עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות
25 באפריל 2013
עיצבנו bioreactor טעינה מכאני רומן שניתן להחיל מאמץ מכאני uniaxial או biaxial לbiocomposite סחוס לפני ההשתלה לתוך פגם סחוס במפרק.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לייצר ביו-קומפוזיטים תפקודיים של רקמה מהונדסת לצורך השתלה. דבר זה מושג על ידי הפעלת מאמץ מכני חד-צירי או דו-צירי מדויק כדי לספק גירויים ביו-פיזיקליים לתאים בתוך קומפוזיטים תלת-ממדיים של חומרים ביולוגיים. כשלב שני, הביוריאקטור מצויד בתא עומס, המספק משוב של כוח ובדיקה מכנית של הביו-קומפוזיטים במהלך ההעמסה.
בשלב הבא, מטפחים את הביוקומפוזיטים במשך מספר שבועות כדי להשרות שינויים במקנה מיקרוסקופי בתכולה הביוכימית ובחוזק של המבנה; התוצאות המתקבלות מראות את ההשפעה של סוגי עומס שונים, בהתבסס על הבדלים משמעותיים בתכולת הגליקוזאמינוגליקנים והקולגן, בעובי הפיגום ובמודול השיווי משקל. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי השפעות עומס דו-צירי על רקמת סחוס מהונדסת, ניתן ליישמה גם לרקמות אחרות בעלות יכולת נשיאה נמוכה, כגון עצם וגיד. את הפרוצדורה יעגילו Amy May ו-Rob Stefani מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הגדירו ביו-ריאקטור דו-צירי כפי שמוצג כאן.
בסיס הביוריאקטור מורכב מלוח אלומיניום במידות של 25 סנטימטרים על 30 סנטימטרים ובעובי של 12.5 מילימטרים. אפשרויות המיקום המשתנות מאפשרות קיבוע גמיש של פלטות תרביות רקמה בצורות ובגדלים שונים. לאחר מכן, יש לוודא כי הבמות מותקנות על הבסיס כך שהבמה האופקית מספקת כסחף (shear) דינמי על ידי תנודה לאורך ציר ה-x בלבד.
והבמה האנכית מספקת דחיסה דינמית על ידי תנודות לאורך ציר Z בלבד. השלב הבא הוא ייצור של פלטת טעינה מותאמת אישית מפוליסולפון. חומר הפוליסולפון הוא אידיאלי בשל התאימות הביולוגית שלו, קלות העיבוד שלו וקלות הסטריליזציה שלו.
חברו את הפלטה ואת פלטפורמת התנועה הדו-צירית באמצעות תומך זוויתית שעובד בדיוק גבוה. למעצורי הקינמטיקה המחוברים לפלטת הבסיס יש ברגי כיוון עדין המאפשרים יישור מדויק של פלטות התרבית, שאינו ניתן להשגה באופן ידני. לאחר מכן, חברו את המפעיל של מנוע הפסעות (stepper motor) לכל פלטפורמה, אשר יספק משוב מיקומי עבור התוכנה.
למפעילים של מנועי הצעד המוצגים כאן יש חזרתיות דו-כיוונית של 0.1 micrometer ורזולוציה של 20 nanometers, המתרגמת לדיוק של פחות משלושה micrometers לאורך 50 millimeters של תנועה; שלט על תנועות הבמות באמצעות תוכנת טכנולוגיית המיקום המתקדמת של Thor Lab. התוכנה שולטת במנוע הצעד כדי להתאים את פרמטרי העומס של התדר והאמפליטודה של גזירה ודחיסה באופן עצמאי וסימולטני. לאחר מכן, מקם תא עומס מיניאטורי של חמישה פאונד בין פלטינת ההעמסה לבין הפלטפורמה הנעה כדי לספק את המשוב של הכוח הדרוש לזיהוי מגע בין הפלטינה למבנים, וכן כדי להעריך את תגובות ההעמסה.
