Name: במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: למד לצלם מכלולים ביולוגיים בנוזל ברזולוציית ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. השיטה מאפשרת לחקור התנהגויות דינמיות של וירוסי רוטה ומבנים ויראליים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים ד"ר מייקל ג 'פרידלנדר, מנהל מכון המחקר וירג'יניה טק Carilion לעידוד מאמצי המחקר שלנו. פרויקט זה נתמך על ידי קרנות פיתוח ל- S.M.M ו- D.F.K. ובחלקו על ידי יוזמת ננו-ביו של המכון לטכנולוגיה קריטית ומדע יישומי בווירג'יניה טק.

1. הכן התקני לכידת קירבות16
<ol><li>נקו את שבבי הסיליקון nitride E על ידי דגירה שלהם ב 15 מ"ל של אצטון במשך 2 דקות ואחריו 15 מ"ל של מתנול במשך 2 דקות(איור 1A). אפשר לשבבים להתייבש תחת זרימת אוויר למינארית.</li>
	<li>דגירה את השבבים המיובשים על צלחת ערבוב מחוממת (ללא ערבוב) במשך 1.5 שעות ב 150 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
	<li>השתמש מזרקים המילטון להלחין תערובות שומנים בצינורות זכוכית קטנים כדי להכיל 25% כלורופורם, 55% DLPC (1,2-דילאורויל-פוספוצ'ולן) בכלורופורם (1 מ"ג/מ"ל) ו-20% שומנים Ni-NTA (1,2-דיאולויל-אימינודיאקטי חומצה-סוציניל-ניקל מלח) בכלורופורם (1 מ"ג/מ"ל) בנפח כולל של 40 מיקרוגרם.</li>
	<li>החל 1 μl aliquot של התערובת על כל טיפה 15 μl של מים מילי-Q על חתיכת Parafilm בצלחת פטרי לחה(איור 1B). דגימות דגירה על קרח לפחות 60 דקות.</li>
</ol>2. לכידת מקרומולקולות17
<ol><li>הניחו שבב E עם מרווח משולב של 150 ננומטר מעל דגימת מונולאייר והדגירה למשך דקה(איור 1C).</li>
	<li>הרימו בעדינות את השבב מהדגימה והוסיפו אליקאוט של 3 מיקרומטר של חלבון A. דגירה למשך דקה בטמפרטורת החדר(איור 1D).</li>
	<li>כתם את הירידה העודפת באמצעות Whatman #1 נייר סינון ומיד להוסיף aliquot 3 μl של פתרון נוגדנים. דגירה במשך דקה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את הפתרון העודף באמצעות מזרק המילטון ומיד להוסיף 1 μl aliquot של DLPs rotavirus (0.1 מ"ג / מ"ל) בתמיסת חיץ המכיל 50 מ"מ HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 ו 10 mM CaCl2. דגירה לפחות 2 דקות בטמפרטורת החדר. הכנת DLPs תוארה בעבר18.
</li>
