Name: חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-26T21:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: למד שיטה לסימון קולגן בפלורסצנציה לצפייה בתרביות תאים תלת-ממדיות. חקור את המורפולוגיה של תאי סרטן ואת האינטראקציות שלהם עם המטריצה החוץ-תאית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים תודה להכיר ד&quot;ר סילי Gurchenkov (מכון קירי) לרכישה ועיבוד תמונה באיור 3 ומתקן ההדמיה PICT-IBISA (מכון קירי). עבודה זו נתמכה על ידי ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 וPIC 3D - קומפלקס בדגמים סלולריים חוץ גופית.

1. טמרה-קולגן אני תיוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טמרה מ&quot;ל 10 מ&quot;ג / 2.5 מ&quot;ל על ידי הוספת DMSO ל25 מ&quot;ג האבקה סיפקה טמרה. לפזר אותו על ידי vortexing עד לפירוק מוחלט. חנות ב -20 מעלות צלזיוס, ולהגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 ליטר של הצפת תיוג (0.25 מ &#39;3 NaHCO, 0.4 מ&#39; NaCl). כדי להתאים את pH 9.5 באמצעות פתרון M 10 של NaOH. לשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות ב4 º C, אלא אם כן חומר האמור וניאון אחרת הוא מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק חד פעמי 1 מ&quot;ל עם 1 מ&quot;ל של קולגן עכברוש זנב המרוכז מאוד פתרון. פתרונות קולגן ריכוז גבוהים ניתנים בדרך כלל בריכוזים סביב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​והם מאוד צמיג. הקפד לתפעל אותו לאט, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 21 G מזרק, להזריק קולגן לקלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה של 10,000 MWCO נותק. השתמש בזהירות כדי להימנע מDamaגינג הקרום עם המחט. הסר את כל האוויר מקלטת הדיאליזה על ידי משיכת הבוכנה המזרק. Dialyze אותו הלילה נגד 1 ליטר של הצפת תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 μl של פתרון טמרה מ&quot;ל 10 מ&quot;ג / 900 עם μl של הצפת תיוג. הערה: זה צריך להיעשות עם שני פתרון טמרה והצפת תיוג בטמפרטורת חדר מאז DMSO קופא על 4 מעלות צלסיוס לאחר ערבוב, להביא את פתרון טמרה המדולל בחזרה עד 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את קולגן מקלטת הדיאליזה באמצעות מזרק חד פעמי 2 מ&quot;ל עם מחט 21 G מזרק. מערבבים 1 מ&quot;ל של פתרון קולגן dialyzed עם 1 מ&quot;ל של תמיסה מדוללת טמרה ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר קולגן / תמהיל טמרה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל ו דגירה לילה עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 2 מ&quot;ל של קולגן טמרה שכותרתו לתוך קלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה וdialyze הלילה נגד 1 ליטר של תיוג הצפת כדי להסיר את העודפים של צבע ללא תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחזר במעבדת טמרהקולגן eLED לפתרון המקורי קולגן, הצב את קלטת הדיאליזה לתוך 1 ליטר של 0.2% (V / V) פתרון חומצה אצטית, pH 4, וdialyze בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הנפח הסופי של קולגן טמרה שכותרתו ולחשב הריכוז הסופי שלו, בהתחשב בהיקף הראשוני והריכוז של פתרון קולגן בשימוש. חנות ב 4 המעלות צלסיוס </li></ol> 2. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם תאים בודדים משובצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הנפח של 2-Mix טמרה קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PBS 10x ו1 N NaOH בכמויות מתאימות כדי להשיג את הריכוז הרצוי וקולגן pH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;למיקס של טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x עם 5 μl של 1N NaOH. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרת מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​3.68 ו415.71 μl של 4.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של קולגן ללא תווית. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תאים תלויים בנפח המתאים של מדיום סלולרי צונן ללא FBS לתערובת טמרה-קולגן כדי להשיג צפיפות תאים סופית של 10 5 תאים / מ&quot;ל וריכוז קולגן סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 388.81 μl של מדיה המכיל 10 5 תאים. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל במבחן ה-pH שלטיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו לפלמר בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ&quot;מ והם 2 מ&quot;מ. כאשר polymerized, קולגן הופך לג&#39;ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות קולגן / תא. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק. שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO 2 למשך מספיק זמן לתאים לנדוד במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים). </li></ol> 3. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם spheroids הסלולרי משובץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הנפח של 2 מ&quot;ג / מיליליטר טמרה-M קולגןIX ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PBS 10x, 1 N NaOH ותקשורת סלולרי ללא FBS בכמויות מתאימות כדי להשיג את ריכוז קולגן הרצוי וpH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של מיקס טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x, 5 μl של 1 N NaOH ו388.81 μl של תקשורת. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרתו 3.68 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו 415.71 μl של 4.