Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח בדיקת התחדשות קו רוחבי כמותית שניתן ליישם על מודל מחלת דג זברה בוגר. זה מושג על ידי הסרת הקו הצדדי של דגי הזברה הבוגרים על ידי טיפול בהם במשך 24 שעות עם גנטמיצין. לאחר מכן, הגנטמיצין נשטף החוצה והדגים מורשים לחדש תרנים עצביים לזמנים שונים במים מתוקים.

לאחר מכן הדגים מוכתמים בצבע חיוני כדי להמחיש התאוששות קו רוחבי בנקודות זמן מוגדרות. כדי לאשר שהתרופה הייתה יעילה בהסרת תרנים עצביים, יש להכתים חלק מהדגים מיד לאחר שטיפת הגנטמיצין. לאחר מכן נספרים התרנים העצביים של הקווים הרוחביים על דגים או תכשירי עור באמצעות תמונות המתקבלות במיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי.

לבסוף, קבוצות הניסוי מושווים כמותית לקבוצת הביקורת באמצעות עקומה סטנדרטית של תורן נוירולוגי רגנרטיבי. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקונפוקלית משמשת לניטור התחדשות הקו הרוחבי במודלים של מחלות דג זברה בוגרים. פיתחנו טכניקה זו כדי לספק בדיקה כמותית לבחינת התחדשות עצבית במודלים של מחלות דגי זברה בוגרים כדי לגרום לנמק של תאי שיער התחל בהוספת תמיסה של 50 מיליגרם למיליליטר של גנטמיצין סולפט במי דגים לריכוז סופי של 0.004% באמצעות מיכל גדול מספיק כדי להכיל דגי זברה בני ארבעה עד שישה חודשים ללא אוורור, מלאו אותו בתמיסת גנטמיצין.

מניחים את הדגים בפנים ומדגרים אותם בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הכינו מיכל דגים עם מי דגים רגילים כדי לשטוף את הגנטמיצין. לאחר שטיפת הגנטמיצין, הניחו את הדגים במי דגים רגילים והחזירו אותם לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס למשך שמונה עד 16 שעות מתמיסת מלאי עבודה של 15 מיליגרם למיליליטר של הצבע החיוני הפלואורסצנטי.

ארבעה ארבעה דתיל אמינו סטירו ומתיל פרידיום יודיד או ארבעה צבעים שניים A. הכינו ריכוז של 0.08% במי דגים לאחר זמן ההתאוששות המיועד מטיפול בגנטמיצין, הניחו כל דג בבאר של צלחת תרבית שש בארות המכילה את הצבע החיוני. מכסים את הצלחות ומניחים אותן במגירת ספסל ליד המיקרוסקופ הפלואורסצנטי לבדיקת תרנים נוירולוגיים מוכתמים. כבה את האורות כדי למנוע כיבוי של הצבע החיוני ודגר אותם למשך שעה בשעה שנבחרה, לאחר שטיפת הגנטמיצין.

הרדמו כל דג על ידי הכנסתם למי הרדמה והמתינו עד שתנועת השחייה שלהם תיפסק כדקה עד שתיים. לאחר מכן, כתם כל דג על מגבת נייר והניח אותם על פיסת נייר סינון לח שבמרכזה מכסה של צלחת פטרי מפלסטיק. לאחר מכן הנח את המכסה על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי והשתמש בשני הגדלות x כדי לצלם תמונות לניתוח כמותי כדי לקבוע את כמות ההתחדשות, ספור את מספר מסכות הנוירו-עצב הגלויות בתוך ארבעת התפרים המיועדים בצד הגחון התחתון ביותר של הדג ממש קרוב לסנפיר החזה הימני.

השתמש במבחן ה-T של התלמיד או ב-ANOVA לניתוח סטטיסטי וחזור על כל הניסויים שלוש פעמים עם מינימום של חמישה דגים לכל ניסוי. אם הניתוח הכמותי ברמת התורן העצבי אינו משמעותי, ניתן להשתמש בניתוח ברמת תא השערה הבודד גם כדי להשיג רמה גבוהה יותר של רזולוציה. לאחר צביעה ושטיפת הדגים, השתמש בדילול של 1 עד 500 של שני פנוקסיאתנול כדי להמית אותם באור מאופק.