וודאו שלתא העומס (load cell) יש רמת דיוק גבוהה של 0.15% עד 0.25% מסך המבט (full scale), ושיחידת התצוגה של תא העומס כוללת יציאת RS 2 32 כדי לאפשר איסוף נתונים במחשב. כדי לקבע את הדגימות בתוך הבארות של פלטת 24 בארות, הכינו תבנית לג'ל agar בעובי 1.5 millimeter באמצעות מערכת ליציקת ג'ל עם מפרידים של 1.5 millimeter. לאחר ההרכבה, שפכו תמיסה של 4% agar בין שתי לוחות הזכוכית והמתינו לקירור התערובת.
לאחר מכן, הסירו את הפלטה העליונה והוציאו דיסקית בקוטר 16 מילימטר מהלוח האגרונומי (agro slab). עבור כל דגימת באר, נקבו חור בדיסקית שבו תמוקם הדגימה. הניחו את הדיסקיות המוכנות בבארות של פלטת 24 בארות.
לאחר מכן, דחפו מבני רקמה בעובי 2.25 millimeter ובקוטר five millimeter לתוך כל אחד מתושבי הג'ל. הדגימה צריכה לבלוט מהחלק העליון של כל תושב aeros. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של מצע גידול לכל באר והחזירו את המכסה.
לאחר מכן, החזירו את הפלטה לאינקובטור עד למועד טעינת הדגימות. כדי להתחיל בהפעלת עומס מכני על מבני הרקמה, הצמידו את פלטת האלומיניום לתא העומס (load cell) וצמידו מכל פלטינה סטרילי לבמה האנכית בכל עת. יש להפעיל את האינקובטור בתנאי לחות נמוכה כדי למנוע כשל במכשיר.
בשלב הבא, הפעילו את בקר מנוע הפסעות (stepper motor) ואת המחשב. פתחו את תוכנית המשתמש של טכנולוגיית המיקום המתקדמת ועברו ללשונית הבקרה הגרפית בשני המסכים. לחצו על כפתור ה-home zero כדי לשלוח את שני מנועי הפסעות לנקודת האפס, המוגדרת כמיקום העליון והימני ביותר.
הכינו את הדגימות לטעינה על ידי הסרת חלק מהמצע מכל באער כדי למנוע גלישה במהלך הטעינה המכנית. לאחר מכן, הניחו את הפלטה בעלת 24 הבאערים בתוך הביוריאקטור ויישרו אותה בזהירות עם הפלטינה באמצעות ארבעה ממתקני מיקום קינמטיים מתכווננים, וודאו שהפלטה מיושרת. בצעו שטיפה (Flush) באמצעות החלק הקדמי של בסיס הביוריאקטור בלשונית הבקרה הגרפית.
בצעו כיוונון עדין ידני של היישור על ידי לחיצה על תיבת המיקום כדי להזיזו אופקית. כאשר הפלטה מיושרת עם בארי הלוחית, התחילו להוריד את הפלטה עד למגע ראשוני עם הדגימות.
ברגע שהגעתם לעמדת ההתחלה, עברו ללשונית רצף התנועה (move sequencer) וטענו את רצף התנועה הרצוי על ידי לחיצה על load, או צרו תוכנית משלכם כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף לסרטון זה. לאחר מכן, לחצו על run כדי להתחיל את התוכנית. התוכנה תנחה את המנועים להחיל את משטר ההתנייה הרצוי על הדגימות.
בסיום התוכנית, הרם ידנית את הפלטה כך שתהיה מעל החלק העליון של פלטת תרבית הרקמה. לאחר מכן, הוצא את פלטת 24 הגלגלים מהביוראקטור והחלף את המצע. לבסוף, הסר בזהירות את הפלטינה מתא השקילה (load cell) וכבה את המכשירים.
לשימוש בביוראקטור הבי-אקסיאלי (biaxial) המתואר בסרטון זה הייתה השפעה משמעותית על כמות הגליקוזאמינוגליקנים והקולגן שהופרשו על ידי תאים בתוך מבני רקמה מהונדסים. התנאי (Conditioning) התבצע חמישה ימים בשבוע, במשך שלוש שעות ליום, עם 10% compression strain ו-5% shear strain בתדר של 1Hz. לאחר 30 ימי תרבית, כמות הגליקוזאמינוגליקנים והקולגן שהופרשו על ידי כונדרוציטים שנחשפו לעומס בי-אקסיאלי הייתה גבוהה משמעותית מזו של דגימות הביקורת. עומס יוני-אקסיאלי (Uniaxial) הגביר באופן משמעותי רק את כמות הגליקוזאמינוגליקנים.