</ol>3. להרכיב את התא המיקרופלואידי ולטעון את מחזיק דגימת in situ
<ol><li>טען את שבב ה-E הרטוב המכיל את הדגימה הנגיפית לקצה מחזיק הדגימה המיקרופלואידית. פריקה זוהרת של שבב E שטוח שני למשך דקה אחת ולאחר מכן נטענת על גבי שבב המרווח(איור 2, לוחות 1.5).</li>
	<li>לחלופין, כדי להגדיל את הניגודיות של מקרומולקולות ביולוגיות, ניתן להוסיף כתם מתכת כבדה(למשל 0.2% אורניל) לדגימות רטובות לפני הנחת השבב האלקטרוני השני על הדגימה הרטובה. עם זאת, שבב E המכיל את הדגימה יהיה צורך לשטוף עם מים מילי-Q לפני הוספת ריאגנט ניגודיות.</li>
	<li>כריך את ההרכבה כולה יחד כדי ליצור מארז אטום, מוחזק במקום מכני בתוך המחזיק על ידי 3 ברגים פליז(איור 2,לוחות 6-8).</li>
	<li>לאחר ההרכבה, קצה המחזיק נשאב ל-10-6 טור באמצעותתחנת שאיבה יבשה עם משאבת טורבו לפני הנחת המחזיק בתוך ה-TEM.</li>
</ol>4. הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
<ol><li>טען את מחזיק הדגימה במקום למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (FEI Company) המצויד בסיבי LaB6 ופועל במהירות של 120 kV.</li>
	<li>הפעל את חוט ה- TEM והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה באמצעות פונקציית הרטט כדי להטות את המדגם מ- -15° ל- +15° הלוך ושוב בעמודה. הליך זה מתאים את השלב בכיוון z כדי לסייע להסביר את העובי הנכון של התא הנוזלי. שלב זה גם מבטיח שנעשה שימוש בהגדלה מדויקת בעת הקלטת תמונות.</li>
	<li>הקלט תמונות לאורך הקצוות ובאזורים הפינתיים של התא המיקרופלואידי תחילה. אזורים אלה מכילים בדרך כלל את הפתרון הדק ביותר. הקלט תמונות של דגימות בתנאים במינון נמוך (1-3 אלקטרונים / Å2) באמצעות מצלמת CCD. השתמש בהגדלות נומינליות של 6,000X - 30,000X.</li>
	<li>קבע את ערך ההיתוך הנכון על-ידי התמקדות בקצה התא הנוזלי. השתמש בערך של -1.5 מיקרומטר כדי להקליט תמונות בהגדלה של פי 30,000. אם יתקל בתמיסה עבה או אם לא נעשה שימוש בסוכן ניגודיות בהכנת הדגימה, השתמש בערכי defocus גבוהים יותר בטווח של -2 עד -4 מיקרומטר.</li>
	<li>כדי להבטיח שהפתרון ייכלל בתא המיקרופלואידי לאורך כל הניסויים, מקד את קרן האלקטרונים עד שהבועות ייווצרו בנוזל שבתוך המכשיר.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