בצע חתך על פני הבטן ובצע שני חתכים אנכיים בכל צד של שני החתכים הראשונים. לאחר מכן צור דש עור מרובע על ידי ביצוע חתך לאורך הצלעות העליונות של הדג עד שהוא מיושר עם הסנפירים האנאליים. הניחו את דגימת העור על מגלשת זכוכית, הניחו עליה ארוס ולאחר מכן הניחו עליה כיסוי זכוכית עגול כדי לעזור לעגן ולשטח את הרקמה.

להדמיה דיגיטלית לאחר מכן. השתמש במטרה של פי 60 כדי לצלם תמונות דיגיטליות של תאי השיער בתוך כל תורן עצבי של התפרים באמצע הגוף. לאחר מכן ספרו את תאי השיער בתוך מסכות נוירולוגיות בודדות לניתוח השוואתי וכמותי של קבוצות הביקורת והניסוי.

כפי שניתן לראות כאן, לראש דג הזברה יש מספר גבוה משמעותית של תרנים עצביים בהשוואה לחתך האמצעי או לזנב, כאשר לאזור הזנב יש את המספר הנמוך ביותר של מסכות נוירולוגיות כפי שמוצג בפאנל זה. מכיוון שתבנית התפרים בראש מסובכת וגדולה משמעותית במספר המסכות הנוירולוגיות, היא לא התאימה את עצמה כאזור לניתוח כמותני. בנוסף, ללא קשר לריכוז הגנטמיצין שנבדק, אבלציה מלאה של מסכות נוירולוגיות בכל הראש הייתה ניתנת להשגה לעיתים רחוקות, והשאירה כתמים של מסכות נוירולוגיות שנצפו לאחר טיפול בגנטמיצין כפי שדווח בעבר.

לעומת זאת, לזנב יש כמה מסכות נוירו, וככזה, בחרנו את אזור אמצע הגוף כדי לנתח כמותית את התחדשות התורן העצבי. בבוגר באזור זה, זיהינו ארבעה תפרים ממש אחוריים לסנפיר החזה הצדדי שהיו עקביים במספר התורן העצבי בקרב כל הבוגרים. חשוב לציין, הצלחנו לכרות באופן עקבי ומלא את התורנים העצביים של אזור זה על ידי 24 שעות של 0.004% טיפול בגנטמיצין כפי שדווח קודם לכן, מה שמאפשר קביעה מדויקת לאחר מכן של התחדשות התורן העצבי כפי שמוצג באיור זה, ההתחדשות נוטרה לאחר שכל המסכות העצביות בארבעת התפרים באמצע הגוף הוסרו לאחר טיפול בגנטמיצין 24 שעות והתחדשות חיובית נקבעה על ידי הופעת מינימום של שלושה תורנים עצביים בתוך תפר בשמונה שעות לאחר גנטמיצין.

לכשליש מהדגים היה סימן התאוששות כלשהו. למרות שכפי שניתן לראות כאן, עוצמת הנוירומות הייתה חלשה בתפרים המתחדשים. מספר התרנים העצביים ועוצמתם המשיכו לעלות באופן ליניארי עד שההתחדשות הגיעה לרמה 16 שעות לאחר הגנטמיצין.

אם התוצאות המתקבלות מניתוח הנוירומות אינן מובהקות סטטיסטית בין קבוצת הביקורת לקבוצת הניסוי, ניתן להרחיב את המחקרים הללו לרמה של תאי השערה הבודדים כדי לקבל רמה גבוהה יותר של רזולוציה להשוואות כמותיות בשמונה שעות, 10 שעות ו-12 שעות של זמן התחדשות. מצאנו שלקבוצות הביקורת היה טווח של אפס עד ארבעה תאי שיער לכל תורן עצבי באזור הגוף האמצעי, כפי שצפוי עבור קבוצות ביקורת כאשר נותחו כמותית. לא זוהה הבדל סטטיסטי בין נוירומות במונחים של תאי שיער לכל נוירו-תורן בנקודות זמן אלה.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב תמיד להיות מודעים לזמן. אין להשאיר דגים בג'נמיצין יותר מ-24 שעות או צבע חיוני במשך יותר מ-75 דקות לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית לחקור את התחדשות הקו הרוחבי במצב מחלה בהשוואה למצב הרגיל ולמודל דג הזברה.