בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתיל תאי לוויין של שריר השלד של נוירונים בוגרים מטוהרים ושקטים לטיפול בפגיעה בשרירי השלד. זה מושג תחילה על ידי ניתוח שרירי השלד מעכברים בוגרים ועיכול אנזימטי של שרירי השלד, ולאחר מכן מיון תאי הלוויין השקטים על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים. לאחר מכן, התאים המבודדים מורחבים על צלחות תרבית מצופות קולגן, ובשלב האחרון, התאים המורחבים במבחנה מוזרקים לשרירי השלד המטופלים בלב וכלי דם של עכברים בוגרים.

בסופו של דבר, ניתן להעריך את ההשתלה והתרומה של תאי לוויין מורחבים במבחנה להתחדשות סיבי השריר על ידי צביעת xal. היי, שמי סושי אורה. אני פרופסור חבר במכון לתאי גזע באוניברסיטת מינסוטה.

הבידוד של תאי לוויין, שהם אוכלוסיית תאי גזע המוניים, חיוני להבנת הביולוגיה של תאי גזע השריר וההתחדשות, כמו גם השתלת תאי גזע לטיפולים בניוון שרירים כגון ניוון שרירים המוני של דושן. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו עובדות הוא שהשיטה שלנו היא שיטת טיהור מהירה, חסכונית ואמינה של תאי לוויין שקטים משריר פיזור העכבר הבוגר. ההדגמה תבוצע על ידי ד"ר ריו מוטו, פוסט-דוקטורנט האשי ומדען זוטר יוקו אסורה במעבדות שלי.

כדי לבודד תאים חד-גרעיניים משריר השלד של העכבר, התחל בצביטה ולאחר מכן חיתוך עור הבטן של כל עכבר בוגר בן שלושה עד שמונה שבועות שהורדם. מקלפים את העור בכיוונים מנוגדים כדי לחשוף לחלוטין את התלת ראשי ואת שריר הרגל האחורית, ולאחר מכן לקצץ לאורך עצמות הרגליים כדי להסיר את שרירי השלד הקדמיים, הגסטרו, הארבע ראשי והתלת ראשי. העבירו את השרירים ל-PBS קר כקרח וסטרילי בצלחת של 10 סנטימטרים ושטפו את הדם.

לאחר מכן העבירו את השרירים לצלחת סטרילית חדשה של שישה סנטימטרים. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסר את רקמת החיבור, כלי הדם, צרורות העצבים והוסף רקמה אפיגנית מהשרירים. לאחר מכן בעזרת מספריים עיניים, חותכים וטוחנים את הרקמה לעיסה חלקה.

מנסה לא להשאיר חתיכות גדולות. העבירו את השרירים הטחונים לצינור של 50 מיליליטר ועכלו את הרקמה בחמישה מיליליטר תמיסת קולגנאז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שעה, השתמש במזרק המצויד במחט בגודל 18 כדי לשלוט בתמיסת הרקמות מספר פעמים.

כדי להומוגניזציה של התערובת, דגרו את ההומוגנאט למשך 15 דקות נוספות, ולאחר מכן שלשו שוב את התערובת כדי להפריד את התרחיץ לתרחיף תא בודד, הוסיפו עד 50 מיליליטר מדיה וערבבו את תמיסת התא. לאחר מכן סנן את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור בז חדש של 50 מיליליטר. ספרו את התאים שנאספו ולאחר מכן סובבו את תרחיף התאים לאחר שטיפת התאים, השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מדיה, ולאחר מכן העבירו את התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כדי לצבוע ולהפריד את התאים.

הנח את צינור המיקרו צנטריפוגה על קרח ולאחר מכן דגר על התאים עם מיקרוליטר אחד כל אחד מגופי הנוגדנים הרשומים. לאחר 30 דקות יש לשטוף את התאים במיליליטר אחד של מדיה פעמיים. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר מדיה ודגרו על התאים 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים נגד PE על קרח.

