Name: בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: למדו פרופיל מטבולומי ללא ממוקד בסרום בקנה מידה גדול באמצעות UPLC-MS. הפרוטוקול מספק מסגרת אמינה לזיהוי ביומרקרים של מולקולות קטנות במחקר ביורפואי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ההדרכה המוצגת בוצעה ופותחה במתקן הפרוטאומיקה והמטבולומיקה באוניברסיטת קולורדו סטייט, הממומן בחלקו על ידי משאבי מינהל המחקר של CSU לפרויקטים אקדמיים.

1. ארגון לדוגמה
<ol>
	<li>כדי ליצור מפת צלחות להכנת דוגמה בגיליון אלקטרוני, בעמודה הראשונה הזן רשימה לדוגמה לפי סדר הטעינה. בעמודה שנייה הזן את מיקומי 96 לוחות הבאר באמצעות המינוח הנכון עבור תוכנת הדגימה האוטומטית שלך.</li>
	<li>שמור באר אחת בכל צלחת לדגימות QC.</li>
	<li>אם הדגימה האוטומטית של LC שלך יכולה להתמודד עם שתי צלחות בו זמנית, הפרד את רשימת הדוגמאות לקבוצות של 190 ושמור מידע זה בגליון עבודה שני.</li>
	<li>בתוך כל אחת מהקבוצות הללו, השתמש בפונקציה האקראית [note: "=rand()"ב- Excel] כדי לסדר את סדר ההזרקה באופן אקראי. כעת העתק והדבק את הזמנת ההזרקה שלך במערכת התוכנה לתור לדוגמה LC-MS. אקראיות צריכה להתרחש בין קבוצות, בתוך אצוות, ולהיות ייחודית על פני שכפולי הזרקה.</li>
</ol>
2. נהלי הכנת דגימות סרום ובקרת איכות (QC)
<ol>
	<li>הכן מלאי של 10 מ"ל של דגימת QC המכילה מינימום של ארבע תרכובות בעלות מסה וזמן שמירה ידועים המשתרעים על פני הפליטה הכרומטוגרפית של הניסוי. (הערה: קפאין, רסרפין, סולפאדימתוקסין וטרפנדין בריכוז של 2 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד).</li>
	<li>הפשירו את דגימות הסרום על קרח ומערבלו בעדינות במשך ~5 שניות.</li>
	<li>הרטיבו מראש את קצות הפיפטור בעל 12 הערוצים במתנול כדי לסייע במניעת טפטוף קצה במהלך חלוקת הדגימה. לאחר מכן הוסף 370 מיקרוליטר מתנול קר לכל באר של צלחת 96 בארות.</li>
	<li>העבר 100 מיקרוליטר מכל דגימה למיקום הצלחת המתאים ממפות הצלחת. מכסים את הצלחות ודוגרים בחום של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לזרז את החלבונים.</li>
	<li>סובב את הלוחות בצנטריפוגה של 4 מעלות צלזיוס ב-3,200 x גרם למשך 30 דקות. העבירו 250 מיקרוליטר של סופרנטנט לבאר חדשה של 96 וחזרו על הצנטריפוגה.</li>
	<li>כעת העבירו 60 מיקרוליטר של הסופרנטנט לשלוש צלחות של 96 בארות המתאימות לדגימה האוטומטית UPLC או LC.</li>
	<li>הוסף 100 מיקרוליטר של תערובת דגימת QC למצב הבאר השמור בצלחת.</li>
	<li>אוטמים כל צלחת בניילון דבק. ממס עלול להתאדות במהירות לאחר ניקוב הבאר, ולכן יש לבצע הזרקות פעם אחת בלבד מכל צלחת. ניתן לאחסן צלחות בתור הדגימה בטווח הקצר ב-20 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>
3. רכישת נתונים UPLC-MS
<ol>
	<li>הגדר את הדגימה האוטומטית ל-4 מעלות צלזיוס והנח את שתי הלוחות הראשונים לתוך הדגימה האוטומטית.</li>
	<li>הגדר את שיטת הרכישה באמצעות אחד משני שיפועי הפאזה ההפוכה החלופיים. שיפוע A מוטה לכיוון מולקולות לא קוטביות בעוד ששיפוע B יספק כיסוי משופר של מולקולות קוטביות בינוניות.
	<ol>
		<li>שיפוע A: 
		<גבול טבלה="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>זמן (דקות)</td>
					<td>%א</td>
					<td>% B</td>
					<td>עקומה</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1.0</td>
					<td>60</td>
					<td>40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3.0</td>
					<td>30</td>
					<td>70</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11.0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23.0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>שיפוע B 
		<גבול טבלה="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>זמן (דקות)</td>
					<td>%א</td>
					<td>% B</td>
					<td>עקומה</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16.05</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הגדר ספקטרומטר מסה לאיסוף נתונים בסריקה במצב חיובי מ-50-1,200 m/z. תנאי מכשיר ספציפיים נוספים ישתנו בהתאם למערכת שבה נעשה שימוש. להלן מייצג את התנאים המשמשים בספקטרומטר המסה Waters Xevo G2 Q-TOF שלנו: אנרגיית התנגשות = 6V; זמן סריקה = 0.2 שניות לסריקה; מתח נימי = 2,200 וולט; טמפרטורת מקור = 150 מעלות צלזיוס טמפרטורת המסה = 350 מעלות צלזיוס זרימת גז המסה (N2) = 800 ליטר לשעה).</li>
	<li>הזרקו את דגימות ה-QC חמש פעמים בתחילת כל אצווה של 2 צלחות של דגימות. לאחר מיזוג מערכת UPLC-MS בשתי ההזרקות הראשונות, יש לעקוב אחר אזור השיא (<25% RSD), זמן השמירה (+/- 0.05 דקות) ודיוק המסה (+/- 3 ppm) של ההזרקות השלישית עד החמישית. ייתכן שיהיה צורך להתאים פרמטרים אלה כך שיתאימו למפרט המכשיר המשמש לרכישת נתונים.</li>
	<li>אם דגימות QC עוברות, רכוש נתונים על דגימות סרום עבור שתי הצלחות הללו. אם דגימות QC נכשלות, נתוני הדגימה אינם נאספים עד שהבעיה נפתרת ודגימות ה-QC עוברות. במעבדה שלנו מצאנו שפרמטרים אלה יציבים באופן עקבי לאורך שלושה ימי הזרקה (כלומר הזרקה של 2 צלחות באר). אם המערכת שלך נמצאה לא יציבה במהלך פרק זמן זה, זריקות QC תכופות יותר עשויות להיות מתאימות. דגימת ה-QC משמשת לא לתיקון נתונים באיכות ירודה, אלא למניעת איסוף נתונים באיכות ירודה.</li>
</ol>
4. שיא זיהוי, אינטגרציה, יישור ונורמליזציה
ישנן מגוון אפשרויות לביצוע שלבים אלה, כולל תוכנות חינמיות וכלים ספציפיים לספק. שלב זה דילג במדריך הווידיאו אך הגישה שלנו מתוארת להלן כדוגמה.
עבור כל דגימה, הנתונים האנליטיים שנוצרו מניסוי מסוג זה הם פרופיל של יונים כפי שמתואר על ידי זמן שמירה, ערך m/z ועוצמה ספקטרלית. ניסוי פרופיל מטבוליט לא ממוקד יורכב מדגימות רבות ולכן יש לבצע זיהוי שיא, יישור זמן שמירה ונורמליזציה כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי עוקב של מערך הנתונים.
