הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה
19 בנובמבר 2013
מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו לאפשר הקלטות ומניפולציה של פעילות עצבית בבעלי חיים בשלמותה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג הקלטות in vivo של פעילות עצבית במוח של דג זברה בוגר שלם. זה מושג על ידי השגת דג זברה בוגר באמצעות מריחת אמבטיה של Trica Methyls sulfonate. השלב השני הוא אינטובציה של דג הזברה המשותק.
לאחר מכן, מבוצעת כריתת גולגולת בהרדמה טריקה כדי לספק גישה למוח. השלב האחרון הוא למקם אלקטרודה ראשונית בתוך חלון הגולגולת, המאפשרת להקליט פעילות מוחית חוץ-תאית. בסופו של דבר in vivo.
ניתןלהשתמש באלקטרופיזיולוגיה בדג הזברה הבוגר כדי להראות כיצד תרכובות פרמקולוגיות שונות או מוטציות גנטיות יכולות להוביל לשינויים בפעילות הנוירולוגית הטבעית של דג הזברה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הן בביולוגיה התפתחותית והן בנוירוביולוגיה לגבי האופן שבו שינויים במבנה המוח יכולים להשפיע על שינויים בפעילות העצבית, הן בהתפתחות תקינה והן במקרה של מוטציה גנטית. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שיש לנקוט משנה זהירות כדי להסיר רק חלק קטן מהצלחת הגרמית המכסה את הראש מבלי לפגוע ברקמת המוח.
צינורית האינטובציה מקלה על הכנסת נוזלים לדגים. הגדרה זו מספקת גמישות ומוצקות כדי למקם את הצינורית בצורה הטובה ביותר בתוך הפה של החיה. עבור הגדרה זו, הסר קטע של 1.5 סנטימטר מהקצה הרחב של קצה פיפטה P 200 בעזרת מספריים או סכין גילוח.
לאחר מכן, הכנס חתיכת צינור בגודל שישה סנטימטר על מילימטר אחד לשסתום הפחתה. לאחר מכן הכנס את קצה הפיפטה שהשתנה לחלק קצר של צינור בקוטר שמינית אינץ'. לאחר מכן ניתן להכניס את הצינורית לקצה הפיפטה באמצעות הצינור כדי להחזיק את קצה הפיפטה במקומו עם מנעול הפיתוי.
לפני הניסוי שטפו מערך שפע במי בית גידול, והבטיחו שכל בועות האוויר יוסרו. לאחר מכן, הוסף 30 מיליליטר של תמיסת טריקה מיקרו-מולרית 630 למערך הזלוף של הגולגולת, ואפשר לשני מיליליטר ממנו לעבור דרך הצינור כדי להבטיח את מסירת הטריקה לבעל החיים עם התחלת השפע. למערך השפע העיקרי, הוסף 50 מיליליטר מי בית גידול לצינור הראשון.
לאחר מכן הוסף את כל תרכובות הניסוי הרצויות לכל אחד מהצינורות הנותרים. לאחר מכן, הנח מערך צינורית לתוך החור הקטן של בסיס האינטובציה, סובב רצועה ברוחב סנטימטר אחד של מגבון קים לספירלה הדוקה והכנס אותו לצינור הניקוז כך שמגבון קים משתרע על שני הקצוות. רקמה זו תשמש כפתילון להסרת הנוזל המוזרם ולמניעת הצטברות נוזלים בתוך בסיס האינטובציה שעלולה להפריע לרישום האלקטרופיזיולוגי.
לאחר מכן, הכנס קצה אחד של הצינור לתוך החור הגדול של צלחת הפטרי, ואפשר לקצה התחתון להתרחב לכלי אינרטי גדול מספיק כדי לאסוף את כל פסולת השפע. מנה זו תשמש כמאגר הזרימה להתקנה. לאחר מכן מקם את הרקמה כך שקצה אחד ישכב ליד אזור הבטן של החיה, וההרחבה התחתונה יכולה לטפטף לתוך הצלחת.
הנח את בסיס האינטובציה שהושלם ליד מיקרוסקופ הדיסקציה. לאחר מכן חבר את מנעול ה-lu של הצינורית לצינור השפע הטריקני. בהליך זה, הוסף תמיסת טריקה מיקרו-מולרית לצלחת פטרי בגודל 15 על 60 מילימטר עד שלושה רבעים.
לאחר מכן, שקלו את צלחת השדות. זה ישמש לשיתוק החיה כך שניתן יהיה להזריק הרדמה נוספת לצפק. כעת טבלו את החיה בכלי המכיל טריקה ושקלו שוב את המנה.