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של unlaקולגן beled. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל על רצועת בדיקת חומציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו ליזום פילמור במשך 2-5 דקות. זה יעזור כדי למנוע טביעתה של spheroids ידי מעט מגביר את צמיגות הג&#39;ל. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ&quot;מ והם 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף אליפטית תא ולמקם אותו על צלחת פטרי נקי. הסר את כל עודף של נוזל וresuspend זה ב10 μl של מיקס טמרה-קולגן. זה חשוב כדי למנוע דילול של קולגן עם תקשורת סלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P20, לאסוף קולגן המושעה אליפטית ולמקם אותו בחלק העליון של מרכז ירידת מיקס טמרה-קולגן μl 100. הערה: אין יותר ממקום אחד לכל טיפת אליפטית קולגן, כיוון שהם יכולים להשפיע על כל קיבולת אחרת לפלוש ו / או להעביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מיקס טמרה-קולגן לפוליmerize בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. כאשר polymerized, קולגן הופך לג&#39;ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות spheroids קולגן /. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO 2 למשך מספיק זמן לתאים לפלוש / להעביר במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים). </li></ol> 4. מכתים immunofluorescence 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את התקשורת הסלולרי ולשטוף את מטריצות קולגן המכילות תאים / spheroids עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל לתקן ולחלץ תאים על ידי דוגרים עם חיץ חילוץ / קיבעון (PFA 4%,, סוכרוז 0.3% טריטון X-100 של 5% בPBS) למשך 5 דקות. להשלים עם חיץ Phalloidin מיקרומטר 2 ו 2 מיקרומטר טקסול להדמיה של שלד תא או חלבונים הקשורים cytoskeleton. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לתקן את התאים עם PFA 4%, 5% סוכרוז ב-PBS למשך 30 דקות. לשטוף עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות נוגדנים עיקריים להכין PBS. דגירה תאים עם נוגדנים ראשוניים במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 המעלות צלסיוס הקפד להוסיף מספיק פתרון כדי לכסות את ירידת קולגן כולו. לצלחת תחתית זכוכית 35 מ&quot;מ, 1.5-2 מ&quot;ל של תמיסה יהיה צורך בכך. הערה: כדי להפחית את עוצמת הקול של פתרון נוגדן, מכשול בלתי מסיס מים, כגון קו מעגל גריז סיליקון או טבעת PDMS, ניתן להציב סביב ירידת קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 30 דקות 3x עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את נוגדנים משני אלקסה-מצומדות, phalloidin אלקסה מצומדות ופתרונות DAPI PBS. דגירה תאים עם הנוגדנים משני המתאימים עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x 30 דקות עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר עודפים של נוזל, להוסיף מספיק הרכבה תקשורת כדי למלא את תחתית צלחת תחתית הזכוכית (μl כ 500) ומניח על גבי coverslip 24 מ&quot;מ כדי לאטום. אל תלחץ כלפי מטה את coverslip כדי למנוע דחיסת טיפת קולגן ופגיעה בארגון 3D. </li></ol> 5. הדמיה לדוגמה ניתן להשתמש במיקרוסקופי confocal דיסק קלאסי או ספינינג. מעדיף מערכת הפוכה יש להשתמש כדי לקבוע את המרחק של התאים צלמו מתחתית הכוס. המערכת המשמשת לעבודה זו היא דיסק מסתובב confocal הפוכה מצויד במטרות נפט הטבילה 60X/1.4NA (עובד מרחקים 200 מיקרומטר ו130 מיקרומטר, בהתאמה) ו40X/1.3NA, מצלמה Photometrics CoolSNAP HQ2, 1392 x 1040 מערך הדמיה, 6.45 6.45 x מיקרומטר פיקסלים ונשלט על ידי תוכנת ההדמיה Metamorph. 405 ננומטר, 491 ננומטר, 561 ננומטר, ו633 ננומטר לייזרים משמשים בדרך כלל 30-50% בצריכת החשמל, ולקבל 1 binning של 2X 2 כדי להפחית את זמני חשיפה. מיקרוסקופ מצויד גם עם מנורה כספית וקוביות לסנן DAPI (400-418 ננומטר EXC; em 450-465), FITC (exc 478-495; 510-555) וטקסס אדומה (exc 560-580; 600 -650) להשתמש בעינית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מנורת הניאון, הצב את מטרת 40X באמצע טיפת קולגן. קבל סקירה כללית של המדגם, הן בציר XY וציר z. הקפד לא לסטות יותר מ -100 מיקרומטר מקצה ג&#39;ל על ציר XY בעת רכישה את התמונות, כדי למנוע השפעות קצה. כאשר spheroids הדמיה, לוודא שהם מתחת למרחק העבודה האובייקטיבי. שינוי אובייקטיבי אם מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב ההדמיה לחיות confocal. על ידי שימוש בלייזר ננומטר 561 לדמיין קולגן טמרה שכותרתו, החל מתחתית הכוס לקבוע את ערך Z שבו סיבי קולגן להתחיל להופיע. זהו המצע התחתון וZ = 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות כפתור הפוקוס, ללכת עד 100 מיקרומטר מZ = 0. תאים רק ב z = 100 מיקרומטראו לעיל צריך להיות צילמו כדי למנוע תופעות מתח מתחתית הזכוכית הנוקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים לתמונה. לייעל את זמני חשיפת מצלמה וכוח לייזר לכל אורך גל. זמני חשיפה אופייניים עבור DAPI וAlexa-488 Phalloidin הם בין 100-200 אלפיות שני. זמני חשיפה למכתים נוגדן עשויים להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חי confocal באמצעות לייזר המתאים כדי להמחיש את phalloidin מכתים ובאמצעות כפתור הפוקוס, להגדיר את מרווח סדרת Z על ידי קביעת ערכי z עליונים ותחתונים לנוכחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל Z-הצעד. למטרות 40X, השתמש 1 מיקרומטר. ל60x, השתמש 0.5 מיקרומטר. התחל רכישה. </li></ol>

