לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא ללכוד את היווצרותם של שלושה פגוזומים אוטומטיים חיוביים בשילוב עם מיקרוזומים וליזוזומים. זה מושג על ידי שימוש בתאי HEC 2 9 3 T שביטאו ביציבות GFPD FCP אחד סמן A עבור אזורי אומגה ומעבר אותם עם Ccfp lc שלוש אחד וסימון הליזוזומים עם גשש ליו אדום. השלב השני הוא הכנת תא הדגירה.

לאחר מכן, תא הדגירה ממוקם על במת המיקרוסקופ והמדיום העשיר מוחלף במדיום רעב כדי לגרום לתגובת האוטופגיה. השלב האחרון הוא בחירת התאים המתאימים והגדרת הפרמטרים של מיקרוסקופיית הווידאו. בסופו של דבר, הדמיית תאים חיים משמשת כדי להראות ששלושת הפאגוזומים החיוביים של lc מקורם באזורי האומגה החיוביים של DFCP, ובסופו של דבר הם מתמזגים עם הליזוזומים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הדמיית תאים קבועים, הוא שאנו יכולים לעקוב בקפידה אחר התקדמות האירועים באותם תאים לאורך זמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכישלון ה-PHA, כגון הגורם לאירועים שהובילו להיווצרות המיקוד. מחקר זה משתמש בקו תאי HEC 2 9 3 T המבטא ביציבות סמן GFPD FCP one A עבור אזורי אומגה, שהם מבנים קודמים המובילים להיווצרות אוטופאגוזום 48 שעות לפני הדמיית תאים חיים.

ראה מספר מעבר נמוך של התאים על החלקות כיסוי עגולות של 22 מילימטר בתרבית DMEM בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני לשטף של 30 עד 40% למחרת. הכין את תערובת קומפלקס הטרנספקציה לכל צלחת המכילה אופטימום אחד, מופחת סרום בינוני קיצוני G תשע DNA, מגיב טרנספקציה ו- P-E-C-F-P lc שלוש פלזמה DNA lc. שלוש הוא החלבון המעניין שתרומתו להיווצרות אוטופאגוזומים תנותח בניסוי זה כשהוא מעורבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ולאחר מכן דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שאפו את המדיום מצלחות התאים והוסיפו DMEM טרי חם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. הוסף את קומפלקס הטרנספקציה לתאים ודגר תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר מכן, התאים צריכים להיות 80% קונפלואנטים ומוכנים להדמיית תאים חיים אם משתמשים בסמן אברונים.

בניסוי, הסר אליקוט של שני מיליליטר של גשש מיטו או גשש ליו שהוכן בעבר המכיל מדיום וחמם אותו ל -37 מעלות צלזיוס. בניסוי זה, גשש Lyo אדום ישמש לסימון תווך השאיבה של הליזוזומים מתאים שעברו טרנספטציה. החלף בגשש lyo המכיל תאים בינוניים ודגירה למשך 30 עד 60 דקות.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לנקות טבעות O ממתכת ופלסטיק עם 75% אתנול ולמרוח גריז סיליקון על שפת טבעת ה-O המתכתית. בעזרת מלקחיים, הסר את החלקת הכיסוי מהצלחת וייבש את המדיום העודף מהצד התחתון של החלקת הכיסוי. זאת כדי להימנע מערבוב יותר מדי מדיום עם השומן, מה שיגדיל את הסבירות לדליפה.

השאירו את פתק הכיסוי לנוח על אדן טבעת ה-O מפלסטיק והתאימו את טבעת ה-O המתכתית על גבי טבעת ה-O מפלסטיק כשפתק הכיסוי דחוק ביניהם. על מנת ליצור תא סגור, מלאו את החדר במדיום מהצלחת מנקודה זו ואילך, הימנעו מדגירה ממושכת של התאים במדיום DMEA ללא חומר חציצה כדי למנוע שינויים ב-pH. לאחר מכן, הניחו את תא הדגירה על במת המיקרוסקופ כדי להרעיב את התאים ולגרום לתגובת האוטופגיה.

שאפו את המדיום השלם ושטפו פעמיים עם שני מיליליטר של מדיום רעב. לאחר הכביסה השנייה, הוסף שני מיליליטר של מדיום רעב טרי והגדר את הטיימר על מערכת הדמיה מתאימה המוגדרת עבור פלואורסצנציה אפית בשדה רחב של תאים חיים נדרשת לניסוי זה. מערכת זו תכלול בדרך כלל מסגרת מיקרוסקופ הפוכה בדרגת מחקר, מראות מקור אור רחב ספקטרום אינטנסיבי ומסננים ספציפיים לחלבונים או צבעים פלואורסצנטיים מעניינים, עדשה אובייקטיבית באיכות גבוהה, מצלמת C-C-D-S-C-M-O-S רגישה ותא דגירה.