<ol>
	<li>ייצא נתונים גולמיים לפורמט .cdf באמצעות תוכנת Waters DataBridge. בצע זיהוי שיא ויישור זמן שמירה באמצעות חבילת התוכנה XCMS 10 (תוכנה חינמית זמינה בכתובת <a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/</a>) ומבוצעת בסביבה הסטטיסטית R11). אתר האינטרנט מכיל תיעוד כיצד להוריד ולהפעיל את התוכנה.</li>
	<li>השתמש בשיטת "matchedfilter" בתוך XCMS עם הפרמטרים הבאים: רוחב מלא בחצי מקסימום = 8 שניות, מנת S/N = 3, מקסימום 100 פסגות עבור כל כרומטוגרמה של יונים שחולצו. בצע שלבי קיבוץ תכונות, תיקון זמן שמירה, קיבוץ מחדש ו- fillPeaks. הפלט של תוכנת XCMS הוא מטריצת נתונים עם כל התכונות הניתנות לזיהוי הרשומות כשורות, כל דגימה ניסיונית כעמודה, ותאים מאוכלסים באזור השיא של כל תכונה בכל דגימה. טרנספוזיציה של מערך נתונים זה עשויה להיות נחוצה לשילוב בזרימות עבודה סטטיסטיות במורד הזרם.</li>
	<li>נרמל את מטריצת הנתונים ב-R על ידי חלוקת שטח השיא של כל תכונה בדגימה נתונה בסכום שטח שיא היונים שחולץ (המכונה זרם יונים כולל, או TIC עבור אותה דגימה (מוכפל ב-100,000 כדי להפוך את המספרים למתאימים יותר לפירוש נתונים חזותיים).</li>
	<li>הסר חריגים. חריגים בנתונים יכולים לנבוע מהזרקה גרועה של דגימה טובה או הזרקה טובה של דגימה גרועה.
	<ol>
		<li>בצע זיהוי חריג ב-R באמצעות חבילת החריגים עם הפרמטרים הבאים: (1) ערכי TIC ו-(2) ציוני מחשב בביטחון של 99.9%.</li>
		<li>אם קיימים חריגים, קבצי הנתונים המתאימים מוסרים והליכי זיהוי שיא, יישור ונורמליזציה מבוצעים שוב.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ממוצע אזורי השיא המנורמל לפי מזהה הדגימה (לממוצע זריקות מרובות). יש לעשות זאת לפני ביצוע ניתוח סטטיסטי (שימו לב שהזרקת שכפולים לוקחים בחשבון שונות אנליטית, אך לא ניתן להשתמש בהם כשכפולים ביולוגיים אמיתיים).</li>
</ol>
5. ניתוח סטטיסטי
עבור ניסויים מטבולומיים, טכניקות סטטיסטיות רב-משתניות וחד-משתניות נחוצות לפירוש נתונים. שתי טכניקות נפוצות כוללות ניתוח רכיבים עיקריים וניתוח שונות (ANOVA). ישנן מספר דרכים לגשת לניתוח סטטיסטי של הנתונים וכלי תוכנה בקוד פתוח ומסחריים זמינים. שלב זה דילג במדריך הווידיאו אך הגישה שלנו מתוארת להלן כדוגמה.
<ol>
	<li>בצע ANOVA על ידי החלת פונקציית aov על מערך הנתונים ב-R.</li>
	<li>קח בחשבון תוצאות חיוביות מוטעות באמצעות התאמת Benjamini-Hochberg (הפונקציה p.adjust ב-R).</li>
	<li>בצע PCA עם מערך הנתונים בקנה מידה של פארטו (ניתן להחיל גם שונות יחידה) ומערך נתונים ממורכז ממוצע. גם ציוני המחשב וגם הטעינה מחושבים באמצעות חבילת pcaMethods ב-R.</li>
	<li>השתמש בערכי p של ANOVA, ציוני טעינה ופרמטרים של שינוי קיפול כדי לקבוע תכונות מולקולריות המתארות בצורה הטובה ביותר את השונות הקשורה לטיפול הניסיוני.</li>
	<li>חקור ידנית כל תכונה מולקולרית מעניינת כדי לקבוע אם היא מתאימה ליון מולקולרי, אדוקט (למשל נתרן, אשלגן או דימר), או אובדן ניטרלי.</li>
</ol>
6. זיהוי מטבוליט
זרימת העבודה המוצגת כאן היא כללית מאוד וניתן ליישם אותה על תוצאות מכל פלטפורמת מכשירים. אסטרטגיה חלופית מוצגת בסעיף הדיון.
<ol>
	<li>עבור כל התכונות המובהקות סטטיסטית (כפי שנקבע מניתוח בשלב 6) סקור את הנתונים הגולמיים ואשר כי יוני הורים, תוספות נתרן, איזוטופים ושברים עוקבים אחר מגמות דומות במערך הנתונים. לדוגמה, ערך ה-p הנגזר מ-ANOVA עבור יון אב צריך להיות דומה לאיזוטופ שלו. זה מצביע על כך ששתי התכונות המולקולריות תואמות לאותו מטבוליט.</li>
	<li>חפש מדידות מסה מדויקות ו/או הפסדים ניטרליים של תכונות מולקולריות מובהקות סטטיסטית (בחר איזוטופ C12 אם איזוטופים מרובים הם משמעותיים) מול מאגרי מטבוליטים פנימיים (אם זמינים) או זמינים לציבור כגון:
	<ol class="lroman">
		<li>מסד נתונים מטבולומי אנושי (<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>Metlin (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>בנק המוני (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>מפות ליפידים (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>חיפוש MS של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>השתמש בתוכנה כדי לחזות נוסחה מולקולרית מהמסה המדויקת וההתפלגות האיזוטופית של התכונות המולקולריות המשמעותיות שלך. בתוכנת ווטרס, זה מבוצע באמצעות הכלי Elemental Comp בחבילת MassLynx.</li>
	<li>סנן זיהויי מטבוליט מועמדים לפי: שגיאת מסה (בהתאם לפלטפורמת המכשיר שלך), נוסחה מולקולרית חזויה, רלוונטיות ביולוגית במגמות שנצפו ביחס לתכנון הניסוי וזמן שימור (למשל לליפידים ולתרכובות לא קוטביות אחרות יהיו זמני שמירה ארוכים יותר בעת שימוש בכרומטוגרפיה של פאזה הפוכה).</li>
	<li>בצע ניסויים עוקבים כדי לרכוש את פיצול MS/MS עבור תכונות מולקולריות מובהקות סטטיסטית. במידת האפשר, זיהוי מטבוליט צריך להתבסס על התאמת שיאי פיצול ניסיוניים וזמן שימור לזה של תקן אותנטי שנרכש באותו מכשיר. לחלופין, ניתן להתאים פיצול ניסיוני למסד נתונים ספקטרלי.</li>
	<li>יש להקצות ביטחון זיהוי לכל זיהויי המטבוליטים המדווחים על סמך המלצות יוזמת תקני מטבולומיקה12. 
	רמה 1: זיהוי מולקולרי בטוח המבוסס על פרמטרים אנליטיים אורתוגונליים (מסה מדויקת, זמן שמירה ופיצול MS/MS) ביחס לתרכובת אותנטית. 
	רמה 2 מתייחסת לבסיס זיהוי משוער על תכונות פיזיקוכימיות ו/או דמיון ספקטרלי עם ספרות או ספריות ספקטרליות. 
	רמה 3 מתייחסת לזיהוי משוער של מחלקת תרכובות על סמך תכונות פיזיקוכימיות או דמיון ספקטרלי. 
	רמה 4 מתייחסת לתרכובת לא ידועה.</li>
</ol>

