במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות מכלולים ביולוגיים ונוזלים על מנת לצפות בהתנהגויות הדינמיות שלהם ברזולוציה ננומטרית. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של שבבי הסיליקון ניטריד עם משטח לכידת זיקה כדי לאפשר קשירת מקרומולקולות למשטח השבב, ומניעת דיפוזיה בנוזל. השלב השני הוא העמסת דגימות ביולוגיות על השבב על מנת לגייס חלקיקי נגיף רוטה.

לאחר מכן, השבב המכיל את חלקיקי הנגיף נשטף בחומר ניגוד ולאחר מכן נטען על מחזיק הדגימה המיקרופלואידית. השלב האחרון הוא להעמיס את השבב העליון ואת לוחית הפנים ליצירת כלי סגור העוטף את הדגימה הנוזלית. בסופו של דבר, התמונות מוקלטות ב-TEM כדי לחשוף תכונות של דגימת הנגיף בתוך תא המיקרו הנוזלי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות לבחינת ישויות בנוזל הוא שהדגימה שלנו אינה מתפזרת במהירות למרחקים גדולים בזמן ההדמיה עקב, האם ציפוי לכידת הזיקה מיושם על השבבים? ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הערכות בזמן אמת של מערכות אספקת תרופות מבוססות ננו-חלקיקים או פיתוח חיסון נגד פתוגנים נגיפיים מכיוון שאנו יכולים לראות לראשונה כיצד מכונות ננו דינמיות משתנות בתמיסה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הדמיית מקרומולקולות ביולוגיות, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון יישומי אלקטרוכימיה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. מכיוון שהכנת התקני לכידת זיקה וטעינת מחזיק הדגימה של המיקרו-נוזל עלולה להוות בעיה למשתמש המתחיל. כדי להתחיל, נקה את שבבי הסיליקון ניטריד e על ידי דגירה שלהם ב -15 מיליליטר אצטון למשך שתי דקות, ואחריהם 15 מיליליטר מתנול למשך שתי דקות.

כדי להסיר שאריות פוטו-רזיסט המשמשות בתהליך הייצור, אפשר לשבבים להתייבש במהירות תחת זרימת אוויר למינרית. לאחר הייבוש, דגרו את הצ'יפס על צלחת שחוממה ל -150 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות. לאחר מכן הניחו להם להתקרר לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השתמש במזרקי המילטון כדי להרכיב תערובת שומנים בצינור זכוכית קטן. על ידי הוספת 25% כלורופורם תחילה, ולאחר מכן הוסף 55% DLPC בכלורופורם במיליגרם אחד למיליליטר. ולבסוף, בעזרת מזרק נפרד, הוסף 20% שומן ניקל NTA בכלורופורם במיליגרם אחד למיליליטר לנפח כולל של 40 מיקרוליטר.

לאחר מכן חותכים חתיכת פרם כך שתתאים לצלחת פטרי מזכוכית בגודל 100 על 15 מילימטר, ומוסיפים תשע טיפות של 15 מיקרוליטר של מי Milli Q על פני הפרם. מרחו כמות של מיקרוליטר אחד מתערובת השומנים על כל טיפה של 15 מיקרוליטר של מי Milli Q והניחו את הצלחת על קרח בסביבה לחה למשך 60 דקות לפחות בזמן שנוצרת שכבת שומן חד-שכבתית על פני הטיפות. הנח EIP עם מרווח משולב של 150 ננומטר על גבי הטיפה החד-שכבתית ודגר אותם יחד למשך דקה אחת.

לאחר מכן, הרם בעדינות את השבב מהטיפה והוסף שלושה מיקרוליטרים של חלבון מתויג Hist A ב-0.01 מיליגרם למיליליטר ישירות לפני השטח של השבב. דגרו את השבב וחלבון A למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מחק את עודפי הנוזל באמצעות נייר סינון ווטמן מספר אחת והוסף מיד שלושה מיקרוליטרים של תמיסת נוגדן IgG ב-0.01 מיליגרם למיליליטר.