הגורם החשוב ביותר הוא שימוש במערכת בעלת רגישות גבוהה כך שניתן יהיה לשמור על רמות הביטוי של המדווחים הפלואורסצנטיים למינימום מבחינת בחירת תאים מתאימים להדמיית תאים גדולים ושטוחים שיאפשרו ללכוד יותר אירועי היווצרות אוטופאגוזומים. בנוסף, בחר תאים שכבר החלו לייצר מספר גדול יותר של אזורי אומגה. השתמש בעדשת הגדלה גבוהה כדי למנוע הלבנת אור, התאם את עוצמת אור העירור ל-10 עד 20% מהמקסימום.

הגדר את המצלמה לחשיפה של 100 עד 500 אלפיות השנייה, שתיים על שתיים סיבוב ורווח של 100. הגדר את קצב רכישת התמונה למסגרת אחת כל 10 שניות. התחל את צילום הווידאו לאחר 30 דקות או הרבה לתוך תגובת האוטופגיה על מנת ללכוד יחס גדול יותר של אירועי היווצרות אוטופאגוזומים לסרטון.

במחקר זה, תאים המבטאים G-F-P-D-F-C-P אחד ו-CCF PLC 3 הורעבו במשך 30 דקות ולאחר מכן צולמו בקצב של פריים אחד כל 10 שניות. סרטון זה מציג אירוע היווצרות אוטופאגוזום. קצב ההשמעה הוא ארבע פריימים לשנייה.

מונטאז' של אירוע היווצרות האוטופאגוזום המייצג שצולם בסרטון מוצג באיור זה אותות מהערוץ הירוק המציין DFCP אחד הם פסאודו בצבע ירוק ואותות מהערוץ הכחול המציינים lc 3 הם פסאודו בצבע אדום. היווצרות אזור אומגה מתגלה מהמסגרת השנייה בצורה של נקודה קטנה המסומנת על ידי החץ. אזור האומגה מתחיל להתרחב על מנת ליצור את המבנה דמוי הטבעת האופייני ומגיע לקוטר המקסימלי שלו לאחר כשש דקות.

לאחר מכן, אזור האומגה מתחיל לקרוס ובסופו של דבר נעלם לאחר כ-10 דקות. כאשר היווצרות המבנה החיובי lc 3 או האוטופאגוזום ממוקמת בהקשר של היווצרות אזור האומגה, נצפה כי האוטופאגוזום מופיע לאחר אזור האומגה והופך לגלוי בבירור. לאחר כדקה וחצי, האוטופאגוזום מתחיל להתרחב בקשר הדוק עם אזור האומגה ואז מצלצל כאשר אזור האומגה מתחיל לקרוס, האוטופאגוזום מתפרץ.

בסופו של דבר, האוטופאגוזום נשאר מאחור ככל הנראה כדי להתמזג עם הליזוזומים לאחר שאזור האומגה נעלם. בסרטון הבא נוסף גשש ליזוזום המסומן בכחול על מנת ללכוד את האסוציאציה הזמנית והמרחבית של האוטופאגוזום הנוצר. עם ליזוזומים, קצב ההשמעה הוא ארבע פריימים לשנייה.

החץ מציין תחילה את היווצרות אזור האומגה ושנית, את היתוך האוטופאגוזום עם הליזוזום. איור זה הוא מונטאז' של האירועים שצולמו בסרטון כפי שמצוין על ידי ראש החץ. כמה דקות לאחר קריסת אזור האומגה, האוטופאגוזום המתהווה מתחיל להתחבר לליזוזומים ובסופו של דבר הוא מתמזג עם היתוך ליזוזום אחד של האוטופאגוזום עם הליזוזום, מרווה במידה רבה את הקרינה CFPL C3, ככל הנראה עקב חשיפת תג ה-CFP לסביבה החומצית של הליזוזום.

עם זאת, אותו סוג של ניתוח יכול לפעמים להפיק תוצאות בלתי ניתנות לפירוש ממגוון סיבות. בדוגמה זו, התוצאות הופכות לבלתי ניתנות לפירוש עקב סחף במיקוד. ניתוח התמונות מראה כי היווצרות אוטופאגוזום נלכדת בהצלחה על ידי וידאו בהתחלה.

עם זאת, סחף בפוקוס מתרחש לאחר שלוש הדקות. צילום הווידיאו ממשיך לצאת מהמיקוד במשך שש הדקות הבאות, אך בסופו של דבר המיקוד מתוקן ידנית לאחר תשע עד עשר דקות. לרוע המזל, ניתוח זה אינו מאפשר להבחין אם אירוע היווצרות האוטופאגוזום שנלכד כאשר המיקוד מתוקן הוא האירוע הראשוני שכמעט הושלם, או אירוע חדש שהתחיל לאחר הסחיפה במוקד.

כדי למנוע סחיפה במיקוד, יש לעקוב כל הזמן אחר הסרטון ולבצע תיקונים לפי הצורך, באופן ידני או באמצעות תכונת המיקוד האוטומטי של המיקרוסקופ אם זמינה. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך לא יותר משעה אחת לסרטון סרט אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר מיקרוסקופ ליישומי הדמיית תאים חיים, כולל מעקב אחר היווצרות אוטופאגוזום עם מיקרוזומים וליזוזומים.