המחברת, מדלין ג'יי דיוקס, היא עובדת של פרוטוצ'יפס בע"מ.

בעבודה המוצגת שלנו, השתמשנו בגישת לכידת הזיקה לקשור DLPs rotavirus לפלטפורמה מיקרופלואידית. זה איפשר הדמיה situ של קומפלקסים מקרומולקולריים במיקרו-וירוס נוזלי. גישת הלכידה היא משמעותית ביחס לטכניקות הדמיה מיקרופלואידיות אחרות מכיוון שהיא ממקמת דגימות ביולוגיות לחלון ההדמיה כדי לשלול בעיות דיפוזיביות גדולות המתעוררות בעת הקלטת תמונות בנוזל. עם זאת, אחד הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול שלנו כרוך בהעברת הביופילם של השומנים למשטח השבב. אם המונולאייר השומנים לא יצליח להתפשט באופן שווה ע...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

מטרה נפוצה של ביולוגים ומהנדסים היא להבין את הפעילות הפנימית של מכונות מולקולריות. מיקרוסקופי אלקטרוני שידור (TEMs) הם מכשירים אידיאליים כדי לדמיין את הפרטים המורכבים האלה ברזולוציה כמעט אטומית1-2. על מנת לקיים את מערכת ואקום גבוהה של TEM, דגימות ביולוגיות מוטבעות בדרך כלל בסרטים דקים של קרח זגוגי3, סוכרים4, מלחי מתכת כבדה5, או שילוב כלשהו של6. כתוצאה מכך, תמונות של דגימות מוטבעות עשויות לחשוף רק תמונות מוגבלות של תהליכים דינמיים.
ניסיונות מוקדמים לשמור על דגימות ביולוגיות hydrated בתאי נוזלים סביבתיים בוצעו על ידי פרסונס ועמיתיו באמצעות שלבי שאיבה דיפרנציאליים. דפוסי עקיפת אלקטרונים של גבישי קטלאז לא מוכתמים נרשמו בהצלחה לרזולוציה של 3 Å במצב hydrated7-8. בנוסף, תחומי השומנים מופרדים פאזה ניתן לבדוק קרום hydrated של אריתרוציטים אנושיים9-10. עם זאת, תנועה הנגרמת על ידי פיזור נוזל והפרעתו לקרן האלקטרונים, גרמה לאובדן רזולוציה חמור וניסויים נוספים באמצעות דגימות ביולוגיות לא נוסו עד לאחרונה.
לאחרונה פותחו מחזיקי דגימה מיקרופלואידית שמשתמשים בשבבים מוליכים למחצה כדי ליצור תא סביבתי בקנה מידה זעיר. התקנים אלה יכולים לשמור דגימות בנוזל בזמן שהם ממוקמים בעמודה TEM11-12. פריצת דרך טכנית זו בהדמיית TEM אפשרה לחוקרים להציג, לראשונה, אירועים מתקדמים ברמה המולקולרית13. אנו מתייחסים לאופן חדש זה כמו " במיקרוסקופיה מולקולריתsitu " כמו ניסויים יכולים להתבצע כעת "בתוך" עמוד EM14-15. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לדמיין מכלולים ביולוגיים בנוזל כדי להתבונן בהתנהגויות הדינמיות שלהם ברזולוציית ננומטר. הרציונל מאחורי הטכניקה המפותחת הוא לתעד תצפיות בזמן אמת ולבחון תכונות חדשות של מכונות ביולוגיות בתמיסה. מתודולוגיה זו מרחיבה את השימוש ב- TEMs למטרות רחבות יותר בביולוגיה תאית ומולקולרית12-16.
במאמר הווידאו הנוכחי, אנו מציגים פרוטוקול מקיף להרכבה ושימוש במחזיק דגימה מיקרופלואידית זמינה מסחרית. מחזיקים מיוחדים אלה משתמשים שבבי סיליקון ניטריד המיוצרים עם מרווחים משולבים כדי ליצור תא נוזלי המקיף כמויות זעירות של פתרון. חלונות דקים ושקופים חרוטים בשבבים למטרות הדמיה12. אנו מדגימים את השימוש הנכון של מחזיק microfluidic לבחון חלקיקים דו שכבתיים simian rotavirus (DLPs) בנוזל באמצעות TEM. כדי להבטיח כי מכלולים ביולוגיים, כגון DLPs, לא להתפזר במהירות על פני מרחקים גדולים בעת הדמיה, אנו משתמשים בגישה לכידת אהדה לקשור אותם אל פני השטח של התא microfluidic16. שלב לכידה מולקולרית זה יש יתרון גדול על פני טכניקות חלופיות להדמיית דגימות ביולוגיות בנוזל מכיוון שהוא מאפשר רכישת תמונות שישמשו לשגרות עיבוד במורד הזרם. שלב לכידה זה המשמש בשילוב עם הדמיה מיקרופלואידית הוא ייחודי להליכים שלנו17. קוראים המשתמשים ביישומים ביולוגיים מבניים באמצעות TEM או תאי הדמיה מיקרופלואידיים עשויים לשקול את השימוש בטכניקות לכידת אהדה כאשר תצפיות דינמיות ברמה המולקולרית הן המטרה הסופית.