<ol><li>Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha+2+beta+1+%28VLA-2%29+mediates+reorganization+and+contraction+of+collagen+matrices+by+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells.</a> Cell. 67 (2), 403-410 (1991).</li>
<li>Klein, C. E., Dressel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha+2+beta+1+is+upregulated+in+fibroblasts+and+highly+aggressive+melanoma+cells+in+three-dimensional+collagen+lattices+and+mediates+the+reorganization+of+collagen+I+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils.</a> J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).</li>
<li>Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+highly+aggressive+MV3+melanoma+cells+in+3-dimensional+collagen+lattices+results+in+local+matrix+reorganization+and+shedding+of+alpha2+and+beta1+integrins+and+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44.</a> Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).</li>
<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Fraley, S. I., Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Harunaga, J. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesions+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesions in 3D.</a> Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).</li>
<li>Raub, C. B., Suresh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+assessment+of+collagen+gel+microstructure+and+mechanics+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy.</a> Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).</li>
<li>Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?</a> Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).</li>
<li>Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+growth-cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering.</a> J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li>
<li>Haji-Karim, M., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+viability+in+cellular+spheroids+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin.</a> Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).</li>
<li>Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+in+collagen+and+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cross-linking in collagen and elastin.</a> Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).</li>
<li>Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+handy+assay+for+collagenase+using+reconstituted+fluorescein-labeled+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils.</a> Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).</li>
<li>Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+extracting+the+network+geometry+of+three-dimensional+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels.</a> J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).</li>
<li>Sabeh, F., Ota, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+traffic+through+the+extracellular+matrix+is+controlled+by+the+membrane-anchored+collagenase+MT1-MMP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP.</a> J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).</li>
<li>Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blind+spot+in+confocal+reflection+microscopy%3A+the+dependence+of+fiber+brightness+on+fiber+orientation+in+imaging+biopolymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks.</a> Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).</li>
<li>Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecular+structure+to+tissue+architecture%3A+collagen+organization+probed+by+SHG+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy.</a> J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול מתואר כאן לתייג קולגן fluorescently אני משתמש בטמרה מספקת שיטה מצוינת כדי לאפשר הדמיה קלה של ארגון רשת קולגן, באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי מצוידים בליזר ננומטר 561. יתרון של שיטה זו בהשוואה למיקרוסקופיה confocal ההחזרה הוא יכולת סיבי קולגן תמונה עמוקות יותר לתוך מטריצת 3D. העצמה והחדות של השתקפות הסיבים מפחיתים באופן משמעותי עם עומק בשל ספיגת אור לייזר ופיזור. כמו כן, הכיוון של סיבי קולגן יכול להיות מכשול עיקרי בעת שימוש במיקרוסקופיה confocal החזרה, שכן סיבים מיושר...