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
<li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS-based+analysis+of+human+plasma+for+metabonomics+using+solvent+precipitation+or+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li>
<li>Kamburov, A., Cavill, R., Ebbels, T. M., Herwig, R., Keun, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+pathway-level+analysis+of+transcriptomics+and+metabolomics+data+with+IMPaLA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrated pathway-level analysis of transcriptomics and metabolomics data with IMPaLA.</a> Bioinformatics. 27, 2917-2918 (2011).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetPA%3A+a+web-based+metabolomics+tool+for+pathway+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization.</a> Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).</li>
<li>Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of metabolomics.</a> J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).</li>
<li>Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+discovery%3A+Opportunities+and+pitfalls+in+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods.</a> Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).</li>
<li>Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based metabolomics.</a> Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).</li>
<li>Weckwerth, W., Morgenthal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+from+pattern+recognition+to+biological+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation.</a> Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN+-+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN - A metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Culpepper, S. A., Aguinis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+is+for+Revolution%3A+A+Cutting-Edge%2C+Free%2C+Open+Source+Statistical+Package%5BTitle%5D)+AND+%22Organ+Res.+Methods%22%5BJournal%5D)">R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package.</a> Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3, 211-221 (2007).</li>
<li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 1523-1548 (2012).</li>
<li>Garcia-Canaveras, J. C., Donato, M. T., Castell, J. V., Lahoz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+untargeted+metabonomic+analysis+of+human+steatotic+liver+tissue+by+RP+and+HILIC+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+reveals+important+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive untargeted metabonomic analysis of human steatotic liver tissue by RP and HILIC chromatography coupled to mass spectrometry reveals important metabolic alterations.</a> Journal of Proteome Research. 10, 4825-4834 (2011).</li>
<li>Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ionization+mass+spectrometry+strategy+used+to+reveal+the+complexity+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).</li>
<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Advances in metabolite identification.</a> Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).</li>
<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
<li>Kangas, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identification+software+%28ISIS%29%3A+a+machine+learning+approach+to+tandem+mass+spectral+identification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids.</a> Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מדריך זה נועד לשמש כנקודת התחלה לביצוע פרופיל מטבוליט לא ממוקד בקנה מידה גדול על ידי UPLC-MS. זרימת העבודה מתמקדת במטבוליטים שניתן לחלץ עם ממס מתנול מימי, לשמור על עמודת UPLC C8 או C18, ולזהות אותם כיונים חיוביים. במצב בו אין הטיה קבועה מראש לכיוון מחלקת מטבוליט ספציפית ורצוי השערה היוצרת פרופיל גלובלי, פרוטוקול זה הוא בעל ערך מכיוון שהוא יביא לזיהוי של אחוז גדול של מטבוליטים בסרום ממגוון מחלקות כימיות (כלומר תרכובות קוטביות בינוניות עד לא קוטביות). אם התקציב והזמן מאפשרים, ניתן להרחיב בקלות את כיסוי המטבוליטים ...