<table><tbody><tr><td>שבבים אלקטרוניים, שבב מרווח</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 & m x 50 &mu; m חלון</td></tr><tr><td>E-chip, שבב עליון</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; m חלון</td></tr><tr><td>Ni-NTA ליפידים</td><td>קוטביים Avanti</td><td>790404P</td><td>צורת אבקה</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) ליפיד</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>צורת אבקה</td></tr><tr><td>צלוחיות נפח&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 מ"ל; 5 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>מזרקי המילטון</td><td>המילטון ושות'</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 &mu; l; 1-25 &mu; l</td></tr><tr><td>Whatman #1 נייר סינון</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 חתיכות, 90 מ"מ</td></tr><tr><td>צלחות פטרי זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>70165-101</td><td>100 מ"מ x 15 מ"מ</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר זכוכית</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>צינורות תרבית זכוכית</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 מ"מ x 50 מ"מ</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר מדעי</td><td>A11-1</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A412-1</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>כלורופורם&nbsp;</td><td>Electron Microcopy Sciences</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>התיוג שלו חלבון A</td><td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>10 מ"ג</td></tr><tr><td>מערכת מים מילי-Q</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>מים טהורים</td></tr><tr><td>במיוחד HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>ציוד&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוסידון In situ מחזיק דגימה</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; תואם FEI</td></tr><tr><td>Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>120 קילו וולט</td></tr><tr><td>נשר 2k HS CCD מצלמה</td><td>FEI ושות'</td><td></td><td>10&nbsp; &Aring;/פיקסלים דגימה ב-30,000X</td></tr><tr><td>Gatan 655 תחנת משאבה יבשה</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>קצה מחזיק משאבה ל-10-6&nbsp; range</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, יחידת פריקת זוהר</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td></td><td>&nbsp; מצב קוטביות שלילית</td></tr><tr><td>צלחת ערבוב מחוממת איזוטמפ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>חום ל -150 &ordm; C למשך שעה וחצי</td></tr></tbody></table>

במקום tem של מכלולים ביולוגיים בנוזל

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

חוקרים משתמשים באופן קבוע במיקרוסקופים אלקטרונים (TEMs) כדי לבחון ישויות ביולוגיות ולהעריך חומרים חדשים. כאן, אנו מתארים יישום נוסף עבור מכשירים אלה- צפייה במכלולים ויראליים בסביבה נוזלית. שיטה מרגשת וחדשנית זו של הדמיה של מבנים ביולוגיים מנצלת מחזיק דגימה מיקרופלואידית שפותחה לאחרונה. מאמר הווידאו שלנו מדגים כיצד להרכיב ולהשתמש במחזיק מיקרופלואידי כדי לדמות דגימות נוזליות בתוך TEM. בפרט, אנו משתמשים בחלקיקים דו שכבתיים simian rotavirus (DLPs) כמערכת המודל שלנו. אנו מתארים גם צעדים לציפוי פני השטח של התא הנוזלי בביופילמים של זיקה הקושרים DLPs לחלון הצפייה. זה מאפשר לנו לצלם הרכבות באופן שמתאים לקביעת מבנה תלת מימדי. לכן, אנו מציגים הצצה ראשונה של חלקיקים תת-ויראליים בסביבה נוזלית מקומית.

תמונות מייצגות של DLPs בנוזל באמצעות שבבי E ששוחררו בזוהר (איור 3A) מציגות פחות DLPs באזור צפייה נתון, ככל הנראה עקב דיפוזיה, בהשוואה ל- DLPs המועשרים במכשירי לכידת קירבה (איור 3B). התוספת של אורניל מתא ההדמיה משפרת את הניגודיות של הדגימה ומכאן את הנראות של DLPs בודדים בתמיסה (איור 3C, הלוח העליון). ניגודיות טובה יותר מאפשרת עיבוד תמונה במורד הזרם כגון ממוצע חלקיקים(איור 3C, לוח תחתון) ושגרות שחזור תלת-ממדיות(איור 3C, inset) כפי שתואר קו...