התחום של נדידת תאים כבר braving אל עולם הממד השלישי החדש. זה אינטואיטיבי ללמוד נדידת תאים בסביבה הדומה ביותר הפיזיולוגי אחת, ולכן, תלת ממדי (3D). עם זאת, בשל מגבלות טכניות, מחקרי נדידת התאים ביותר נעשו ניתוח תנועת תא על פני מצעים דו ממד (2D) נוקשים, או ללא טיפול או מצופה עם מטריקס (ECM) חלבונים תאיים מתאימים. המחקרים הראשונים המוקדשים לנדידת תאים בשלושה סריגי קולגן ממדיים לחזור מעל 20 שנים 1-3. עם זאת, רק ב -5 השנים האחרונות זה הפך להיות ברור כי תאים נודדים באופן מהותי יכולים שיהיו שונים במורפולוגיה ובמצב של הגירה בהתאם ממדי של המצע שלהם. ב 2D, תאים פנו מצע עם פני השטח הגחון שלהם באמצעות הידבקויות מוקד בלבד, וכתוצאה מכך היווצרות של בליטות שטוחות רחבות (lamellipodia) עםבליטות דמויות אצבע מוטבעות (filopodia) בקצה המוביל שלהם. מבנים אלה, יחד עם סיבי מתח המחברים את התא הקדמי לקצה הנגרר, הם האמינו להיות מכריע עבור תנועת תא ב2D. במטריצות 3D, תאים הם בדרך כלל מוארכים יותר, עם תא השטח כולו יצירת קשר עם ECM, גורמים לשינויים ניכרים במבנה ואת הרלוונטיות של פעילות של רבים ממבנים אלה. לעומת זאת, תכונות סלולריות אחרות להשיג רלוונטיות בהגירת 3D, כגון עיוות גרעינית ומבנים מעורבים בECM שיפוץ 4. למרות שינויים אלה ידועים מורפולוגיים, כמו גם הבדלים במצבי הגירת 5-7, אשר יכול להשתנות בהתאם לECM וסוגי תאים, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין יוצא דופן. עבודה עם מטריצות 3D עבות וצפופות נושא קשיים טכניים, כגון הדמיה מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, וחוסר תאימות עם מרבית staפרוטוקולי ndard מותאמים לתרבויות 2D, כמו תיוג immunofluorescent של חלבונים אנדוגניים. כמו כן, משום שהשימוש במטריצות 3D הוא גישה חדשה יחסית, חוקרים עדיין בודקים את התנאים הטובים ביותר לדומים למצבים ספציפיים בvivo, כגון ארכיטקטורת סטרומה נורמלית של איברים או רקמות שונות בארגון ECM סביב גידול. הבדלים בתוצאות על ידי קבוצות שונות הנוגעות, למשל, מצבי סרטן תאים של הגירה או קיומן של הידבקויות מוקד, יצרו מחלוקת 8. הרבה מאמץ הוקדשה לאחרונה כדי להגיע להסכמה במונחים של ECM אופי כימי, גודל נקבובית, עובי סיבים, ומטריצת קשיחות. סוגים רבים ושונים של ECMS 3D משמשים כיום, שונים ממטריצות נגזרות סלולריים לmatrigel זמין מסחרי, קולגן שור pepsinized אני, או קולגן זנב החולדה nonpepsinized י כל אחד מהמטריצות האלה יש תכונות פיסיקליות וכימיות ספציפיות ואחד צריך רלהte המטריצה ​​של בחירה לתהליך הפיזיולוגי הנלמד. בנוסף, עובי וגודל נקבובית סיבים יכול להיות תלוי בתנאים פילמור, כגון pH וטמפרטורה 9,10. קשירה ולמרחק ממצעים קשיחים כגון זכוכית, ניתן גם לשנות את תכונות האלסטיות של המטריצה ​​10,11. מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. שיטות להכנת spheroids תאים סרטניים בעבר תאר, את אלה הפופולריים ביותר להיות שיטת טיפה התלויה 12,13 ושיטת צלחת agarose המצופה 14. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, קולגן זנב החולדה nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, הוא משמש ב2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. קולגן חומצת החילוץ Nonpepsinized אני מזנב חולדה שומר שני טרמינל C-N-וtelopeptides, חלקי nonhelical של מולקולת הקולגן אחראי להאם של קולגן intermoleccrosslinking תואר בלבד ויציבות fibrilar 15. יחד, בתנאים אלה יאפשר היווצרות של רשתות קולגן שדומים באופן הדוק ביותר את אלה שנצפו בvivo 10. כדי לאפשר הדמיה של סיבי קולגן, הן בתרבויות קבועות וחיים, פרוטוקול מפורט מסופק לתייג הקולגן במבחנה 10 באמצעות 5 fluorescently - (ו- 6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה), אסתר succinimidyl. פרוטוקול זה הותאם מBaici et al. 16,17, בי isothiocyanate ההעמסה משמש לתייג מולקולות מסיסים קולגן. וכהעמסה, טמרה היא צבע פלואורסצנטי אמינו-reactive שמגיב עם קבוצות nonprotonated aliphatic אמינו של חלבונים, כגון קבוצת אמינו החופשית בN-הסופית, וחשוב יותר, קבוצה אמינית הצד של lysines. תגובה זו מתרחשת רק ב-pH הבסיסי, כאשר קבוצת אמינו ליזין היא בצורת nonprotonated. בנוסף לטמרה להיות יציבה יותר מהעמסה עלזמן, ספקטרום הפליטה שלה נופל על מגוון הכתום / אדום (= 555/518 ננומטר לשעבר / EM), אשר יכול להיות משולב מועילה להדמית תא חי של חלבוני ה-GFP-מתויגים. שימוש במולקולות מסיסים קולגן שכותרתו עם צבעי אמינו תגובתי אינו משפיעה על תהליך פילמור ולא הצפיפות, הגודל נקבובית ומעמד crosslinking של מטריצת הקולגן 10,16,18,19. פרוטוקול זה כולל גם את שיטה לתיוג immunofluorescent 3D של חלבונים אנדוגניים, אשר עבר אופטימיזציה נוספת לתייג את שלד התא או חלבונים הקשורים cytoskeleton. המיקוד הסופי של פרוטוקול זה הוא על שיטות לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תרבויות 3D באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם תרומה מופחתת מcoverslips הזכוכית הנוקשים על מתח מטריצת הקולגן.

