Name: מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: למד כיצד למדוד טוויסט ומומנט ב-DNA ברמת מולקולה בודדת באמצעות מלקחיים מגנטיים מסתובבים חופשי ומלקחיים מגנטיים למומנט. שיטות אלו מאפשרות מיפוי תגובות DNA לכוחות ומומנטים חיצוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי TU Delft, ארגון הולנד למחקר מדעי (NWO), הקרן למחקר בסיסי בעניין, ועל ידי קרן המדע האירופית.

<ol><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+a+single+supercoiled+DNA+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The elasticity of a single supercoiled DNA molecule.</a> Science. 271, 1835-1837 (1996).</li>
<li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+tension%3A+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421, 423-427 (2003).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+modeling+and+optimization+of+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers.</a> Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).</li>
<li>Ribeck, N., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-molecule+measurements+with+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers.</a> The Review of scientific instruments. 79, (2008).</li>
<li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+magnetic+tweezers+by+targeted+DNA+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering.</a> Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).</li>
<li>Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+for+regulating+DNA+supercoiling%3A+a+single-molecule+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective.</a> Cell. 142, 519-530 (2010).</li>
<li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level%3A+introducing+the+tools+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).</li>
<li>Ajjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+variation+in+the+C-terminal+region+of+the+fibrinogen+beta-chain%3A+effects+on+fibrin+structure%2C+fibrinolysis+and+clot+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity.</a> Blood. 111, 643-650 (2008).</li>
<li>Mierke, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-coupling+and+regulation+of+contractility+by+the+vinculin+tail+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain.</a> Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).</li>
<li>Shang, H., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+measurement+of+the+bond+lifetime-force+behavior+of+the+IgG-protein+A+specific+molecular+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).</li>
<li>Shang, H. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+magnetic+force+differentiation+for+the+measurement+of+the+affinity+of+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Magn+Mater%22%5BJournal%5D)">The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries.</a> J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).</li>
<li>Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+force+differentiation+in+the+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Implementation of force differentiation in the immunoassay.</a> Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).</li>
<li>Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-induced+growth+of+adhesion+domains+is+controlled+by+receptor+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).</li>
<li>Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+manipulation+of+chromatin+using+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).</li>
<li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).</li>
<li>Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+local+viscoelasticity+and+forces+in+living+cells+by+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers.</a> Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).</li>
<li>Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+magnetic+tweezers+studies+of+type+IB+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases.</a> Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).</li>
<li>Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVilfan%2C+ID+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22">Handbook of Single-Molecule Biophysics</a>. Hinterdorder, P., van Oijen, A. , Springer. (2009).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).</li>
<li>Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freely+orbiting+magnetic+tweezers+to+directly+monitor+changes+in+the+twist+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids.</a> Nature communications. 2, 439(2011).</li>
<li>Celedon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+measurement+of+single+molecule+torque%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers measurement of single molecule torque.</a> Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).</li>
<li>Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+track+rotational+motion+for+use+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics.</a> The Review of scientific instruments. 82, (2011).</li>
<li>Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+torque+tweezers%3A+measuring+torsional+stiffness+in+DNA+and+RecA-DNA+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments.</a> Nature. 7, 977-980 (2010).</li>