כאן אנו מתארים הליך כדי לדמיין מתחמים ויראליים בנוזל ברזולוציית ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לדמות מכלולים ביולוגיים ונוזלים במטרה לתצפת על התנהגותם הדינמית ברזולוציית ננומטרים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת שבבי מיקרו של סיליקון ניטריד עם פני שבירה בעלי זיקה (affinity capture surface), המאפשרים קישור של מקרו-מולקולות לפני השבב ובכך מונעים דיפוזיה בנוזל. השלב השני הוא טעינת דגימות ביולוגיות על גבי שבב המיקרו כדי לגייס חלקיקי rotavirus.בשלב הבא, השבב המיקרוסקופי המכיל את חלקיקי הווירוס נשטף עם חומר ניגוד ולאחר מכן נטען למחזיק הדגימות המיקרופלואידי. השלב הסופי הוא טעינת השבב העליון ולוחית הפנים כדי ליצור כלי סגור העוטף את הדגימה הנוזלית. לבסוף, תמונות מוקלטות ב-TEM כדי לחשוף מאפיינים של דגימת הווירוס בתוך תא המיקרו-נוזלי.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות לבחינת ישויות בנוזל הוא שהדגימות שלנו אינן מפיצות את עצמן במהירות למרחקים גדולים במהלך הדימיון, וזאת הודות לציפוי ללכידה על בסיס זיקה (affinity capture coating) המיושם על השבבים המיקרוסקופיים. ההשלכות של טכניקה זו חולשות לעבר הערכות בזמן אמת של מערכות להולכת תרופות מבוססות ננו-חלקיקים או פיתוח חיסונים נגד פתוגנים ויראליים, מכיוון שביכולתנו לראות לראשונה כיצד מכונות ננוינמיות משתנות בתמיסה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ויזואליזציה של מקרו-מולקולות ביולוגיות, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון יישומים בתחום האלקטרוכימיה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת התקני לכידה על בסיס זיקה (affinity capture) והטענת מחזיק הדגימות המיקרופלואידי עשויות להוות קושי עבור משתמשים מתחילים. לתחילת הפעולה, יש לנקות את שבבי הסיליקון ניטריד על ידי הדגרה ב-15 milliliters של אצטון למשך שתי דקות, ולאחר מכן ב-15 milliliters של מתנול למשך שתי דקות.כדי להסיר שאריות פוטורזיסט ששימשו בתהליך הייצור, יש להניח לשבבים להתייבש במהירות תחת זרימת אוויר למינרית. לאחר הייבוש, יש לדגור את השבבים על פלטה המחוממת ל-150 degrees Celsius למשך 1.5 שעות. לאחר מכן, יש להניח להם להצטנן לטמפרטורת החדר.בשלב הבא, השתמשו במזרקי Hamilton כדי להכין תערובת ליפידים בשפופרת זכוכית קטנה. הוסיפו תחילה 25% כלורופורם, ולאחר מכן הוסיפו 55% DLPC בכלורופורם בריכוז של 1 mg/mL. ולבסוף, באמצעות מזרק נפרד, הוסיפו 20% nickel NTA lipid בכלורופורם בריכוז של 1 mg/mL, לנפח כולל של 40 µL.לאחר מכן, גזרו פיסת param שתתאים לתוך צלחת פטרי מזכוכית בגודל 100 על 15 מילימטר, והוסיפו תשע טיפות של 15 microliter של מי Milli Q על פני השטח של ה-param. טפטפו מנה (aliquot) של 1 microliter של תערובת הליפידים על כל טיפה של 15 microliter של מי Milli Q, והניחו את הצלחת על קרח בסביבה לחה למשך 60 דקות לפחות, בזמן ששכבה ליפידית אחת (lipid monolayer) נוצרת על פני השטח של הטיפות. הניחו EIP עם ספייסר אינטגרלי של 150 nanometer על גבי טיפת השכבה הבודדת והדגירו אותם יחד למשך דקה אחת.בשלב הבא, הרימו בעדינות את השבב מהטיפה והוסיפו שלושה µL של protein A עם תג hist בריכוז 0.01 mg/mL ישירות לפני השטח של השבב. הדגרימו את השבב ואת ה-protein A למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ספגו את עודפי הנוזל באמצעות נייר סינון watman מספר 1 והוסיפו מיד שלושה µL של תמיסת נוגדן IgG בריכוז 0.01 mg/mL.