דגם orthotopic bioluminescent של התקדמות סרטן הלבלב

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין מודל עכבר אורתוטופי של סרטן הלבלב המשתמש בהדמיית ביולומינסנציה in vivo כדי לנטר באופן לא פולשני את התפתחות הגידול. זה מושג על ידי החייאה ראשונה של השעיית תאי סרטן מתויגים לוציפראז במטריג'ל. השלב השני הוא ביצוע לפרוטומיה לפתיחת חלל הבטן ואיתור ואבטחת הלבלב.

לאחר מכן, מוזרק תרחיף של תאי גידול במטריג'ל ללבלב. השלב האחרון הוא החלפת הלבלב ושימוש בתפרים לסגירת חלל הבטן. בסופו של דבר, הדמיית ביולומינסנציה משמשת לניטור התקדמות הגידול ומעקב אחר התגובה להתערבויות טיפוליות.

היתרון העיקרי של מודל זה על פני בדיקות תאים מבוססות מבחנה או מודלים תת עוריים של סרטן הלבלב הוא שהוא באמת מאפשר לנו לחקור את האינטראקציות בין תאי גידול הלבלב למיקרו-סביבת הלבלב. הקינטיקה של התקדמות המחלה במודל זה ניתנת לשחזור ומתרחשת במסגרת זמן קצרה, מה שהופך את המודל הזה לשימושי לבחינת טיפולים חדשים בסרטן הלבלב, מה שבאמת הדגמה של מודל זה היא קריטית. מכיוון שיש לבצע הזרקת תאי גידול בזהירות כדי למנוע דליפה כדי להתחיל בתרבית הליך זה.

תאי סרטן הלבלב שהומרו כדי לבטא לוציפראז כמתואר בפרוטוקול הכתוב עד שהם מתכנסים 70%, ואז קוצרים את התאים עם 0.05% טריפסין EDTA, וסופרים אותם באמצעות ציטומטר המו, מוודאים שהכדאיות גדולה מ-90%לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה עדינה פי 200 מכוח הכבידה למשך חמש דקות לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את תאי סרטן הלבלב ב-20 מיליון תאים למיליליטר. בתערובת של שלושה-שניים של מטריג'ל ו-PBS צונן, מניחים את התערובת על קרח. לאחר מכן שימוש במזרק אינסולין 0.3 מיליליטר 29

משוך את תרחיף תאי המטריגל המוכן לתוך המזרק. כדי להתחיל בהליך זה, יש להרדים את העכבר באמצעות שניים עד 3% איזופלורן בשאיפה. לאחר דקה עד שתיים, בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטה עדינה של הבוהן של העכבר כדי לבדוק אם אין רפלקס דוושה.

לאחר מכן, יש למרוח מספיק חומר סיכה על כל עין על מנת למנוע התייבשות במהלך הניתוח. לאחר מכן מקם את העכבר על גבו על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס, וסובב בעדינות את העכבר כדי להרים את הצד השמאלי של הבטן. לאחר הכוונה נכונה, הכינו את בטן העכבר לניתוח.

בעזרת מכשירים כירורגיים סטריליים, בצע חתך של 1.5 ס"מ דרך העור כשני מילימטרים שמאלה לרוחב מקו האמצע. לאחר מכן בצע חתך של 1.5 סנטימטר בשריר הבטן הבסיסי. לאחר מכן, אתר את הטחול באמצעות מלקחיים סטריליים והסר אותו בעדינות לחלל הבטן.

אבטח את הטחול לאורך צמר גפן סטרילי כדי לחשוף את הלבלב שמתחתיו. ואז אתר את זנב הלבלב הסמוך לרסוס הטחול. השעו את תרחיף תאי המטריגל והזריקו 20 מיקרוליטר לזנב הלבלב לאחר ההזרקה.

החזיקו את המזרק במקומו למשך 30 עד 60 שניות עד שהמטריג'ל הספיק להתמצק, שלב חשוב זה ממזער את דליפת התאים. לאחר הסרת המחט, בדוק את מקום ההזרקה כדי לוודא שלא התרחשה דליפה. ואז החזירו את הטחול והלבלב לחלל הבטן.