<li>Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+torque+on+a+single+stretched+and+twisted+DNA+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers.</a> Physical review letters. , 102(2009).</li>
<li>Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+magnetic+tweezers%3A+A+proof+of+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Soft magnetic tweezers: A proof of principle.</a> Review of Scientific Instruments. 82 (12), (2011).</li>
<li>Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+reveal+the+material+properties+of+three-dimensional+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami.</a> Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).</li>
<li>Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Guidelines+for+Force+Calibration+through+Spectral+Analysis+of+Magnetic+Tweezers+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data.</a> Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).</li>
<li>Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+spectrum+and+Allan+variance+methods+for+calibrating+single-molecule+video-tracking+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments.</a> The Review of scientific instruments. 83, (2012).</li>
<li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).</li>
<li>Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+torsional+properties+of+the+RAD51-dsDNA+nucleoprotein+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament.</a> Nucleic acids research. 41, (2013).</li>
<li>Janssen, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+torque+tweezers%3A+a+versatile+approach+for+measurement+of+single-molecule+twist+and+torque%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque.</a> Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).</li>
<li>Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+effects+on+the+elasticity+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).</li>
<li>Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freely+orbiting+magnetic+tweezers+to+directly+monitor+changes+in+the+twist+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids.</a> Nat Commun. 2, 439(2011).</li>
<li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).</li>
<li>Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kinesin-driven+movements+with+nanometre-scale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision.</a> Nature. 331, 450-453 (1988).</li>
<li>Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-bias-limited+tracking+of+spherical+particles%2C+enabling+nanometer+resolution+at+low+magnification%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification.</a> Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).</li>
<li>Kim, K., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+magnetic+tweezer+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements.</a> Nucleic acids research. 37, 136(2009).</li>
<li>Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofabricated+quartz+cylinders+for+angular+trapping%3A+DNA+supercoiling+torque+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection.</a> Nature methods. 4, 223-225 (2007).</li>
<li>Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+beam+fabrication+of+birefringent+microcylinders%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Electron beam fabrication of birefringent microcylinders.</a> ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).</li>
<li>La Porta, A., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+torque+wrench%3A+angular+trapping%2C+rotation%2C+and+torque+detection+of+quartz+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles.</a> Physical review letters. 92, (2004).</li>
<li>Gore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+overwinds+when+stretched%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA overwinds when stretched.</a> Nature. 442, 836-839 (2006).</li>
<li>Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in single-molecule DNA mechanics.</a> Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).</li>
<li>Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+measurements+reveal+sequence-specific+cooperative+transitions+in+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).</li>
<li>Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+measurement+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Torque measurement at the single-molecule level.</a> Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).</li>
</ol>

פטנט הקשור לעבודה זו כבר הגיש תחת PCT/NL2011/050446 התייחסות.

