עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר חומרים מרוכבים ביולוגיים מהונדסים רקמות פונקציונליות להשתלה. זה מושג על ידי הפעלת מתח מכני חד צירי או ביו-צירי מדויק כדי לספק גירויים ביופיזיים לתאים בחומרים מרוכבים תלת מימדיים. כשלב שני, הביוריאקטור מצויד בתא עומס, המספק משוב כוח ובדיקה מכנית של החומרים המרוכבים הביולוגיים במהלך הטעינה.

לאחר מכן, החומרים המרוכבים הביולוגיים מתורבתים במשך תקופה של שבועות על מנת לגרום לשינויים בקנה מידה מאקרו בתוכן הביוכימי של המבנה ובחוזק מתקבלות תוצאות המראות את ההשפעה של סוגים שונים של העמסה בהתבסס על ההבדלים המשמעותיים בתכולת הגליקוזאמינוגליקן והקולגן, הפיגום, העובי ומודול שיווי המשקל. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעות של עומס דו-צירי על רקמת סחוס מהונדסת, ניתן ליישם אותה גם על רקמות אחרות בעלות נושאות נמוכות כמו עצם וגידים, מה שמדגים שההליך יהיה איימי מיי ורוב סטפאני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הגדר ביו-ריאקטור ביו-צירי כפי שמוצג כאן.

בסיס הביוריאקטור מורכב מלוח אלומיניום בגודל 25 ס"מ על 30 ס"מ על 12.5 מילימטרים. אפשרויות המיקום המשתנות הזמינות מאפשרות הרכבה גמישה של לוחות תרבית רקמות בצורות וגדלים שונים. לאחר מכן, ודא שהשלבים מותקנים על הבסיס כך שהאופקי tagיספק גזירה דינמית על ידי תנודה רק לאורך ציר ה-x.

והשלב האנכי מספק דחיסה דינמית על ידי תנודה רק לאורך ציר Z. השלב הבא הוא ייצור לוחית טעינה מותאמת אישית של פוליסולפון. חומר הפוליסולפון אידיאלי בגלל התאימות הביולוגית שלו, קלות העיבוד וקלות העיקור.

חבר את הצלחת, הפלטפורמה הנעה הדו-צירית באמצעות תושבת זווית ישרה מעובדת מדויקת. לעצירות הקינמטיות המחוברות ללוחית הבסיס, יש ברגי כוונון עדינים כדי לאפשר יישור מדויק של לוחות התרבות שאינם ניתנים להשגה ביד. לאחר מכן, חבר את מפעיל מנוע הצעד לכל פלטפורמה, אשר ירכוש משוב מיקום עבור התוכנה.

למפעילי מנוע הצעד המוצגים כאן יש יכולת חזרה דו-כיוונית של 0.1 מיקרומטר ורזולוציה של 20 ננומטר המתורגמת לדיוק של פחות משלושה מיקרומטר מעל 50 מילימטרים של נסיעה שולטים בתנועות השלבים באמצעות תוכנת טכנולוגיית המיקום המתקדמת של Thor Lab. התוכנה שולטת במנוע הצעד על מנת להתאים את פרמטרי העומס של תדר ומשרעת של שקוף ודחיסה באופן עצמאי ובו זמנית. לאחר מכן, מקם תא עומס מיניאטורי של חמישה פאונד בין פלטינה הטעינה לפלטפורמה הנעה כדי לספק את משוב הכוח הדרוש לזיהוי מגע בין הפלטינה למבנים, כמו גם להעריך את תגובות ההעמסה.

ודא שלתא העומס יש דיוק גבוה של 0.15% עד 0.25% בקנה מידה מלא, וכי ליחידת התצוגה של תא העומס יש יציאת RS 2 32 כדי לאפשר איסוף נתונים במחשב. על מנת לשתק את הדגימות בתוך הבארות של צלחת 24 בארות, הכינו תבנית לג'ל ארוס בעובי 1.5 מילימטר באמצעות מערכת יציקת ג'ל עם מרווחים של 1.5 מילימטר. לאחר ההרכבה, יוצקים תמיסה של 4% בין שתי צלחות הזכוכית ומניחים לתערובת להתקרר.

לאחר מכן הסר את הצלחת העליונה ואגרוף דיסק בקוטר 16 מילימטר מלוח האגרו. עבור כל דגימה טובה בכל דיסק, נקב חור להכנסת הדגימה לתוכו. הניחו את הדיסקים שהושלמו בבארות של צלחת 24 בארות.