סגור את שרירי הבטן של העכבר עם תפר קלוע נספג עם מחט עגולה באמצעות תפר רציף. לאחר מכן, סגור את העור החיצוני עם מונופילמנט שאינו נספג. שישה תפרים עם מחט חיתוך באמצעות תפר רציף ומורחים בטאדין.

לאחר מכן הוציאו את העכבר מחומר ההרדמה בשאיפה והזריקו בין 0.05 ל-0.1 מיליגרם לק"ג בופרנורפין תת עורי. כמשכך כאבים לאחר הניתוח, אפשר לעכבר להתאושש בכלוב שלו, מונח על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס עם גישה חופשית למזון ומים. המשך לעקוב מקרוב אחר העכבר בימים הראשונים לאחר הניתוח.

אם העכבר מפגין סימני כאב כגון גיבנת או ניידות מופחתת, ניתן לתת בופרנורפין תת עורי כל 12 שעות במשך תקופה של 36 שעות. לאחר שאתר הניתוח נרפא תוך שבעה עד 10 ימים, יש להרדים את העכבר ולהסיר את התפרים החיצוניים. להתחיל במעקב ביולוגי של תאי סרטן הלבלב.

הרדמו את העכבר שוב באמצעות 2 עד 3% איזוף פלואור בשאיפה והניחו חומר סיכה על העיניים כדי למנוע התייבשות ומוות. לאחר ההרדמה, הזריקו 150 מיליגרם לק"ג לוציפר באמצעות הזרקת וריד הזנב והמתינו דקה עד שתיים ללוציפר לעשות את דרכו לתאים. הנח את העכבר על צדו הימני במערכת ההדמיה הביולוגית כך שהגידול יצביע לכיוון המצלמה.

כאן אנו משתמשים במערכת הדמיה של Illumina two. לאחר מכן צלם תמונות אור לבן וביו-לומינסנציה באמצעות תוכנת ההדמיה כפי שתואר קודם לכן במאמרים אחרים של JOV. לאחר השלמת ההדמיה, הסר את העכבר מחומר ההרדמה הנשאף ואפשר לו להתאושש בכלוב הביתי שלו.

חזור על שלבים אלה לאורך כל צמיחת הגידול על מנת לחקור את צמיחת הגידול. קינטיקה. השימוש בקווי תאים מתויגים בלוציפראז מספק דרך ייחודית למדוד את צמיחת הגידול. באופן לא פולשני. מוצג כאן עכבר 10 ימים לאחר ההזרקה עם גידול קטן יחסית, 31 ימים לאחר ההזרקה שבו הגידול גדל וחמישה ימים לאחר כריתת הגידול.

הביולומינסנציה הנראית בתמונה זו מראה הישנות של גידול הלבלב חמישה ימים לאחר הכריתה, כמו גם גרורות לכבד הסמוך. הגרף המוצג כאן מראה שיעורי גדילה דומים לשיטת הזרקת תאי מטריג'ל. המתואר בסרטון זה השווה שיטה אחרת שבה מושתלים חתיכות גידול בלבלב נוחתות.

ניתן לראות קינטיקה דומה של צמיחה הן עבור הפאן והן עבור הקאפין. קווי תאים לאחר הקרבה, צביעת H ו-d בוצעו כדי להראות את האופי הפולשני של תאי סרטן הלבלב לרקמת הלבלב שמסביב המוצגת כאן המסומנת על ידי הכוכבים הצהובים וכן גרורות באיברים אחרים, כולל הכבד המוצג כאן. לאחר שליטה, ניתן לבצע שיטות אלה תוך כ -10 דקות.

בנוסף, הדמיה ביו-סנט של התקדמות מחלה גרורתית וחוזרת הופכת את המודל הזה לרלוונטי מבחינה קלינית מכיוון שכיום רוב הטיפולים בסרטן הם פליאטיביים.