בשנים האחרונות, טכניקות מולקולה בודדת הוכיחו התחולה רחבה שלהם במחקר של חלבוני מנוע התהליכית ואנזימים אחרים, מניב תובנה קינטיקה שלהם וmechanochemistry הבסיסי. בהקשר של כוח ספקטרוסקופיה, תרומות חשובות שנעשו על ידי זרימת מיקרוסקופ כוח אטומי מתיחה, ופינצטה אופטית והמגנטיות. פינצטה אופטית והמגנטי (MT) הצליחה בעיקר בשילוב של גמישות רבה במונחים של מניפולציה מולקולרית גבוה במרחב וברזולוציה של זמן. כאן, אנו מתמקדים בMT, אשר יכול להחיל את שני הכוחות והמומנטים המשתרעים למולקולות ביולוגיות קשורות בין פני השטח וחרוזים פאראמגנטי 1-3. פינצטה המגנטית (MT, איור 1 א) הן טכניקת מולקולה בודדת מאוד תכליתית, כי נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר שני התכונות מכאניות של חומצות גרעין, כמו גם יחסי הגומלין שלהם עם חלבונים. יש לי MT רבים כוחים, ובם פשטות כוללת וחוסנו של היישום הניסיוני, יישום קליל של מומנט, פעולה טבעית וכיול פשוט במצב כוח קבוע 4, הרחבה במקביל מדידות 5, 6, והעדר חימום מדגם וניזקים. בהשוואה למולקולה בודדת גישות אחרות, MT מספק דרך לבצע מדידות כוח תלות בכוחות נמוכים כמו 10 ≈ Fn ויש לי את היכולת לשלוט בצורה ישירה את מידת supercoiling. בעוד MTs יש בעיקר שימש ככלי ניסיוני כדי לחקור תהליכים ביולוגיים מעורבים חומצות גרעין 7, 8, הם מצאו גם יישום במחקרים של התכונות מכאניות של חלבונים 9-13 או תאים 10, 14-17. אזכור שימושי רב זמין המתארים כיצד לבנות ולהפעיל את 4 MT, 18-20. Howevאה, MT הקונבנציונלי לא לעקוב אחר תנועה סיבובית באופן ישיר, ותוך שהם חלים מומנט, הם לא מודדים מומנט באופן ישיר. בנוסף, הם להגביל את הסיבוב החופשי של לקשור חומצות הגרעין. כאן, אנו מציגים שתי שלוחות של פינצטה מגנט. פינצטה הראשונה, המכונה באופן חופשי, במסלול המגנטית (FOMT, איור 1b) 21, מאפשר המדידות של תנודות זווית שיווי משקל ושינויים בטוויסט של מולקולות חומצות גרעין קשורות, ללא הגבלת התנועה הסיבובית סביב הציר לקשור. השני, המכונה פינצטה מומנט המגנטית (MTT, איור 1 ג), שבו יש לו את היכולת ליישם ולמדוד ישירות את שני הכוחות ומומנטים לביומולקולות אחת 22-27. בפרוטוקול הבא, אנו מניחים שהקורא יש באופי שלו / שלה מכשיר MT &quot;קונבנציונלי&quot;. אנו מפנים את הקורא לדיון לאזכור על איך לבנות ולהפעיל MT להגדיר, כמו גם consideמנות שחייבות להילקח בחשבון בבחירה של חרוזים מגנטיים, מגנטים, ואת שגרת מעקב. בנוסף, סעיפי 1 ו -2 של טקסט הפרוטוקול לתאר איך אנחנו בדרך כלל להכין ודגירת דגימת DNA לשימוש בMT, כמו גם מדידות הראשוניות שניתן לבצע על ה-DNA בודד בMT הקונבנציונלי. סעיפים 3 ו -4 לפרוטוקול הטקסט להמחיש עד כמה מכשיר MT ניתן להתאים בקלות ומשמש למדידות FOMT וMTT.

<table><tbody><tr><td>התזת חול</td><td>יישור שיניים באגם הגדול</td><td>190-070 Microetcher II</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Life Technologies</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>רכז חלקיקים מגנטיים</td><td>Life Technologies</td><td>12002D</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי לטקס לא מגנטיים (0.5 &mu; רדיוס m)</td><td>Polysciences</td><td>17010</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי לטקס לא מגנטיים (1.5 &mu; m רדיוס)</td><td>Sanbio</td><td>PV05N/2179</td><td></td></tr><tr><td>Antidigoxigenin</td><td>Roche</td><td>11 214 667 001</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים סופר-פרמגנטיים מצופים סטרפטווידין (0.25 &mu; m רדיוס)</td> <td>Ademtech</td><td>3150</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים סופרפרמגנטיים מצופים סטרפטווידין (0.5 &mu; m רדיוס, " MyOne")</td><td>Life Technologies</td><td>650.01</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים סופר-פרמגנטיים מצופים סטרפטווידין (1.4 &mu; m רדיוס, " M270")</td><td>Life Technologies</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי לטקס מצופים ביוטין (0.5 &mu; m רדיוס)</td> <td>Life Technologies</td><td>F-8768</td><td></td></tr><tr><td>מגנטים מעוקבים לפינצטה קונבנציונלית</td><td>Supermagnete</td><td>W-05-N50-G</td><td></td></tr><tr><td>מגנט גלילי ל-MTT ו-FOMT</td><td>Supermagnete</td><td>R-06-02-02G</td><td></td></tr><tr><td>מגנט צד ל-MTT</td><td>Supermagnete</td><td>S-04-07-N</td><td></td></tr><tr><td>שלב ליניארי</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-126. </td><td></td>PD</tr><tr><td>Rotary stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>C-150</td><td></td></tr><tr><td>שלב דגימה אוטומטי ברזולוציה גבוהה</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-733.2D</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לשגרות ניתוח קידוד</td><td>השגרות הכתובות בהתאמה אישית</td> של <td>Mathworks</td><td>MATLAB</td> זמינות מהמחברים</tr></tbody></table>

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

טכניקות מולקולה בודדת מאפשרות לחקור את ההתנהגות של מולקולות ביולוגיות בודדות בפתרון בזמן אמת. טכניקות אלו כוללות מה שנקרא גישות הכוח ספקטרוסקופיה כגון מיקרוסקופ כוח אטומי, פינצטה אופטית, לזרום מתיחה, ופינצטה המגנטית. בין גישות אלה, פינצטה מגנטית הצטיינו ביכולתם ליישם את המומנט תוך שמירה על כוח מתיחות מתמיד. הנה, זה בא לידי ביטוי איך כגון תצורה ניסיונית פינצטה המגנטית &quot;קונבנציונלית&quot; יכולה, באמצעות שינוי פשוט של תצורת השדה שלה כדי למזער את עוצמת השדה הרוחבי, להיות מותאמת על מנת למדוד את מידת הפיתול במולקולה ביולוגית. התצורה וכתוצאה מכך שמכונה פינצטה המגנטית באופן חופשי, במסלול. בנוסף, הוא הראה כיצד שינוי נוסף של תצורת השדה יכול להניב שדה רוחבי עם גודל ביניים בין זו של &amp; #8220; &quot;פינצטה המגנטית הקונבנציונלית ופינצטה המגנטית באופן חופשי, במסלול, המאפשרת למדוד את המומנט מאוחסן במולקולה ביולוגית באופן ישיר. תצורה זו מכונה פינצטה המומנט המגנטית. הווידאו הנלווה מסביר בפירוט כיצד ההמרה של פינצטה המגנטית הקונבנציונלית לפינצטה מגנטית באופן חופשי-מקיפה ופינצטה מומנט מגנטי יכולה להיות מושלמת, ומדגים את השימוש בטכניקות אלה. עיבודים אלה לשמור על כל נקודות החוזק של פינצטה המגנטית הקונבנציונלית תוך הרחבת צדדיות של המכשיר הזה חזק מאוד.