דגרו את הדגימה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את עודפי התמיסה באמצעות מזרק Hamilton והוסיפו מיד מנה (aliquot) של 1 µL של חלקיקים דו-שכבתיים של rotavirus בריכוז של 0.1 mg/mL בתמיסת heaps buffer, ודגרו את השבב למשך שתי דקות לפחות בטמפרטורת החדר. IP שטוח שני מוכן על ידי פריקה זוהרת (glow discharging) למשך דקה אחת; הרכיבו את תא המיקרופלואידיקה באמצעות ST.Stereoscope על ידי טעינת קצותיו של תא הדגימה בטבעות O-rings תחילה.לאחר מכן, טענו את ה-E IP הרטוב המכיל את הדגימה הוויראלית אל קצה מחזיק הדגימות המיקרופלואידי. בשלב הבא, הוסיפו את ה-EIP השטוח שעבר פריקה זוהרת (glow discharge) מעל הדגימה, והדקו את כל המכלול יחד ליצירת תא אטום המוחזק מכנית בתוך המחזיק באמצעות שלושה ברגי פליז. לאחר ההרכבה, שלבו את קצה המחזיק עד להגעה ללחץ של 10 to the minus six tor.לאחר שימוש בתחנת שאיבה יבשה עם משאבת טורבו לפני הכנסת התומך לתוך ה-TEM, טענו את תומך הדגימות I two לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) המצויד בסיב lab six הפועל ב-120 kilovolts. לאחר מכן, הפעילו את סיב ה-TEM וכvו את גובה המירכוז שלבמיקרוסקופ ביחס לדגימה באמצעות פונקציית ה-wobbler להטיית הדגימה לבין מינוס 15 מעלות לפלוס 15 מעלות הלוך ושוב. בתוך העמוד, רשמו תמונות בהגדלה של 6,000 עד 30,000 פעמים לאורך הקצוות ובאזורי הפינות של תא המיקרופלואידיקה.בצעו צילום ראשון באמצעות מצלמת CCD בתנאי מינון נמוך של 1 עד 3 אלקטרונים ל-angstrom squared. קבעו את ערך ה-defocus המתאים על ידי מיקוד בקצה של התא הפלואידי. באופן כללי, השתמשו בערך defocus של 1.5- micrometers להקלטת תמונות בהגדלה של 30,000 פעמים כדי להבטיח שהתמיסה מוכלת בתוך התא המיקרופלואידי.במהלך הניסויים, מקד את קרן האלקטרונים עד להיווצרות בועות בנוזל בתוך ההתקן. התמונה המוצגת כאן צולמה לאחר שתי דקות בזרם של five electrons per angstrom squared. לאחר חמש דקות, נוצרו בועות רבות אף יותר בפריקת זוהר (glow discharge), קישורי מיקרושבבים.חלקיקים מעטים מאוד בעלי שכבה כפולה בתמיסה, ככל הנראה עקב דיפוזיה. להשוואה, החלקיקים בעלי השכבה הכפולה מועשרים על גבי מיקרוצ'יפים המעוטרים באפניות; התמונות המוצגות כאן הן תמונות מייצגות ושחזור תלת-ממדי של חלקיקים בעלי שכבה כפולה בנוזל המכיל חומר ניגוד. קוטרו של השחזור הוא 80 nanometers.ממוצעי מחלקות של החלקיקים בעלי השכבה הכפולה והנוזל חשפו מאפיינים מוגדרים היטב לאורך פני השטח החיצוניים שלהם. סרגל קנה המידה של כל פאנל הוא 110 nanometers. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למרכז את ה-E IPS בקצה של מחזיק הדגימה ולבצע PrepU למחזיק לפני הכנסתו למיקרוסקופ האלקטרונים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הערכת הפעילות התעתוקית, כדי לענות על שאלות נוספות כגון: באיזו מידה השפיעה קרן האלקטרונים על התפקוד של הקומפלקסים הוויראליים? לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ייצור התקני לכידה באפיניות, קישוטם במתאמים מולקולריים, טעינת דגימות נגיף למחזיק ה-TEM המיקרופלואידי ודימוי הדגימות באמצעות נהלי מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. זכרו כי עבודה עם פתוגנים ויראליים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות והגנה על העיניים, בעת ביצוע הליכים עם פתוגנים ברמת BSL 2.

