אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להבין את ההתנהגות של אוכלוסיית ה-Melano blasts כשהיא נודדת לרוחב דרך האפידרמיס העוברי המתפתח. זה מושג על ידי ניתוח עור מעוברי עכבר E 14.5 כדי לאפשר תרבית אורגנוטיפית ex vivo. כשלב שני, העור המנותח מותקן במנגנון תרבית שנבנה בהתאמה אישית, המאפשר תרבית בממשק נוזלי.

לאחר מכן, החדר מותקן על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמות את אוכלוסיית פיצוצי המלאנו הנודדת. הדמיית שש תרביות העור העובריות במקביל במשך תקופה של 18 שעות מדגימה את נדידת מל אובלסטים כמו גם את התפתחות זקיקי השיער הראשוניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות ישנות יותר להדמיית אובלסטים כמו אימונוהיסטוכימיה בהכלאת התקפים, או צביעת לקטאז, הוא שאנו יכולים לבצע הדמיה חיה וכך לצפות בתאים בודדים כדי לבחון נדידה והתפשטות לאורך זמן.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי פיגמנט, כגון כיצד התנהגות פיצוצי מלון מופרעת במוטציות פיגמנטציה, וכיצד פיצוצי מלאנו מתמקמים לזקיקי שיער מתפתחים להליך זה ביום העוברי 14.5 ב-PBS קר קוצרים עוברים המבטאים פיצוצי מלנו, רקומבינאז קרי ספציפי ומבנה מדווח קרי אקטיביט פלואורסצנטי במידת הצורך, סנן את העוברים לביטוי של מדווחים פלואורסצנטיים לאחר בחירת העוברים הנדרשים, ערף את ראשם והסר את גפיהם בעזרת סכין גילוח. שמור את הרקמות הללו לצורך גנוטיפ במידת הצורך לאיסוף עור עוברי. ראשית, בצע חתך Ros coddle בארס קרוב לקו האמצע.

השלב הבא דורש כלים שתוארו על ידי קאשיווה ושות'. צור חריץ קטן בקצה השטוח של שיפוד במבוק באורך 15 ס"מ בעזרת סכין גילוח, ולאחר מכן הכנס זיפי מברשת שיניים רכים לתוך החריץ. בעזרת כלי מקל שיער אלה, הרחיקו בזהירות את העור מרקמת החיבור הבסיסית תוך כדי סיבוב העובר.

השאירו את העור מחובר לאורך קצה הגחון של החתך הראשון, אך לא בשום מקום אחר לעלות על העור. יש לבצע כמה הכנות. יש לעקר את הקליפים, התוספות וטבעות ה-O באמבט אתנול 70% למשך הלילה.

הכן את הקליפים על ידי ערבוב תחילה של חומר תרבית המחומם ל-60 מעלות צלזיוס בנפח שווה של מותך 60 מעלות צלזיוס, 2% מעלות. לאחר מכן מלא את תפסי ההדמיה בתמיסת 1%Aros המתקבלת במבט טיפתי, ואפשר להם להתקרר ולהתמצק. לאחר המוצק, מנע מהקליפסים להתייבש על ידי הוספת מיליליטר PBS לכל באר.

הקליפים יהיו טובים למספר שעות לפני השימוש. כעת הכינו את התוספות על ידי חיתוך קרום האלום מכלי האלום, והידוק הממברנה לכל תוספת סטרילית באמצעות טבעת O. הבסיס בו שוכנים מכלולי הכנסת הקליפ מנוקה על ידי ניגוב עם 70% אתנול.

לאחר מכן מניחים את ששת התוספות בבסיס. השתמש במכסה סטרילי מצלחת שש בארות כדי לסגור את התוספות בבסיס. כעת, לאחר שכמעט קילפתם את העור מהעובר הראשון, העבירו אותו לצלחת פטרי יבשה.

בעזרת מקלות השיער, משטחים את העור על הצד העורי של הצלחת כלפי מעלה ללא קפלים. ואז חותכים את העור חופשי בעזרת סכין גילוח. זה צריך להיות בערך חצי סנטימטר מרובע.

קח קליפ הדמיה מה-PBS, יבש את פני השטח של ה-aeros והנח אותו על העור כך שה-aeros נוגע בצד העורי של הרקמה. המתן 60 שניות בזמן שהדרמיס נצמד לארוס, ולאחר מכן הקניט בזהירות את שולי הרקמה במעלה צידי הקליפ. בעזרת מקלות השיער.

הפוך את הקליפ ועם נגיעה מינימלית באזור המיועד לצילום, הסר בועות ושטח את העור על הארוס. בעזרת מקלות השערות, אבטח את העור לשני צידי הקליפ עם חוט תפר משי וכמה קשרי אגודל פשוטים כאשר מהדקים, החוט צריך למשוך את העור לתוך החריץ על גבי הקליפ. כעת דחוף את הקליפ לתוך תוספת ההדמיה שהורכבה קודם לכן בבסיס.

לאחר מכן מלאו את התוספת בכחמישה מיליליטר תרבית, מדיה והמשיכו בהדמיה. ההליך חוזר על עצמו עם חמישה עוברים נוספים עבור כל אחד ממכלולי התוספות והקליפס הנותרים. המיקרוסקופ הקונפוקלי דורש תא סביבתי או תא עליון המספק 5% פחמן דו חמצני באוויר ושלב אוטומטי.

יש לחמם את החדר הסביבתי ל-37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות לפני השימוש בו. באמצעות תוכנת הבקרה, הכינו תבנית מרובת מיקומים לביצוע מהיר של ניסויי הדמיה. הגדר את ששת המיקומים לתמונה.

בדרך כלל אסוף זאק קטן בכל עמדה כל שתי דקות במשך 18 עד 24 שעות. בחירת הגדרת חור סיכה רחבה מהאופטימלית וצילום תמונה קטנה של שלוש עד חמש, זקס עוזר למנוע מהלייזר לפגוע ברקמה לאורך תקופת ההדמיה הארוכה. בעת הרכבה ל-stagה, הקפד להשתמש בתוספת הצלחת המתאימה, ולאחר מכן המשך בתוכנית ההדמיה.

תרביות עור עובריות הוכנו ונוצרו תמונות דולג זמן. על פי הפרוטוקול שצפה בערוץ YFP, מל אובלסטים נעו כמעט כל הזמן רק עצרו כדי לעבור מיטוזה תחת אור מועבר. העור המתפתח והיווצרות דפוס זקיק השיער הראשוני נצפו ברצף המרוכב.

ניתן לזהות פיצוצי מלנו, מיטוזה וזקיקי שיער מתפתחים יחד באמצעות תוסף WR MAC. עבור תמונה J, ניתן היה לעקוב אחר אוכלוסיית פיצוצי המלאנו הנודדים בכל אחד מששת רצפי ה-Timelapse שנלכדו. במקביל, ייצוג של תקיעות מלנו.

תוצאות המעקב מראות את מידת התנועה בתוך תרבית העור המתפתחת. סיכום של נתוני המעקב באמצעות אפס למעקב מדגיש את האופי האקראי של תנועות מחוז מל ומראה כיצד הן מתפשטות. לאחר שליטה בניתוח ובהגדרת התרבית, ניתן להשלים את המפעילים תוך כ-90 דקות.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית והסרטן לחקור את התנהגות הבלאסטים המלאנו במהלך ההתפתחות העוברית על מספר רקעים של עכברים מוטנטיים.