פינצטה המגנטית, טכניקת מניפולציה מולקולה בודדת חזקה, יכולה להיות מותאמת למדידות הישירות של טוויסט (שימוש בתצורה הנקראת באופן חופשי, המקיף פינצטה המגנטית) ומומנט (באמצעות תצורה כינתה פינצטה מומנט מגנטי) במקרומולקולות ביולוגיות. הנחיות לביצוע מדידות כאלה מקבלות, כוללים יישומים למחקר של ה-DNA וחוטי Nucleo-חלבון קשורים.

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא למדוד באופן ישיר מאמצים פיתוליים (torsional strains) או שינויים בפיתול של מולקולות DNA דו-גדיליות ברמה של מולקולה בודדת. מטרה זו מושגת באמצעות שתי בדיקות; בבדיקה הראשונה, הנקראת פינצטות מגנטיות במסלול חופשי (freely orbiting magnetic tweezers) או thumped, מולקולת DNA פונקציונלית בודדת מקושרת בין חבב מגנטי לבין משטח זכוכית.בעוד שמגנט בעל צורה גלילית מפעיל כוח המותח את ה-DNA, בתצורה זו, המיקום הזוויתי של החרוץ מוגבל רק על ידי ה-DNA הקשור, ולא על ידי המגנט, מה שמאפשר סיבוב של החרוץ כפי שמוצג על ידי החץ האדום כדי לדווח על שינויים בפיתול של ה-DNA. תנודות תרמיות סיבוביות של החרוץ גורמות למיקום ה-XY שלו להישען על טבעת מעגלית או צורת דונט. המרה של מיקום XY זה לזווית סיבוב מאפשרת לנטר שינויים בפיתול של ה-DNA הקשור בבדיקה שנייה קשורה הנקראת מלקחי מומנט מגנטי, או MTTA, שבה מגנט צד מתווסף למגנט הגלילי הראשי כדי להגביל את התנועה הזוויתית של החרוץ.בתצורת מגנט זו, ניתן להפעיל מומנטים חיצוניים על מולקולת ה-DNA הקשורה באמצעות סיבוב פשוט של מכלול המגנטים; מדידות של הסטייה במיקום הזוויתי של החרוצים לאחר הפעלת מספר סיבובים בהשוואה לתצורתם הראשונית הרפיה מבחינה פיתולית, יחד עם כיול של קשיחות המלכוד המגנטי המגביל את החרוצים ותנועתם הזוויתית, מאפשרים לכמת את הצטברות המומנט ב-DNA. היתרון המרכזי בשימוש ב-font וב-MTT על פני פינצטות מגנטיות קונבנציונליות הוא היכולת למדוד באופן ישיר מומנט ושינויים בפיתול של חומצות גרעיניות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע למכניקה של DNA ו-RNA על ידי מיפוי תגובותיהם לכוחות ומומנטים חיצוניים.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות עד לבחינת האינטראקציות של DNA עם חלבונים. לדוגמה, חלבונים האחראים על תיקון DNA, אחסון או שעתוק. הדגמה חזותית של שיטה זו ממחישה עד כמה ניתן להתאים בקלות מערך פינצטה מגנטית קונבנציונלי כדי להעניק לו יכולות חדשות. המערך ששימש את הניסויים הבאים מבוסס על מערך פינצטה מגנטית קונבנציונלי.