המונח "מטבולומיקה" יכול להקיף דברים רבים. לדוגמה, ניתן לבצע ניסוי מטבולומי באמצעות מגוון פלטפורמות אנליטיות כגון NMR וכרומטוגרפיה של גז ו/או נוזל יחד עם ספקטרומטריית מסה. יתר על כן, ניסויים מטבולומיים יכולים להתבצע בצורה ממוקדת או לא ממוקדת, או שילוב של שניהם. ניסוי מטבולומיקה ממוקד יכלול ניתוח מכוון של פאנל של מולקולות החשובות לשאלה הביולוגית העומדת על הפרק (למשל, מולקולות קטנות המעורבות במחזור TCA יאפשרו כימות מדויק של מסלול זה). במצב זה, ההשערה הביולוגית מכתיבה את בחירת המטבוליטים שימוקדו בניתוח והשלבים האנליטיים מותאמים לזיהוי מולקולות אלה. לחלופין, ניסוי מטבולומיקה לא ממוקד מייצר השערות. במקרה זה, הניסוי מבוצע בצורה רחבה ובלתי מוטה כדי לאפשר גילוי של כמה שיותר מטבוליטים. התוצאות מניסוי לא ממוקד יניעו את השלב הבא של המחקר (שבמקרים רבים עשוי לכלול זרימת עבודה מטבולומית ממוקדת). ניתן גם לשלב בין שתי הגישות, ובמקרה זה הניסוי מבוצע באופן לא ממוקד ובמקביל מנוטר פאנל של מולקולות ידועות בתוך הנתונים. 
המדריך המוצג כאן מתמקד במיוחד בפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום. כפי שתואר לעיל, הגישה הלא ממוקדת מספקת תצוגה בלתי משוחדת של המטבוליטים הניתנים לזיהוי, יכולה לייצר כמויות גדולות של מידע, ובסופו של דבר לאפשר תגליות חדשות. השימוש בגישה זו, במיוחד תוך שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS), הופך לנפוץ 1, 2, 3 וכולל את השלבים הבאים: (1) תכנון ניסוי (2) איסוף דגימות (3) הכנת דגימה (4) רכישת נתונים על ידי UPLC-MS (5) עיבוד מקדים של נתונים (זיהוי שיא, אינטגרציה, יישור ונורמליזציה) (6) ניתוח נתונים סטטיסטיים (חד משתנים ורב-משתנים) (7) זיהוי מטבוליט ו (8) ביולוגי פרשנות. 
נכון לעכשיו, אין שיטות סטנדרטיות מבוססות לפרופיל מטבוליט לא ממוקד מבוסס UPLC-MS ולשלבי עיבוד מקדים של נתונים לאחר מכן. חוסר סטנדרטיזציה זה נובע בחלקו מאחד האתגרים האנליטיים העיקריים של פרופיל מטבוליט; המגוון הכימי של המטבולום. בגלל המגוון הזה, לא ייתכן ששיטת מיצוי אחת או שיטת רכישת ספקטרומטריית מסה תספק כיסוי מקיף של כל המטבוליטים בניתוח יחיד. בקונספט, ניתן למקסם את כיסוי המטבוליטים על ידי שימוש במיצויים מרובים (למשל מימי, מתנול, כלורופורם: מתנול וכו') יחד עם תנאים כרומטוגרפיים שונים (למשל פאזה הפוכה, HILIC וכו') ומצבי יינון שונים (למשל יון חיובי, יון שלילי, יינון כימי וכו'.). עם זאת, לעתים קרובות, לחוקרים אין הטיה קבועה מראש לסוג כימי ספציפי ולכן ההוצאה של ביצוע מיצוי מרובה ורכישת מכשירים אינה מוצדקת, במיוחד עבור ניסויים בקנה מידה גדול. לפיכך, מדריך הווידיאו המוצג כאן נועד לספק נוהל כללי לפרופיל מטבוליט לא ממוקד בקנה מידה גדול של סרום על ידי UPLC-MS. זה יאפשר למעבדות חדשות ומבוססות לבצע ניסויים מסוג זה ואת אבני הבניין שעליהן הן יכולות להרחיב את הגישה לסוגי דגימות שונים, מחלקות כימיות ספציפיות או ניתוח ממוקד. באופן ספציפי, פרוטוקול זה יכלול את השלבים של: הכנת דגימת סרום, ארגון דגימה למחקרים בקנה מידה גדול, רכישת נתוני UPLC-MS, נהלי בקרת איכות (QC) וזיהוי מטבוליטים. כמו כן מוצגות אסטרטגיות לעיבוד מקדים של נתונים וניתוח סטטיסטי.
הפרוטוקול לא יתמקד בשלבים של תכנון ניסוי, איסוף דגימות או פרשנות נתונים ביולוגיים מכיוון שהוא מחוץ לתחום של הדרכה זו. עם זאת, קיימים משאבים רבים בספרות לנושאים אלה והמחברים מעודדים חוקרים חדשים במטבולומיקה לחקור ביסודיות את 4, 5, 6, 7, 8, 9. בפרט, תכנון ניסוי חשוב ביותר והוא קריטי להצלחת ניסוי מטבולומי לא ממוקד. יש לקחת בחשבון גורמים כגון שכפול ביולוגי מתאים ועקביות בהליך איסוף הדגימות (למשל זמן על הספסל, טמפרטורת אחסון, זמן אחסון, הקפאה-הפשרה וכו') כדי להבטיח מחקר בר-קיימא וכדי להקל על פרשנות ביולוגית מתאימה של הנתונים.