בנוסף, טעינה דו-צירית יצרה מבנים עבים יותר, אך לא הראתה השפעה על גמישות המבנים. בשימוש בפרוטוקול מינון זה, לאחר 30 ימים של התנייה ותרבית, נצבעו חתכים רוחביים של מבני הרקמה עם סממנים טיפוסיים של סחוס, כולל ספרון כחול וקולגן מסוג שני. שלוש הקבוצות השונות כוללות ללא התנייה, טעינה חד-צירית וטעינה דו-צירית.
בעוד שכל הקבוצות מראות צביעה חיובית ל-alium Blue ו-Saffron O, הדגימות שהועמסו באופן דו-צירי (bi-axial) מראות כמויות מוגברות של קולגן מסוג 2 בהשוואה לדגימות ללא העמסה ולדגימות שהועמסו באופן חד-צירי (uni-axial). לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להחיל עומסים חד-ציריים או דו-ציריים על מבנים של רקמה מהונדסת בשלבי התפתחות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג ביו-ריאקטור בעל עומס מכני חדשני שתוכנן להפעיל מאמץ מכני חד-צירי או דו-צירי על ביו-composite של סחוס. המטרה היא להגביר את הגירויים הביופיזיים לתאים לפני השתלתם לפגמים בסחוס מפרקי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- הנדסת רקמות
- ביומכניקה
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- הנדסת רקמות פונקציונלית שואפת ליצור מבני רקמה חיוניים להשתלה.
- ידוע כי מאמץ מכני משפיע על התנהגות תאית ועל התפתחות רקמות.
- ביוראקטורים יכולים לספק סביבות מבוקרות לתרבית רקמה.
- מחקרים קודמים הראו את חשיבותו של עומס מכני בהתפתחות סחוס.
מטרת המחקר
- ליצור ביו-קומפוזיטים תפקודיים בהנדסת רקמות לתיקון סחוס.
- לבחון את ההשפעות של עומס מכני על התוכן הביוכימי והחוזק של רקמות מהונדסות.
- לבחון את הישימות של הביוריאקטור עבור רקמות אחרות בעלות עומס נמוך, כגון עצם וגיד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח ביו-ריאקטור המסוגל להפעיל מאמץ מכני.
- שימוש בתא עומס (load cell) למשוב כוח במהלך ההעמסה.
- גידול ביו-קומפוזיטים לאורך מספר שבועות להערכת שינויים בתכולה הביוכימית.
- מדידת תכולת גליקוזאמינוגליקן וקולגן, עובי הפיגום ומודול שיווי משקל.
תוצאות עיקריות
- נצפו הבדלים משמעותיים בתוכן הביוכימי בהתבסס על סוג העומס.
- שינויים במקנה מיקרו בחוזק המבנה הושרו על ידי מאמץ מכני.
- השיטה הדגימה פוטנציאל ליישום בסוגי רקמות שונים.
- התוצאות מצביעות על חשיבותו של עומס מכני בהנדסת רקמות.
מסקנות
- הביוריאקטור החדש מפעיל מאמץ מכני ביעילות כדי לשפר את התפתחות הרקמה.
- הממצאים תומכים בהשערה כי עומס מכני משפיע על איכות הרקמה.
