, להפריד כביסה וצנטריפוגה. כמו קודם, השליכו את הסופינט והחייאו.

השעו את הגלולה ב-DMEM המכיל 20% סרום בקר עוברי ו-10% תחמוצת דימתיל סולף. לאחר מכן, העבירו את מתלה התאים לצינורות קריו של 1.5 מיליליטר. מעבירים את הצינורות למיכל הקפאה של Nalgene Mr.Frosty ומאחסנים במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס כדי להשיג קצב קירור של מינוס מעלה צלזיוס לדקה.

לאחר הדגירה של הלילה מעבירים את התאים לחנקן נוזלי. ניתן לאחסן את התאים בצורה זו במשך למעלה משנתיים. לצורך מיצוי RNA נאספים התאים.

באשר למעבר, ה-RNA מבודד באמצעות ערכת בידוד ה-RNA הטהור של פיקו. על פי הוראות היצרן למיצוי חלבון, כדור התא נאסף באופן הרגיל ולאחר מכן שוכב ב-100 מיקרוליטר של מאגר בדיקת רדיו אימונוהיסטוכימיה. לאחר שאיבת מדיום תרבית התאים, השתמש בפיפטה P 1000 חתוכה כדי להעביר אורגנואידים של הגידול לתבנית קריו.

מניחים את התבנית על קרח יבש ומוסיפים מדיום הקפאת רקמות לתבנית חותכים חלקים קפואים בשבעה מיקרון ומכתימים על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר, תמונה זו מציגה היווצרות אורגנואידית מייצגת שמקורה בגידול במעי הגס שנלקח מעכבר בן שלושה חודשים, PC min, זמן קצר לאחר הציפוי. תמונה זו מציגה את אותו אורגנואיד יום לאחר הציפוי. כאן, האורגנואיד נמצא בתרבית כבר שלושה ימים.

בעוד שתמונה זו מציגה את האורגנואיד שישה ימים לאחר הציפוי. כאן מוצגים שני אורגנואידים שנמצאים בתרבית במשך 14 יום. שימו לב שבשלב זה, כל אורגנואיד מורכב ממקבץ תאים.

היסטוגרמה זו מציגה את הקצב המוצלח של היווצרות אורגנואידים בשני תנאי עיכול שונים של קולגנאז. תמונות אלה מראות אורגנואידים שמקורם בגידול במעי הגס שנלקח מעכבר בן שלושה חודשים, עכבר PC min עם צביעה אימונו-פלואורסצנטית לבטא-קטנין. DPI שימש להכתמת גרעינים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבסס OID ראשוני של גידול המעי הגס בשתן על ידי עיכול אנזימים.