<table><tbody><tr><td>טמרה, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C-1171</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קולגן זנב חולדה בריכוז גבוה</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קולגן זנב עכברוש</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פלואידין</td><td>סיגמא</td><td>P2141</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טקסול (פקסיטל)</td><td>סיגמא</td><td>T7402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן נגד אלפא טובולין עכבר</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אלקסה 488 פלואידין</td><td>אינוויטרוגן</td><td>A12379</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 633 נוגדן נגד עכבר עיזים</td><td>Invitrogen</td><td>A21052</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מדיה גוברת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>106 226 89</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קלטת דיאליזה</td><td>פירס</td><td>66380</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כלי תחתית זכוכית</td> World <td>Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אוטומציה ומיקרוסקופיה של MetaMorph תוכנה לניתוח תמונה</td> התקנים <td></td><td>מולקולריים</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אימאריס 7.2.3</td><td>ביטפליין</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3d

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

נדידת תאים באופן מסורתי נחקרה במצעי 2D. עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר שיש צורך ללמוד את נדידת תאים בסביבות 3D מתאימות יותר, שדומים יותר טוב הממדיות של התהליכים הפיסיולוגיים בשאלה. תאים נודדים באופן משמעותי יכולים להיות שונה במורפולוגיה ובמצב של הגירה שלהם, תלוי אם הם נעים על מצעי 2D או 3D. בשל קשיים טכניים ותאימויות עם פרוטוקולים הסטנדרטיים ביותר, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין נדיר. מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, אנחנו משתמשים בקולגן זנב חולדת nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, ושכותרתו fluorescently כדי להקל הדמיה באמצעות מיקרוסקופים confocal סטנדרטיים. עבודה זו כוללת גם protocol תיוג immunofluorescent 3D של שלד תא תא אנדוגני. שימוש בפרוטוקולים אלה אנו מקווים לתרום לתיאור טוב יותר של ההרכב המולקולרי, לוקליזציה, ופונקציות של מבנים הסלולר ב-3D.

תיוג עכברוש זנב קולגן אני עם טמרה מאפשר הכנה קלה ויזואליזציה של רשתות קולגן 3D. פילמור איטי בטמפרטורת חדר בתוצאות היווצרות של רשתות קולגן עם ארגון דומה לאלה שנמצאו בvivo 10. כאן אנו מציגים פרוטוקול למכתים immunofluorescence של cytoskeleton של CT26 תאים סרטניים, והן כspheroids כתאים בודדים. כדי לשמר טוב יותר שלד התא, מאגרים הם השלימו עם phalloidin ללא תווית וטקסול, תרופות ידועות לייצב F-אקטין ו...