לאחר מכן חשב את משקל הדג על ידי הפחתת משקל המנה הממולאת מהמשקל הכולל. הניחו לבעל החיים להישאר בתמיסת הטריקה עד שהוא רגוע ורוב התנועה נפסקת. בזמן שהדג טובל בתמיסת הטריקה, השתמש במזרק NFI המכיל מחט בגודל 34 כדי להוציא מספיק פנטוניום ברומיד כך שיהיה מיקרוגרם אחד לכל גרם של משקל דג.
לאחר שהדג נרגע, השתמש בזוג מלקחיים רחבים כדי להעביר את הדג בזנב לספוג לח מראש ולמקם אותו לרוחב. לאחר מכן, הניחו ספוג ואת הדג מתחת למיקרוסקופ הניתוח. החזק את הצד הגבי של הדג בעזרת מקל ארטיק.
לאחר מכן יש לתת את הפאן קיאון ברומיד אינטרפריטונאלי. עכשיו השתמש במלקחיים עדינים. תפוס את הדג בלסת התחתונה והעביר במהירות את החיה לבסיס האינטובציה.
מקם את הצד הגבי של החיה כלפי מעלה על צורת השעווה כך שניתן יהיה להכניס את הצינורית של מילימטר אחד לפה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים העדינים כדי לתמרן את הדג ולפתוח את הפה סביב הצינורית. במערך שלנו.
עצירה הונדסה לתוך הבסיס, ואפשרה להכניס את הצינורית שלושה מילימטרים לתוך פיו של הדג. ברגע שהוא במקומו, הפעל את צינור הזלוף המוזן בכוח הכבידה המכיל את הטריקה. לאחר מכן חתכו קטע של שלושה סנטימטרים רבועים של טישו ניגוב קים וחיתנו אותו עם מי בית גידול.
הניחו את הרקמה מעל החיה כדי למנוע התייבשות. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, הדג מוכן וממתין לביצוע הגולגולת. אזור זה נראה כמו צלחת גרמית כהה שיושבת מאחורי העין.
לאחר מכן, הכניסו להב אחד של טנדר המספריים בקצה הצלחת ודחפו אותו בכוח מספיק כדי לחדור לעצם מבלי לנקב את המוח. ואז סגור את המספריים כדי לחתוך את העצם. לאחר מכן, הסר את פיסת העצם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגיה.
כבה את האינטובציה. עצור את הזין ונתק במהירות את מנעול הפיתוי המחבר את בסיס האינטובציה לטפטוף הטריקה. העבר את מערך האינטובציה השלם למיקרוסקופ האלקטרופיזיולוגיה וחבר אותו למערכת הזילוף.
הפעל את בית הגידול, השקה וחלחל בקצב של מיליליטר לדקה למשך כשעה. על מנת לשטוף את הטריקה באמצעות מניפולטור מיקרו, מקם את האלקטרודה המשנית כך שניתן יהיה להכניס את קצה האלקטרודה לנחיר של החיה או לטבילה מתחת ללסת העליונה. לאחר מכן, הכנס את מחט האלקטרודה הראשית לפתח הגולגולת.
לאחר מכן הכנס את המחט לרקמה כך שהקצה ממוקם שטחי למדי בתוך הבטן האופטית. מיקומים עמוקים יותר של האלקטרודה עשויים לגרום לאות חשמלי קטן עבור אופן חופשי של פער איסוף נתונים בקצב דגימה של 5,000 הרץ, יחד עם מסנן מעבר נמוך של 0.1 קילו-הרץ ומסנן מעבר גבוה של הרץ אחד משמשים. התחל בתיעוד הפעילות האלקטרופיזיולוגית כאשר מי בית הגידול התפרקו במשך 45 דקות לפחות.
רשום קו בסיס של פעילות מקורית לפחות 15 דקות לפני הוספת תרופות ניסיוניות. הפעילות הנוירולוגית הטבעית של דג הזברה הבוגר נוטרה בניסוי זה, איור זה מראה את הפעילות הבסיסית הספונטנית של הבטן האופטית עם משרעת קטנה בסביבות 2 עד 10 מילי-וולט לאורך כל הרישום. לאחר הכנסת PTZ של 15 מילי-מולרי למערכת, החלה להתפתח הפרשות אפילפטיות ספונטניות תוך חמש דקות.
חשיפה מתמשכת ל-PTZ הובילה לדפוס עקבי של עד 15 מילי-וולט, פריקות משרעת גדולות, ואחריהם פרצי פעילות קטנים ותכופים יותר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להתאזר בסבלנות ולקחת את הזמן בזמן הטיפול בבעל החיים וביצוע הגולגולת. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לכם מושג טוב כיצד להשיג הקלטות in vivo של פעילות עצבית במוחו של דג זברה בוגר שלם.