<table><tbody><tr><td>96 צלחות באר - 500 &mu; l בארות</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>אלה משמשים להכנת מדגם</td></tr><tr><td>96 מחצלות צלחות באר</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>אלה משמשים להכנת מדגם</td></tr><tr><td>96 צלחות באר - 350 &mu; l בארות</td><td>תאגיד ווטרס</td><td>WAT058943</td><td>אלה משמשים להזרקת דגימה</td></tr><tr><td>96 שטיחי צלחת באר</td><td>תאגיד ווטרס</td><td>186000857</td><td>אלה משמשים להזרקת דגימה</td></tr><tr><td>אטמי חום 96 בארות</td><td>תאגיד ווטרס</td><td>186002789</td><td>אלה יכולים לשמש להזרקת דגימה או לאחסון לטווח ארוך</td></tr><tr><td>אוטם חום צלחת 96 באר </td><td>תאגיד ווטרס 186002786</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול בדרגת LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל בדרגת LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS כיתה aater</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית בדרגת LC-MS</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>פיפטור אלקטרוני רב ערוצי</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפט</td><td>Eclipse (נרכש דרך Light Labs)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מצוננת - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - צור קשר עם Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra performance Liquid Chromatography (UPLC) System</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - צור קשר עם Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>UPLC C8 column (אפשרות שיפוע a)</td> <td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UplC T3 column (אפשרות שיפוע b) </td><td>Waters תאגיד</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF ספקטרומטר מסה</td><td>תאגיד ווטרס</td><td>N/A - צור קשר עם תאגיד</td><td></td> ווטרס</tr></tbody></table>