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את המורפולוגיה של תאי סרטן ואת האינטראקציה שלהם עם המטריקס החוץ-תאי בתרביות תלת-ממדיות; דבר זה מושג תחילה על ידי סימון קולגן מזנב חולדה, בעזרת DTRA פלואורסצנטי אדום כדי לאפשר ויזואליזציה של רשתות הקולגן התלת-ממדיות. בשלב השני, תאי סרטן הגדלו כתאים בודדים או כספרואידים רב-תאיים מוטמעים במטריקות קולגן תלת-ממדיות המסומנות ב-Tamra. לאחר מכן מאפשרים לתאים להתפשט ברחבי הקולגן במשך יום אחד עד שלושה ימים, באופן המדמה את הפלישה והנדידה של תאי סרטן אל תוך הסבסטרומה התלת-ממדית הסובבת in vivo.בשלב הבא, התאים מקובעים ונצבעים באמצעות אימונו-צביעה עם הנוגדנים המתאימים ו-Phin כדי לה可חזות את מורפולוגיית התאים ואת הלוקליזציה של החלבונים הנבדקים. בסופו של דבר, ניתן לנתח את המורפולוגיה הייחודית של תאי סרטן שגודלו בתלת-ממד ואת האינטראקציה שלהם עם המטריצה extracelluar התלת-ממדית באמצעות רכישת Z-stacks עמוקים של הדגימות במיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום נדידת התאים, בכך שהיא תורמת לתיאור טוב יותר של ההרכב המולקולרי, התפקוד והלוקליזציה של רכיבים תאיים בסביבות תלת-ממדיות שמרבית השנים נחקרו בממד שני.את הפרוצדורה הזו ידגים עבורי אנטון סמו, טכנאי במעבדה שלנו, כדי לסמן קולגן one עם תמרה. התחילו במילוי איטי של מזרק חד-פעמי של 1 ml עם 1 ml של תמיסת קולגן ריכוז גבוה מזנב חולדה, תוך הימנעות מבועות אוויר. חברו מחט היפודרמית של 21 gauge ולאחר מכן הזריקו את הקולגן לתוך קסטת דיאליזה של 3 ml שהושרה מראש, עם סף חיתוך של משקל מולקולרי של חלבון של 10,000 Dalton, תוך הקפדה לא לפגוע בממברנה עם המחט.משכו את הבוכנה לאחור כדי להוציא את כל האוויר מהקסטה, ולאחר מכן בצעו דיאליזה לקולגן למשך לילה מול ליטר אחד של תמיסת סימון. למחרת בבוקר, הוציאו בזהירות את הקולגן מקסטת הדיאליזה וערבבו מיליליטר אחד של תמיסת הקולגן שעברה דיאליזה עם מיליליטר אחד של תמיסת Tamra קרה ומהולה טרי, בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה בנפח שני מיליליטר. עטפו את המבחנה בנייר אלומיניום והדגירה למשך לילה תוך כדי סיבוב.בבוקר למחרת, העבירו את הקולגן המסומן ב-TAMRA לקסטת דיאליזה שהושרתה מראש, ובצעו דיאליזה של הקולגן למשך הלילה מול ליטר אחד של חוצב סימון כדי להסיר את עודפי הצבע. לאחר מכן, כדי לשמר את הקולגן המסומן ב-TAMRA, הניחו את קסטת הדיאליזה בתוך ליטר אחד של תמיסת חומצה אצטית בריכוז 0.2% נפח לנפח, ב-pH של 4, ובצעו דיאליזה של הקסטה למשך הלילה. שוב, בבוקר למחרת, העבירו את הקולגן המסומן ב-TAMRA מקסטת הדיאליזה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה; בעזרת מיקרו-פיפט, מדדו את הנפח הסופי של הקולגן, ולאחר מכן חשבו את הריכוז הסופי של הקולגן המסומן ב-TAMRA.בהתחשב בנפח הראשוני ובריכוז של תמיסת הקולגן שבה נעשה שימוש, יש לאחסן את ה-DY collagen בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, מוגן מאור, לצורך הטמעה של תאים בודדים. קבע את הנפח של 2 mg/mL של תערובת Tamara collagen הדרוש לניסוי, ולאחר מכן ערבב את הנפחים המתאימים של 10 XPBS ושל sodium hydroxide נורמלי אחד.לאחר מכן, ערבבו את הנפחים המתאימים של קולגן המסומן ב-Tamara ושל קולגן שאינו מסומן ביחס של אחד לשישה, כדי להגיע לריכוז קולגן סופי כולל של 2 mg/mL. כעת, השביה את התאים הרלוונטיים בנפח המתאים של מצע גידול לתאים מקורר ללא FBS, ולאחר מכן הוסיפו את התאים לתערובת הקולגן כדי להגיע לצפיפות תאים סופית של 1×10⁵ תאים ל-mL. ודאו את ה-pH על ידי בדיקת 10 µL מהתערובת על סרטבב pH, ולאחר מכן טפטפו באמצעות פיפט 100 µL מת сусפנסיית התאים בקולגן Tamara למנות של גלסיות עם תחתית זכוכית, והניחו לתערובת להתפולימר בטמפרטורת החדר עד שהקולגן יהפוך לג'ל הלבנבן, למשך כ-30 עד 45 דקות.לאחר מכן, הוסיפו בזהירות כמות מספיקה של מצע גידול כדי לכסות את טיפות התאים המוטמעים בקולגן, והשאירו את הטיפות בטמפרטורה של 37 °C ב-10% carbon dioxide למשך זמן מספיק כדי שהתאים ינדדו לאורך המטריצה. בדרך כלל נדרשים יום עד שלושה ימים עבור סטרואידים של תאים מוטמעים. טפטפו 100 µL של קולגן טרי מדולל.