דגרו את הדגימה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את התמיסה העודפת באמצעות מזרק המילטון והוסף מיד ליטר אחד של נגיף הרוטה, חלקיקים דו-שכבתיים ב-0.1 מיליגרם למיליליטר בתמיסת חיץ ערימות, ודגר את השבב למשך שתי דקות לפחות בטמפרטורת החדר. IP שטוח שני מוכן על ידי פריקת זוהר למשך דקה אחת, הרכיבו את החדר המיקרופלואידי באמצעות ST. סטריאוסקופ על ידי טעינה ראשונה של קצה תא הדגימה עם טבעות O.

לאחר מכן טען את ה-E IP הרטוב המכיל את הדגימה הנגיפית לקצה מחזיק הדגימה המיקרופלואידית. לאחר מכן, הוסף את ה-EIP השטוח של פריקת הזוהר מעל החלק העליון של הדגימה כריך את כל המכלול יחד ליצירת מארז אטום המוחזק במקומו מכנית בתוך המחזיק על ידי שלושה ברגי פליז. לאחר ההרכבה, שאב את קצה המחזיק עד 10 למינוס שש טור.

השתמש בתחנת שאיבה יבשה של משאבת טורבו לפני הנחת המחזיק בתוך ה-TEM, טען את מחזיק הדגימה I two למיקרוסקופ אלקטרונים שידור המצויד בחוט מעבדה שישי הפועל ב-120 קילו-וולט. לאחר מכן, הפעל את חוט ה-TEM והתאם את הגובה המרכזי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה על ידי שימוש בפונקציית הוובלר כדי להטות את הדגימה למינוס 15 מעלות עד פלוס 15 מעלות קדימה ואחורה. בעמודה רשום תמונות הגדלה פי 6,000 עד 30,000 לאורך הקצוות ובאזורים הפינתיים של החדר המיקרופלואידי.

תמונה ראשונה באמצעות מצלמת CCD בתנאי מינון נמוך של אחד עד שלושה אלקטרונים לאנגסטרום בריבוע. קבע את ערך המיקוד המתאים על ידי התמקדות בקצה תא הנוזל. באופן כללי, השתמש בערך דה-פוקוס של מינוס 1.5 מיקרומטר כדי להקליט תמונות בהגדלה פי 30, 000 כדי להבטיח שהתמיסה כלולה בתא המיקרופלואידי.

במהלך הניסויים, מקדו את אלומת האלקטרונים עד להיווצרות הבועות בנוזל שבתוך המכשיר. התמונה המוצגת כאן צולמה לאחר שתי דקות בחמישה אלקטרונים לאנגסטרום בריבוע. לאחר חמש דקות, בועות נוספות יצרו פריקת זוהר, שבבים נקשרים.

מעט מאוד חלקיקים דו-שכבתיים בתמיסה ככל הנראה עקב דיפוזיה. לשם השוואה, החלקיקים הדו-שכבתיים מועשרים על שבבים מעוטרים בזיקה המוצגים כאן הם תמונות מייצגות ושחזור תלת מימדי של חלקיקים דו-שכבתיים בנוזל המכיל מגיב ניגוד. קוטר השחזור הוא 80 ננומטר.

ממוצעי המחלקה של החלקיקים הדו-שכבתיים והנוזל חשפו מאפיינים מוגדרים היטב לאורך פני השטח החיצוניים שלהם. לוחות בודדים הם 110 ננומטר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למרכז את ה-E IPS בקצה מחזיק הדגימה ולהכין את המחזיק לפני הכנסתו למיקרוסקופ האלקטרונים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הערכת פעילות השעתוק על מנת לענות על שאלות נוספות כמו, באיזו מידה קרן האלקטרונים השפיעה על היכולת התפקודית של הקומפלקסים הנגיפיים? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר התקני לכידת זיקה, לקשט אותם במתאמים מולקולריים, לטעון דגימות וירוסים לתוך מחזיק ה- TEM המיקרופלואידית ולדמות את הדגימות באמצעות הליכי מיקרוסקופיה cche. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים נגיפיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומשקפי מגן בעת ביצוע הליכים עם שני פתוגנים של BSL.