בקנה מידה גדול profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-mass ספקטרומטריית ultra (uplc-ms)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים. הגישה מציעה ניתוח מעמיק וחסר פניות שיכול לאפשר פיתוח בדיקות אבחון, טיפולים חדשים וקידום ההבנה שלנו של תהליכי מחלה. המגוון הכימי המובנה של המטבולום יוצר אתגרים אנליטיים משמעותיים ואין גישה ניסויית אחת שיכולה לזהות את כל המטבוליטים. בנוסף, השונות הביולוגית בחילוף החומרים האישי והתלות של חילוף החומרים בגורמים סביבתיים מחייבת מספרי מדגם גדולים כדי להשיג את הכוח הסטטיסטי המתאים הנדרש לפרשנות ביולוגית משמעותית. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, מדריך זה מתאר זרימת עבודה אנליטית עבור פרופיל מטבוליט לא ממוקד בקנה מידה גדול של סרום על ידי UPLC-MS. הנוהל כולל הנחיות לארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליט ויאפשר רכישה אמינה של נתונים לניסויים גדולים ויספק נקודת התחלה למעבדות חדשות לפרופיל מטבוליטים לא ממוקד על ידי UPLC-MS.

השלבים האנליטיים הבסיסיים של ניסוי לפרופיל מטבוליים לא מכוון באמצעות UPLC-MS מפורטים באיור 1. ניתן להציג את הנתונים הגולמיים עבור כל דגימה ככרומטוגרמה של שיא הבסיס (base peak chromatogram). איור 2 מציג דוגמה לכרומטוגרמה של שיא הבסיס של דגימת סרום שננתחה באמצעות אפשרות הגרדיאנט (a) במדריך. בעקבות הניתוח הסטטיסטי שתואר לעיל, מבוצע ניסיון לזיהוי מטבוליטים עבור כל המאפיינים המולקולריים המובהקים סטטיסטית. זיהוי בביטחון גבוה (רמה 1) דורש התאמה של זמן השהייה כרומטוגרפי, מסה מדויקת ותבנית פרגמנט...