- ניתן להתאים גישה זו לסוגים אחרים של רקמות מעבר לסחוס.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביוראקטור זה מאפשר גרייה מכנית מדויקת של מבנים בהנדסת רקמות, ומספק פלטפורמה מבוקרת להערכת רמזים ביופיזיקליים המשפיעים על ייצור המטריצה החוץ-תאית ועל הבשלת המבנה. באמצעות החלת פרופילי מאמץ דו-צירים מוגדרים, הוא תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתוכניות של רפואה רגנרטיבית בשלבים מוקדמים, ומסייע בתעדוף מועמדים על בסיס איכות רקמה תפקודית ולא על בסיס סממנים ביוכימיים בלבד. התאימות של המערכת לפלטות תרבית ואינקובטורים סטנדרטיים מאפשרת שילוב חלק בתהליכי גילוי קיימים עבור מודלים של רקמות סחוס, עצם וגיד.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של נתיבי העברה מכנית (mechanotransduction) על ידי הפעלת אמפליטודות ותדרים מוגדרים של מאמץ, כדי להעריך את השפעתם על דיפרנציאציה כונדרוגנית והשקעת מטריקס.
- ערך תפעולי: מספק קלטים מכניים כמותיים וניתנים לשחזור, המפחיתים את השונות בהערכה של מבנים בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתוני תגובה למינון המקשרים בין פרמטרי עומס מכני לבין פלט של גליקוזאמינוגליקן וקולגן, מה שמאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה לסריקת מכנוביולוגיה.
- ערך תפעולי: משלב משוב כוח באמצעות תא עומס לניטור תגובה של המבנה בזמן אמת, ובכך משפר את מהימנות הבדיקה ואת הספיקות שלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בהערכת הבשלת המבנה והשלמות המבנית תחת עומס דמוי פיזיולוגי, ומספק מידע לקבלת החלטות בנוגע להתקדמות בשלב הפרה-קליני.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה אורךית של התפתחות הרקמה לאורך שבועות, בתיאום עם לוחות הזמנים של מחקרים פרה-קליניים לאפיון בטיחות ויעילות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
הביוראקטור משתלב ברצף הגילוי, החל מאישוש ראשוני של המטרה, דרך אופטימיזציה של מולקולות מובילות ועד להערכה פרה-קלינית, ובמיוחד עבור יעדים של רקמות רגישות למכניקה שבהן התוצאה הפונקציונלית מנבאת את הביצועים in vivo.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשר בדיקת השערות לגבי האופן שבו רמזים מכניים מווסתים התנהגות תאים ויצירת רקמות במערכות ביו-חומרים תלת-ממדיות.
- סריקה: מספק גירוי מכני סטנדרטי וחזרתי המאפשר ניתוח השוואתי של תגובות המבנה תחת תנאים שונים.
- אנליטיקה: מספק קריאות כמותיות של שינויים בגיקוזאמינוגליקן, קולגן ומודולוס, ובכך תומך בבחירת מבנה מבוססת נתונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב התגליות לשלבים הפרה-קליניים על ידי הערכת הבשלת המבנה בסביבות מכניות ביו-מימטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מתוכנן ליישום ברב-רקמות (סחוס, עצם, גיד) ובפורמטים של פלטות סטנדרטיות, מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי קישור גירויים מכניים לתוצאות תפקודיות של רקמות, ובכך מפחית את ההסתמכות על סממנים חלופיים.
- ערך תפעולי: מספק דיוק מיקומי גבוה (<3 µm) ומשוב כוח (0.15–0.25% מסך המקש) עבור משטרי העמסה מדויקים וברי-שליטה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי זיהוי מבנים בעלי ייצור מטריקס ועובי עליונים תחת העמסה מוגדרת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים להנדסת רקמות בהתבסס על ביצועים תגובתיים למכניקה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביומכניקה, תרביות רקמה ומערכות בקרת תנועה מדויקת.
- תלוי במפעילים של מנועי צעד, מקודדים אופטיים ליניאריים ומכשור של תאי עומס לצורך בקרה בלולאה סגורה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי יישור וקיבוע של פלטות תרבית בין משתמשים ומעבדות שונות.
- חייב להתחשב בגורמים סביבתיים, כגון לחות האינקובטור, כדי למנוע סחף במכשור.
- מוגבל למבנים התואמים להעמסה מבוססת פלטה (platen-based) ולטווחים מוגדרים של מאמץ (למשל, עד 10% דחיסה, 5% גזירה).