זה מושג על ידי שימוש במערכת שפע וביצוע קרניוטומיה על החיה המשותקת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה להשגת הקלטות in vivo של פעילות עצבית במוחם של דגי זברא בוגרים ושלמים. השיטה כוללת קיבוע, אינטוב וקרניוטומי (פתיחת גולגולת) כדי לאפשר גישה למוח לצורך ניסויים אלקטרופיזיולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- דגי זברה הם מודלים בעלי ערך למחקר של פעילות עצבית.
- הקלטות in vivo מספקות תובנות לגבי תפקוד המוח.
- טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מאפשרות מניפולציה של מעגלים עצביים.
- קיבוע ואינטובה הם קריטיים להצלחת הניסוי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להקלטות עצביות in vivo.
- שיפור ההבנה של הפעילות המוחית בדגי zebrafish.
- סבסוב מחקרים עתידיים בביולוגיה של מערכת העצבים באמצעות zebrafish.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יישום של Trica Methylsulfonate בטבילה לצורך קיבוע.
- אינטובציה של דג הזברא המקובע.
- ביצוע קרניאוטומי תחת הרדמה ב-Trica.
- מיקום של אלקטרודה ראשית להקלטות חוץ-תאיות.
תוצאות עיקריות
- קיבוע ואינטובציה מוצלחים של דגי זברה בוגרים.
- הושגה גישה למוח באמצעות קרניוטומיה.
- התקבלו הקלטות חוץ-תאיות של פעילות מוחית.
- השיטה מאפשרת מניפולציה ותצפית על פעילות עצבית.
מסקנות
- ההליך המתואר יעיל עבור מחקרים in vivo בדגי zebrafish.
- גישה זו עשויה לקדם את המחקר במעגלים עצביים ובהתנהגות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתרחב מתוך מתודולוגיה זו עבור יישומים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקלטה אלקטרופיזיולוגית in vivo בדגי zebrafish בוגרים ושלמים מאפשרת מדידה ישירה של פעילות עצבית בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקרי נוירופרמקולוגיה ומחקרים גנטיים. גישה זו מגשרת על הפער בין מודלים של זחליים לבין מודלים של בוגרים, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי עבור תיקוף מטרות והערכת תרכובות בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). היכולת של השיטה לנטר תגובות עצביות בזמן אמת לחומרים פרמקולוגיים ממצבת אותה ככלי קריטי למיון תיקי פיתוח בשלבים מוקדמים ולמחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקודי מעגלים עצביים ותגובה פרמקולוגית בהקשר של אורגניזם שלם.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור חשיפה לתרכובת או מוטציה גנטית לשינויים בפעילות העצבית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין השפעות עצביות ישירות לארטיפקטים סיסטמיים.
- מספק נתונים השוואתיים על פני שלבי התפתחות לצורך רצף תרגומי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקימה פלטפורמה מאומתת in vivo להערכה כמותית של תרכובות הפעילות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מספקת קריאות הניתנות לשחזור של פעילות עצבית חוץ-תאית המתאימות לסריקה פרמקולוגית.
- מאפשרת מתן סטנדרטי של תרכובות מרובות באמצעות פופוזיה רב-צינורית לבדיקות מקבילות.
- תומכת ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוכנים נוירו-אקטיביים מגוונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר נקודות סיום של פעילות עצבית עם פנוטיפים הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי אפשרות להערכה עצבית בשלב הבגרות.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס סיכונים באמצעות חשיפת השפעות התרכובות במוח של חולייתן בוגר.
- משפר את הערך הניבוי עבור מועמדים לתרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות מידול של מעגלים עצביים שלמים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות יעדים מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור פורטפוליוים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) וחומרים נוירו-אקטיביים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על מודולציה של מעגלים עצביים והשפעה פרמקולוגית in vivo.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של פעילות עצבית לצורך מיון תרכובות.
- אנליזה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של פעילות עצבית בקו הבסיס ולאחר מתן התרכובת באמצעות מדדים אלקטרופיזיולוגיים מוגדרים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין נתונים של זבבורים (zebrafish) בשלב הזחלת ובשלב הבגרות לצורך התאמת סמנים ביולוגיים ומידול מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית ב-in vivo הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה לתוכניות שונות של נוירופארמקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הקלטה עצבית in vivo לצורך הדירות והשוואתיות בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון באמצעות אספקת קריאות תפקודיות מוקדמות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תרכובות נוירו-אקטיביות ומטרות גנטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, הרדמה וקרניאוטומי מיקרו-כירורגי.
- דורש מכשור אלקטרופיזיולוגי ומערכות פרפוזיה ייעודיות.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך השוואת נתונים.
- ייתכן צורך בהתאמה עבור זני zebrafish שונים או שלבים התפתחותיים שונים.
- טיפול זהיר חיוני למניעת נזק לרקמת המוח ולהבטחת תקינות הנתונים.