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים. מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע פרופיל מטבוליים שאינו ממוקד (non-targeted) של סרום בניסוי רחב היקף. ראשית, יש לבצע מיצוי של המטבוליטים בפורמט של פלטה. הגדירו דגימת QC ושיטה יציבות כדי להבטיח יציבות אנליטית לאורך זמן.לאחר מכן, רכשו נתוני ספקטרומטריית מסה עבור דגימות QC ודגימות סרום שהוקצו באופן אקראי בחזרות, והמשיכו לעיבוד מקדימה של הנתונים, ניתוח סטטיסטי וזיהוי מטבוליטים. ניתן להשתמש בתוצאות של פרופיל מטבוליים לא מכוון באמצעות U-P-L-C-M-S כדי לזהות ביומרקרים של מולקולות קטנות בסרום. הפרוטוקול מוצג כאן עבור ניתוח של סרום.עם זאת, ניתן להרחיב זאת בקלות לניתוח של נוזלים ביולוגיים אחרים, כגון שתן, רקמות ותמציות מתרביות תאים. כדי ליצור מפת פלטה להכנת דגימות, פתחו גיליון אלקטרוני. בעמודה הראשונה, הזינו את רשימת הדגימות לפי סדר הטעינה. בעמודה השנייה, הזינו את מיקומי הבארות בפלטת 96 הבארות תוך שימוש בנומנקלטורה הנכונה עבור תוכנת הדגימה האוטומטית שלכם.שמרו באר אחת בכל פלטה עבור דגימת ה-QC. אם דוגם האוטו-סמפלר של ה-lc שלכם יכול לטפל בשתי פלטות בו-זמנית, חלקו את רשימת הדגימות לקבוצות של 190 ושמרו מידע זה בגיליון עבודה שני. בתוך כל אחת מהקבוצות הללו, בצעו רנדומיזציה לסדר ההזרקה.כעת העתיקו והדביקו את סדר ההזרקה שלכם למערכת התוכנה של תור הדגימות של ה-LCMS. שמרו את שלוש השורות הראשונות בתור הדגימות להזרקות של התניית עמודה. הכינו מלאי של 10 milliliter של דגימת QC המכילה לפחות ארבעה תרכובים בעלי מסה וזמן රැטינציה ידועים, המכסים את טווח האלוציה הכרומטוגרפית של הניסוי.הפשיר את דגימות הסרום על קרח וערבב בעזרת וורטקס בעדינות למשך כחמישה שניות. הרטב מראש את קצות הטיפים של פיפט 12 ערוצים במתנול כדי למנוע טפטוף מהטיפים במהלך חלוקת הדגימות. לאחר מכן, הוסף 370 µL של מתנול קר לכל באר בלוח העברה של 96 בארות, והעבר 100 µL מכל דגימה למיקום התואם בלוח לפי מפות הלוחות.כסו את הפלטות והדגירו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי להשקיע את החלבונים, סבבו את הפלטות בצנטריפוגה ב-3,200 Gs ובטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו 250 µL של הנוזל העליון (supernatant) לפלטת 96 בארות חדשה וחזרו על שלב הצנטריפוגציה.כעת העבירו מנות של 60 µL מה-snat ל-3 פלטות של 96 בארות המתאימות למדגם האוטומטי של ה-UPLC או ה-lc. הוסיפו 100 µL של תערובת דגימות QC למיקום הבאר השמור בפלטה. אטמו כל פלטה באמצעות סרט דביק.כוון את הדגימה האוטומטית (autosampler) לארבע מעלות צלזיוס. הנח את שתי הפלטות הראשונות לתוך הדגימה האוטומטית. הגדר את שיטת הרכישה באמצעות אחד משני מדרגי הפאזה ההפוכה (reverse phase gradients) החלופיים.מדורג A מוטה כלפי מולקולות לא פולריות. לעומת זאת, מדורג B יספק כיסוי משופר של מולקולות פולריות באופן בינוני. הגדירו את ספקטרומטר המסות לאיסוף נתונים במצב חיובי, עם סריקה של יחס מס/מטען מ-50 עד 1200.תנאי מכשיר ספציפיים נוספים ישתנו בהתאם למערכת המשמשת בתחילת כל שתיים. פסיגה של דגימות (Plate patch). הזרק ידנית את דגימות ה-QC חמש פעמים. השתמש בהזרקות ה-QC השלישית עד החמישית כדי לבחון שטח שיא של פחות מ-25%RSD, זמן שימור של פלוס או מינוס 0.05 דקות, ודיוק מסה של פלוס או מינוס שלושה חלקים למיליון.ייתכן שיהיה צורך להתאים פרמטרים אלה למפרטים של המכשיר המשמש לרכישת הנתונים. אם דגימות ה-QC עוברות, רכוש נתונים מדגימות סרום עבור שתי הלוחיות הללו כאשר רכישת מערך הנתונים המלא תסתיים. בצע זיהוי מאפיינים (feature detection), יישור (alignment) ונורמליזציה של נתוני ספקטרומטריית המסה עבור מערך הנתונים המלא.לאחר מכן, בצע ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע מאפיינים מולקולריים בעלי עניין ביולוגי. שלבים אלו מתוארים בפרוטוקול הכתוב. סבב העבודה הבא הוא סקירה מושגית של תהליך זיהוי המטבוליטים.אסטרטגיה חלופית מפורטת בפרוטוקול הכתוב. השתמש בתוכנה כדי לחזות נוסחה מולקולרית על סמך המסה המדויקת וההתפלגות האיזוטופית של המאפיינים המולקולריים המשמעותיים. לאחר מכן, בצע חיפוש של מדידות המסה המדויקת מול מאגרי מטבוליטים פנימיים או ציבוריים.מסדי נתונים מסננים את המטבוליט המועמד, זיהויים על פי שגיאת מסה של נוסחה מולקולרית חזויה, זמן שימור, פרגמנטציה במקור (insource fragmentation), ורלוונטיות ביולוגית במגמות שנצפו ביחס לתכנון הניסויי. תהליך זה יוביל לזיהוי משוער של המטבוליט. זיהוי מוחלט דורש התאמה של מסה מדויקת, זמן שימור ופרגמנטציה של התרכובת הניסויית אל מול סטנדרט אותנטי של המטבוליט המשוער.לבסוף, הקצה רמת ביטחון בזיהוי לכל זיהויי המטבוליטים שדווחו, בהתבסס על המלצות ה-metabolomic standards initiative. תהליך עבודה זה מציג את השלבים האנליטיים הבסיסיים לביצוע ניסוי של פרופיל מטבוליטים לא מכוון באמצעות U-P-L-C-M-S. ניתן להציג את הנתונים הגולמיים ככרומטוגרם של שיא הבסיס (base peak chromatogram).דוגמה זו מציגה דגימת סרום שנ为了ננתה באמצעות גרדיאנט בעקבות ניתוח סטטיסטי. זיהוי מטבוליטים מבוצע עבור כל המאפיינים המולקולריים בעלי חשיבות ביולוגית ומובהקות סטטיסטית. כאן, קפאין זוהה בסרום אנושי על ידי התאמת זמן השהייה הכרומטוגרפי, המסה המדויקת ותבנית הפרגמנטציה בין המאפיין המולקולרי הניסויי לבין סטנדרט אותנטי של המטבוליט המשוער.זוהי דוגמה לזיהוי מטבוליטים ברמה אחת. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להבטיח יציבות אנליטית במהלך פרופיל מטבוליטים לא-מכוון בקנה מידה גדול של סרום באמצעות UPLC ms. עם זאת, יציבות אנליטית היא רק היבט אחד חשוב בניסוי מוצלח של פרופיל מטבוליטים. גם לתכנון הניסוי, לניתוח הנתונים השלישי ולפרשנותם יש חשיבות קריטית.אך מחוץ להיקפו של מדריך וידאו זה, נושאים אלו מוצגים ונדונים בפרוטוקול הכתוב.