in-situ-tem-of-biological-assemblies-in-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פתחנו תא עצמאי נוזלי, המאפשר הדמיה באמצעות נוזלים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים. תהליכים דינמיים של חלקיקים בנוזל יכולים להתגלות בזמן אמת עם רזולוצית המשנה ננומטר.

חושף תהליכים דינמיים של חומרים בנוזלים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים סלולריים נוזלי

מאמר זה מציג שיטה לגידול ממבנה biofilm עבור בחיי עיר יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה למיפוי כימי במצב רטוב, מופעל על ידי כור microfluidic, מערכת לניתוח-הממשק ואקום נוזלי. מר Shewanella oneidensis -1 עם פלורסצנטיות ירוק חלבון שימשה כמודל.

בחיי עיר אפיון Biofilms MR1 Shewanella oneidensis על ידי SALVI וסימס תוף

אנו מציגים שגרה עבור הדמיה בזמן אמת וניתוח הרכב היסודות של חלקיקים boehmite במים יונים על-ידי בחיי עיר נוזלי מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה.

בחיי עיר איפיון חלקיקים Boehmite במים באמצעות נוזלי SEM

כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים ניסיוני עבור הצפיה בזמן אמת תהליך הרכבה עצמית באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים תאים נוזל שידור.

במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים נוזלי-תא לצורך מעקב הרכבה עצמית של חלקיקים

צילום אופטי במכשיר מיקרוסקופ באתרו פותחה כדי לפקח על גודל של תאים בודדים ישירות בתא ההשעיה. מדידה בזמן אמת מתבצעת על ידי צימוד sterilizable הבדיקה צילום אופטי לניתוח תמונה אוטומטית. שינויים מורפולוגיים מופיעים בתלות במצב הגדילה ובתנאי הטיפוח.

באתרו מיקרוסקופיה לקביעת בזמן אמת של מורפולוגיה תא חד בBioprocesses

פרוטוקול להכנת בתאי הנוזלי של המיקרוגל הנתמכים על ידי מיקרוסקופיה אלקטרון באתרו של מיקרוסקופ של זהב nanocrystals מ-haucl4 הפתרון הקודמן מוצג. יתרה מזאת, שגרת הניתוח מוצגת באמצעות ככמת תחריט ודינמיקת צמיחה.

הכנת התאים הנוזליים של הגרפן לתאי הנוזלי עבור הילוכים באתרו מיקרוסקופ אלקטרוני

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע בניסויים תגובת גז תא סגור situ TEM תוך פירוט מספר שיטות הכנה מדגם נפוץ.

ביצוע באתרו תגובות גז תא סגור במיקרוסקופ אלקטרונים ההולכה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינויים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) עם מערכת תאורת אור, ייצור תאים נוזליים, ותצפיות in situ TEM של אינטראקציות הנגרמות על ידי אור בין תאי חיידקים לבין פוטוסנסיטייזר. כמו כן נדונו שיטות הכנת הדגימה, נזק לקרן אלקטרונים והדמיה.

מיקרוסקופיית אלקטרונים המושרה על ידי אור באתרו לתצפית על אינטראקציית החומר הנוזלי-רך

כאן מתוארים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים המתאימים לניתוח נוזל-EM וקריו-EM בקנה מידה ננומטרי באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.

קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

למד לצלם מכלולים ביולוגיים בנוזל ברזולוציית ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. השיטה מאפשרת לחקור התנהגויות דינמיות של וירוסי רוטה ומבנים ויראליים בזמן אמת.

במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

גלה סרטונים נוספים