לאחר מכן לחץ על מבני רקמה בעובי 2.25 מילימטר ובקוטר חמישה מילימטר לכל אחד ממחזיקי הג'ל. הדגימה צריכה לבלוט מהחלק העליון של כל מחזיק אירוס. לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר מדיום תרבות לכל באר והחלף את הכיסוי.

לאחר מכן החזירו את הצלחת לחממה עד שיגיע הזמן לטעינת הדגימה. כדי להתחיל בהעמסה מכנית של מבני רקמות, אבטח את לוחית האלומיניום לתא העומס והצמד מכלול פלטין סטרילי לבמה האנכית בכל עת. יש להפעיל את החממה בתנאי לחות נמוכים כדי למנוע כשל במכשיר.

לאחר מכן, הפעל את בקר מנוע הצעד ואת המחשב. פתח את תוכנית המשתמש של טכנולוגיית המיקום המתקדמת ועבור ללשונית הבקרה הגרפית בשני המסכים. לחץ על כפתור האפס הביתי כדי לשלוח את שני מנועי הצעד למצב האפס, המוגדר כמיקום העליון והימני ביותר.

הכן את הדגימות לטעינה על ידי הוצאת מעט מדיה מכל באר כדי למנוע הצפה במהלך העמסה מכנית. לאחר מכן, הניחו את צלחת 24 הבארות לתוך הביוריאקטור ויישרו בזהירות את הצלחת עם הפלטין באמצעות ארבעה מאתרים קינמטיים מתכווננים, הקפידו ליישר את הצלחת. שטוף עם החלק הקדמי של בסיס הביוריאקטור בלשונית הבקרה הגרפית.

בסדר ידני. כוונן את היישור על ידי לחיצה על תיבת המיקום כדי להזיז אותו אופקית. כאשר הצלחת מיושרת עם בארות הצלחת, התחל להוריד את הצלחת עד שהיא יוצרת מגע ראשון עם הדגימות.

לאחר הגעה לעמדת ההתחלה, עבור ללשונית רצף המהלכים וטען את רצף המהלך הרצוי על ידי לחיצה על טען או צור תוכנית משלך כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה לסרטון זה. לאחר מכן, לחץ על הפעל כדי להתחיל את התוכנית. התוכנה תכוון את המנועים להחיל את משטר המיזוג הרצוי על הדגימות.

בסיום התוכנית, הרם ידנית את הצלחת כך שתנקה את החלק העליון של צלחת תרבית הרקמות. לאחר מכן הסר את לוחית 24 הגלגלים מהביו-ריאקטור והחלף את המדיה. לבסוף, הסר בזהירות את הפלטינה מתא העומס ולאחר מכן כבה את המכשירים.

לשימוש בביו-ריאקטור הדו-צירי המתואר בסרטון זה הייתה השפעה משמעותית על כמות הגליקוזאמינוגליקנים והקולגן המופרשים על ידי תאים בתוך מבנים מהונדסי רקמות. ההתניה התרחשה חמישה ימים בשבוע במשך שלוש שעות ביום עם מאמץ דחיסה של 10% ומתח גזירה של 5% בהרץ אחד. לאחר 30 יום בתרבית, כמות הגליקו אמין, גליקנים וקולגן המופרשים על ידי כונדרוציטים שנחשפו אליהם בהעמסה, הייתה גבוהה משמעותית מדגימות הביקורת.

בנוסף, עומס דו-צירי יצר מבנים עבים יותר, אך לא הראה השפעה על גמישות המבנים. באמצעות קריאת פרוטוקול מינון זו, לאחר 30 יום של התניה ותרבות, חתכים רוחביים של מבני הרקמה הוכתמו בסמנים אופייניים של סחוס, כולל זעפרן כחול וקולגן מסוג o וסוג שני. שלוש הקבוצות השונות כוללות ללא התניה, עומס חד-צירי וטעינה דו-צירית.

בעוד שכל הקבוצות מראות צביעה חיובית עבור אליום כחול וזעפרן ו-O, הדגימות הטעונות בביקסי מראות כמויות מוגברות של קולגן מסוג 2 בהשוואה לדגימות ללא עומס וטעונות חד-צירית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל עומסים חד ציריים או דו-ציריים על פיתוח מבנים מהונדסי רקמות.