ערבב על גבי צלחים בעלי תחתית מזכוכית והמתן עד שהקולגן יתחיל פולימריזציה במשך שתיים עד חמש דקות כדי להעלות מעט את צמיגות הג'ל. לאחר מכן, אסוף סטרואיד של תא והנח אותו בצלח פטרי נקי. הסר כל עודף נוזלים והשהה מחדש את הסטרואיד ב-10 µL של תערובת קולגן טמרה כדי למנוע דילול של הקולגן בתוך מצע התרבית של התאים.לאחר מכן, השתמשו בפיפט P 20 כדי לאסוף את הסטרואיד התלוי בקולגן והניחו אותו במרכז החלק העליון של טיפת תערובת הקולגן TEMA בנפח 100 microliter. השארת הקולגן להתמצק למשך שתי עד חמש דקות בדרך כלל מספיקה כדי להבטיח שה-OID יהיה במרחק של יותר ממאה מיקרון הן מהחלק העליון והן מהחלק התחתון של טיפת הקולגן. אך אם הסטרואיד עדיין שוקע, נסו להפוך את הצלחת למשך כשתי דקות ולאחר מכן להחזירה למצב זקוף.אפשרו לקולגן לעבור פולימריזציה כפי שהודגם כעת, ולאחר מכן הוסיפו בזהירות כמות מספיקה של מצע גידול כדי לכסות את טיפות הקולגן עם הסטרואידים. לאחר מכן, דגרו את הטיפות כדי לאפשר לתאים לנדוד ברחבי המטריקס לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית. התחילו בהסרה זהירה של מצע התאים ובשטיפת מטריקס הקולגן המכילה סטרואידים באמצעות PBS.בשלב הבא, דגרו את התאים עם תמיפת קיבוע למיצוי. לאחר חמישה דקות נוספות, קבעו את התאים באמצעות PFA וסוכרוז ב-PBS למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים.כעת הדגרירו את התאים עם הנוגדנים הראשוניים הרלוונטיים המדוללים ב-PBS. לאחר מכן, שטפו את המטריצות שלוש פעמים למשך 30 דקות בכל פעם. לאחר השטיפה השלישית, הדגרירו את המטריצות עם הנוגדנים המשניים, Alexa conjugated Phin ו-DPI המדוללים ב-PBS.לאחר שטיפה נוספת של המטריצות, הסירו את עודפי הנוזל והוסיפו כ-500 microliters של תגמירי הרכבה (mounting media) למילוי תחתית הצלחות. כעת, אטמו כל טיפה באמצעות כיסוי זכוכית (cover slip) בקוטר 24 millimeter, תוך הקפדה שלא ללחוץ על הטיפות כדי לא לפגוע במבנה המטריצות. לדוגמיות לצורך הדמיה.מקמו את העדשה בעוצמה של 40x במרכז טיפת הקולגן. לאחר מכן, בעזרת נורת הפלואורסצנציה, קבלו סקירה כללית של הדגימה הן בציר XY והן בציר xz. לאחר מכן, עברו למצב דימות חי (live imaging) קונפוקאלי.בעזרת לייזר של 561 ננומטר, התחילו את המיקוד מתחתית הזכוכית עד להופעת סיבי הקולגן. הגדירו עומק זה כ-Z שווה ל-0 מיקרומטרים. כעת, הרימו את העדשה עד להגעה לגובה של 100 מיקרומטרים מעל Z שווה ל-0, ולאחר מכן צלמו את התאים שנמצאים ב-z שווה ל-100 מיקרומטרים או מעלה, כדי למנוע השפעות של מתח מהתחתית הזכוכיתית הנוקשה. סימון של קולגן מסוג rat tail collagen one בעזרת Tamara מאפשר הכנה וויזואליזציה פשוטה של רשתות קולגן תלת-ממדיות.פולימריזציה איטית בטמפרטורת החדר מאפשרת את היווצרות הרשתות הללו, המוצגות כאן באדום, בעלות ארגון דומה לזה של חלבוני שלד התא הנמצאים in vivo, כגון tubulin, המופיע כאן בכחול, או actin המוצג כאן בירוק; ניתן להדגים אותם באמצעות צביעה אימונולוגית כפי שמוצג בתמונות אלו כאשר הן נצפות במטריצות בתלת-ממד. תאי colon adenocarcinoma CT 26 מציגים מורפולוגיה מזנכימלית טיפוסית המאופיינת בגוף תא מוארך עם בליטות תאיות עשירות ב-f actin המזכירות filopodia ו-lamellipodia. מורפולוגיה מוארכת זו בולטת אף יותר בתאים המנסים להיחלץ מהספרואיד התאי על ידי פלישה למטריקס הקולגן. לאחר יומיים בתרבית, התאים מתחילים לפלוש למטריקס הקולגן התלת-ממדי ולהתרחק מהספרואיד התאי.חיוני לנתח את ערימות ה-Z שנאספו מכל מישורי התצפית כדי להבטיח התפלגות תלת-ממדית אחידה של התאים בתמונות אלו. לדוגמה, כאשר הן מוצגות כהקרנה מקסימלית של XY, תאי CT 26 שגדלו כסטרואידים נראים כמי שפולשים באופן נרחב למטריצת הקולגן התלת-ממדית. עם זאת, תצפית x XZ חושפת כי התאים למעשה פולשים למרווח Z מוגבל בהשוואה לנפח הסטרואידי, דבר המצביע על אזור פלישה מועדף.סטרואיד מייצג זה למעשה הוצב קרוב מדי לתחתית הזכוכית של הצלחת, דבר שהוביל לנדידת התאים הרחק מהסטרואיד, לא על ידי פלישה למטריצת הקולגן התלת-ממדית (3D), אלא על ידי זחילה על זכוכית קשיחה דו-מממדית (2D) בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון דימות חי של תאים המבטאים GFP המוטמעים במטריצות קולגן מסוג TAMRA, כדי לעקוב מקרוב אחר אינטראקציות דינמיות בין התא למטריצה או אחר עיוות של המטריצה המושרה על ידי התא.