לאחר 30 דקות נוספות, שטפו את התאים במיליליטר אחד של מאגר מקסימלי פעמיים והשעו מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מאגר. לאחר מכן הנח עמוד LD במגנט ושטוף את העמוד עם 1.5 מיליליטר של מאגר מקסימלי. הוצא את מתלה התא על העמוד, ואסף את הזרימה השלילית של PE דרך שבר בצינור של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן סובב את השבר השלילי PE והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר מדיה. כעת דגרו את התאים בחמישה מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים נגד IgG נגד ארה"ב על קרח, ולאחר 30 דקות, שטפו את התאים במיליליטר אחד של מאגר מקסימלי פעמיים Resus ותלו את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ. לאחר מכן, הנח עמוד MS על המגנט ושטוף אותו עם מיליליטר אחד של מאגר מקסימלי.

לאחר מכן חלק את התאים על העמודה, והשליך את הזרימה השלילית של אלפא שבע דרך שבר. שטפו את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של מאגר מקסימלי, ואז הסירו אותו מהמגנט. לאחר מכן שטפו מיליליטר אחד של מאגר מקסימלי דרך העמודה עם בוכנה כדי לחמץ את האינטגרין המסומן מגנטית שבעה תאים חיוביים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן לאחר סיבוב תרחיף התאים, השעו מחדש את התאים המטוהרים במדיום מיובלסט. לבסוף, צלחו את התאים על צלחת מצופה מטריג'ל בשישה סנטימטרים המכילה חמישה מיליליטר של מדיום מיובלסט. כדי לשמור על תרבית התאים, האכילו את התאים כל יומיים במדיום מיובלסט הגדל מיובלסטים.

מציגים צורה עגולה קטנה ומבטאים מיו D בגרעינים שלהם. כאשר מוכנים להתחיל באיחוי התאים, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ולאחר מכן נסו להחזיר אותם באינקובטור של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש דקות, אסוף את התאים המנותקים במדיום מיובלסט, סובב את התאים resus, תלה את הגלולה במדיום מיובלסט והחזיר את התאים לצלחות מצופות מטריג'ל חדשות.

כדי להבדיל את תרבית התאים, הזינו את התאים כל יומיים במדיום התמיינות. לאחר יום אחד, המיובלסטים ייצאו ממחזור התא ויעברו התמיינות לשרשרת כבדה של מיוזין או מיוציטים חיוביים ל-MHC. ביום השלישי עד החמישי, התאים מתמזגים זה עם זה ויוצרים צינורות מיו מרובי גרעינים.

24 שעות לפני השתלת מיובלסט, יש לגלח את השיער סביב שריר השוקה הקדמי או שריר TA של עכבר החלקה רדום בן חודשיים. לאחר מכן השתמש במזרק אינסולין בגודל 31 כדי להזריק 10 מיקרומולר של קרדיו טואין לשריר. למחרת, נתק את המיובלסטים המתרבים מהלוחות המצופים במטריג'ל עם טריפסין כפי שהודגם זה עתה וסובב את התאים המנותקים, והשהה מחדש פעם אחת 10 עד שישית מהתאים ב-50 מיקרוליטר מדיה.

לאחר מכן טען את התאים למזרק אינסולין בקוטר 31 והשתיל את התאים תוך שרירית בבעל החיים המקבל לצורך התחדשות השרירים הקדמיים של TBI. שבוע עד ארבעה שבועות לאחר ההזרקה קצרו את שרירי ה-TA לניתוח היסטולוגי. תאי לוויין שקטים שבודדו לאחרונה מציגים צורה עגולה קטנה, ויותר מ-90% מהתאים הללו מבטאים PAC 7 כסמן סופי.

ניתן להשתמש במיובלסטים מורחבים ex vivo לניסויי הזרקת תאים תוך שריריים לבחינת תרומת מיובלסט להתחדשות סיבי שריר וחידוש עצמי של תאי לוויין. כאשר הם מתורבתים במדיום התמיינות, המיובלסטים יוצאים ממחזור התא מתמזגים זה עם זה והופכים לצינורות מיו רב-גרעיניים המבטאים שרשרת כבדה של מיוזין מספר ימים עד מספר חודשים לאחר ההשתלה. ניתן לזהות תאים הנגזרים מתורם חיובי בצד בטא גלקטו, הכוללים מיובלסטים מתרבים, תאי לוויין המתחדשים מעצמם וסיבי שריר חדשים שנוצרו בשריר הלב הפגוע לאחר כל התפתחות.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תאי גזע של שריר ומקור שרירים לחקור השתלת תאי גזע תטיים לניוון שרירים, אני פושי. אני יוקו. אני נוריו.תודה.

תודה שצפית.