בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע פרופיל מטבוליט לא ממוקד חזק של סרום בניסוי בקנה מידה גדול. ראשית, חלץ את המטבוליטים בפורמט צלחת. הקמת מדגם ושיטת QC חזקים כדי להבטיח יציבות אנליטית לאורך זמן.

לאחר מכן רכוש נתונים ספקטרליים על QC ודגימות סרום אקראיות בשכפול, המשך לנתונים, עיבוד מקדים, ניתוח סטטיסטי וזיהוי מטבוליטים. ניתן להשתמש בתוצאות של פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי U-P-L-C-M-S לזיהוי סמנים ביולוגיים של מולקולות קטנות בסרום. הפרוטוקול מוצג כאן לניתוח הסרום.

עם זאת, ניתן להרחיב אותו בקלות לניתוח נוזלים ביולוגיים אחרים, כגון שתן, רקמות ותמציות תרבית תאים. כדי ליצור מפת צלחות להכנת דוגמה, פתח גיליון אלקטרוני בעמודה הראשונה, הזן את רשימת הדוגמאות לפי סדר הטעינה. בעמודה השנייה, הזן את 96 מיקומי לוחות הבאר באמצעות המינוח הנכון עבור תוכנת דגימת הרכב שלך.

שמור באר אחת בכל צלחת לדגימת QC. אם דגימת ה-lc autos שלך יכולה להתמודד עם שתי צלחות בו זמנית, הפרד את רשימת הדוגמאות לקבוצות של 190 ושמור מידע זה בגליון עבודה שני. בתוך כל אחת מהקבוצות הללו, סדר את סדר ההזרקה באופן אקראי.

כעת העתק והדבק את הזמנת ההזרקה שלך במערכת התוכנה לתור לדוגמה של LCMS. שמור את שלוש השורות הראשונות של תור הדגימה לזריקות מיזוג עמודות. הכן מלאי של 10 מיליליטר של דגימת QC המכיל מינימום של ארבע תרכובות בעלות מסה וזמן שמירה ידועים המשתרעים על פני הפליטה הכרומטוגרפית של הניסוי.

הפשירו את דגימות הסרום על קרח ומערבלו בעדינות במשך כחמש שניות. הרטיבו מראש את קצות המקטרת בעלת 12 תעלות במתנול כדי לסייע במניעת טפטוף הקצה במהלך חלוקת הדגימה. לאחר מכן הוסף 370 מיקרוליטר מתנול קר לכל באר של העברת צלחת 96 בארות, 100 מיקרוליטר מכל דגימה למיקום הצלחת המתאים ממפות הצלחות.

מכסים את הצלחות ומדגרים בחום של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי לזרז את החלבונים, צנטריפוגה את הצלחות ב -3, 200 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן העבירו 250 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת חדשה של 96 בארות וחזרו על שלב הצנטריפוגה.

כעת העבירו 60 מיקרוליטר של ה-snat ל-3 צלחות באר 96 המתאימות לדגימת המכוניות UPLC או lc. הוסף 100 מיקרוליטר של תערובת דגימת QC למצב הבאר השמור בצלחת. אוטמים כל צלחת בניילון דבק.

הגדר את דגימת הרכב לארבע מעלות צלזיוס. הנח את שתי הלוחות הראשונים לתוך דגימת הרכב. הגדר את שיטת הרכישה באמצעות אחד משני שיפועי הפאזה ההפוכה החלופיים.

שיפוע A מוטה לכיוון מולקולות לא קוטביות. בעוד ששיפוע B יספק כיסוי משופר של מולקולות קוטביות בינוניות. הגדר את ספקטרומטר המסה לאיסוף נתונים במצב חיובי, סריקה מ-50 עד 1200 יחס מטען מסה.

תנאי מכשיר ספציפיים נוספים ישתנו בהתאם למערכת המשמשת בתחילת כל שניים. תיקון צלחת של דגימות הזריק ידנית את דגימות ה-QC חמש פעמים. השתמש בהזרקות QC השלישית עד החמישית כדי לנטר אזור שיא של פחות מ-25%, זמן שימור RSD של פלוס מינוס 0.05 דקות, ודיוק מסה של פלוס או מינוס שלושה חלקים למיליון.

ייתכן שיהיה צורך להתאים פרמטרים אלה כך שיתאימו למפרט המכשיר המשמש לרכישת נתונים. אם דגימות ה-QC עוברות, רכוש נתונים על דגימות סרום עבור שתי הלוחות הללו כאשר רכישת מערך הנתונים כולו הושלמה. בצע זיהוי תכונות, יישור ונורמליזציה של נתוני ספקטרומטריית המסה עבור כל מערך הנתונים.

לאחר מכן בצע ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע תכונות מולקולריות בעלות עניין ביולוגי. שלבים אלה מתוארים בפרוטוקול הטקסט. זרימת העבודה הבאה נמצאת בסקירה מושגית של תהליך זיהוי המטבוליטים.

אסטרטגיה חלופית מסופקת בפרוטוקול הטקסט. השתמש בתוכנה כדי לחזות נוסחה מולקולרית מהמסה המדויקת וההתפלגות האיזוטופית של התכונות המולקולריות המשמעותיות. לאחר מכן, חפש את מדידות המסה המדויקות כנגד מטבוליט פנימי או ציבורי.

מסדי נתונים מסננים את המטבוליט המועמדים, זיהויים לפי נוסחה מולקולרית חזויה של שגיאת מסה, זמן שמירה, פיצול מקור ורלוונטיות ביולוגית במגמות שנצפו ביחס לתכנון ניסוי. זה יביא לזיהוי מטבוליט משוער. זיהוי מוחלט דורש התאמה מדויקת של שימור מסה, זמן ופיצול עבור תרכובת הניסוי עם תקן אותנטי של המטבוליט המשוער.

לבסוף, הקצה ביטחון זיהוי לכל זיהויי המטבוליטים המדווחים על סמך המלצות יוזמת התקנים המטבולומיים. זרימת עבודה זו מציינת את השלבים האנליטיים הבסיסיים של ביצוע ניסוי פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי U-P-L-C-M-S. ניתן לדמיין את הנתונים הגולמיים ככרומטוגרמה של שיא בסיס.

דוגמה זו מציגה דגימת סרום שנותחה על ידי שיפוע לאחר ניתוח סטטיסטי. מנסים לזהות מטבוליט עבור כל התכונות המולקולריות החשובות מבחינה ביולוגית ומובהקות סטטיסטית. הנה. קפאין זוהה בסרום אנושי על ידי התאמת זמן השמירה הכרומטוגרפי, המסה המדויקת ודפוס הפיצול בין התכונה המולקולרית הניסיונית לסטנדרט אותנטי של המטבוליט המשוער.

זוהי דוגמה לזיהוי מטבוליט ברמה אחת לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבטיח יציבות אנליטית במהלך פרופיל מטבוליט בקנה מידה גדול ולא ממוקד של סרום באמצעות UPLC ms. עם זאת, יציבות אנליטית היא רק היבט חשוב אחד של ניסוי מוצלח של פרופיל מטבוליט. תכנון ניסויים וניתוח ופרשנות נתונים במורד הזרם הם גם קריטיים.

אך מחוץ להיקף של מדריך וידאו זה, נושאים אלה מוצגים ונדונים בפרוטוקול הטקסט.