revealing-the-cytoskeletal-organization-of-invasive-cancer-cells-in-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מודלים של פלישת תאים סרטניים לתוך מטריצה ​​תלת ממדי תאיים לשקף טוב יותר...

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

סרטון זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגידול תאי סרטן השד במטריצת חלבון תלת-ממדית במרתף, המדגימה את הפוטנציאל של תרבית תלת-ממדית בהערכת פלישת תאים לסביבה.

3D תרבית מרתף ממברנה Assay: גידול תאים סרטניים על 3D מרתף ממברנה חלבון מטריקס לחקר פלישה תאים

מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

פרופיל מולקולרי של תאי לייזר microdissected וstroma ממודלים סינטטיים, רקמות מהונדסות סרטן מעי גס מייצג רומן גישה למניפולציה כדי לאפיין ולנתח את הביולוגיה הייחודית בממשק שבין תאים סרטניים בחזית פולשנית ותאי סטרומה סרטן קשור.

מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; פיברובלסטים

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

תאי סרטן מוטבעים בג'ל קולגן ולאחר מכן נדחקים בג'ל פיברין תאי כדי ליצור מערכת תרבית תלת מימדית שבה ניתן לנטר את הפולשניות והיווצרות גידולי לווין.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

פרוטוקול זה מחקרים ביעילות בתרבית של חלוקת התא במטריצות קולגן תלת-ממד על-ידי שילוב סינכרון של חלוקת התא, בפיקוח מחלקת האירועים מטריצות תלת-ממד בעזרת טכניקת דימות לחיות תאים, מיקרוסקופיה זמן לפתור השתקפות קונפוקלי וניתוח כמותי הדמיה.

בתרבית של חלוקת התא במטריצות תלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותיים

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

מוצג כאן הוא פרוטוקול לייצור של מכשיר הדמיה ספרואידי. מכשיר זה מאפשר הדמיה פלואורסצנטית דינמית או אורך של ספירואידים תאים סרטניים. הפרוטוקול מציע גם הליך עיבוד תמונה פשוט לניתוח פלישת תאים סרטן.

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

למד שיטה לסימון קולגן בפלורסצנציה לצפייה בתרביות תאים תלת-ממדיות. חקור את המורפולוגיה של תאי סרטן ואת האינטראקציות שלהם עם המטריצה החוץ-תאית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

גלה סרטונים נוספים