large-scale-non-targeted-metabolomic-profiling-serum-ultra

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.

טכניקת הכנה רב שלבים לשחזר חוגים מתחם המטבוליט מרובים לעומק וניתוח Metabolomic אינפורמטיבי

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

פרוטוקול מפורט מתואר את ההפרדה, זיהוי של אפיון proteoforms דגימות חלבון באמצעות נימי אזור אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS). הפרוטוקול יכול לשמש עבור אפיון ברזולוציה גבוהה proteoforms דגימות חלבון וזיהוי בקנה מידה גדול של proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים.

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה למעקב סמים מקיף המאפשר רזולוציית משופרת וזיהוי של לוחות גדולים של סמים של התעללות מטבוליטים שלהם, עם בקרת איכות המבוססת על הזרקת multisegment-נים אלקטרופורזה-ספקטרומטריית.

מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

מטרת פרוטוקול זה היא לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה באמצעות שיטת ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה ממוקדת למחצה.

כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב ניתוח ספקטרומטריה המונית של מטבוליטים פנוליים בפלזמה של קשישים

למדו פרופיל מטבולומי ללא ממוקד בסרום בקנה מידה גדול באמצעות UPLC-MS. הפרוטוקול מספק מסגרת אמינה לזיהוי ביומרקרים של מולקולות קטנות במחקר ביורפואי.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

גלה סרטונים נוספים