במרכזו נמצאת תא זרימה המוארת מלמעלה על ידי LED ומדגמת תמונות מלמטה באמצעות עדשת מיקרוסקופ ומצלמת CCD. מעל תא הזרימה נמצא ראש מגנט שניתן להזיזו למעלה ולמטה ולסובב אותו באמצעות מנועים הנשלטים במחשב. התמונות ממצלמת ה-CCD מנותחות בזמן אמת על ידי תוכנת LabVIEW ייעודית כדי לקבוע את מיקומי ה-X, Y ו-Z של חרוצים הקשורים ל-DNA.תוכנת ה-lab view המותאמת אישית זמינה מהמחברים על פי בקשה. לאחר הכנת תא זרימה עם חרוזי מגנט שבאמצעותם מעגנים DNA, התקנתו על פינצטה מגנטית קונבנציונלית ובחירת חרוז ייחוס המקובע לפני השטח וחרוז שבו מעוגן מולקולת DNA בודדת באורך המתאים, ניתן להעביר את המערך למצב פונט (font mode).התחילו בהסרה ידנית של ראש המגנט השלם המחזיק את המגנט עבור תצורת הפינצטה הקונבנציונלית. החליפו אותו בראש המגנט המחזיק מגנט גלילי עבור font. בעת הנחת המגנט הגלילי המשמש עבור F בראש המגנט, הקפידו לשמור את רצועת ה-DNA שנבחרה בתוך שדה הראייה.ההיבט המורכב ביותר של פרוצדורה זו הוא יישור מדויק של המגנטים עבור גאומטריית התבנית. יישור טוב מושג על ידי הזזה שיטתית של המגנטים ובדיקת היישור לאחר כל שלב, כפי שנדגים. כעת, בצע יישור גס של המגנט בתבנית באמצעות שלבי המיקום כדי להזיז ידנית את המגנטים בתוכנת ה-lab view.לחצו על כפתור ההקלטה כדי למדוד את תנודות המיקום או את הסטיות במישורי X ו-Y. העקבות המוקלטים מוצגים על המסך בזמן אמת ונשמרים כקבצי טקסט המכילים את מידע המיקום בצירים X, Y, Z. אם הסטיות ב-XY עוקבות אחר קשת כפי שמוצג כאן, פירוש הדבר שהמגנט הגלילי אינו מיושר כראוי; המשיכו להזיז את המגנט הגלילי בכיוון המתאים ולבצע מדידות עד שתנודות ה-XY ישרטטו תבנית מעגלית מלאה, המעידה על כך שהושגה יישור גס. הבא.אם הדבר נדרש לניסויים נוספים, בצע כיוון עדין במיקוד באמצעות במה אוטומטית ברזולוציה גבוהה להזזת תא הזרימה, כך שהמגנט הגלילי ימוקם בטווח של כ-10 microns מהחבב. לאחר מכן, כפי שנעשה קודם לכן, רשום את סטיות ה-XY. המשך להזיז את הבמה ולרשום את הסטיות עד שהתנודות על הטבעת המעגלית יהיו כמעט אחידות.כדי לאמת את היישור הסופי, השתמשו בסקריפט MATLAB הזמין מהמחברים לפי בקשה כדי להציג את התנודות בהיסטוגרמה או בתרמוגרמה ולבדוק את האחידות שלהן. כדי לבצע מדידות של מומנט פיתול (torque) של DNA, הסירו את המגנט הגלילי המשמש ליישור והחליפו אותו במגנט גלילי בתוספת מגנט צד קבוע. עבור ה-MTT, ודאו שחוט ה-DNA שנבחר נשאר בתוך שדה הראייה.הזינו את מספר הסיבובים המגנטיים ואת קצבם בפאנל המתאים בתוכנת ה-LabVIEW השולטת. כאן, מספר הסיבובים מוגדר לחמישה והקצב מוגדר ל-0.1 hertz. הגדרות אלו יגרמו למגנטים להסתובב באיטיות במהלך המדידה.בשלב הבא ב-matlab, השתמשו בסקריפט למעקב זוויתי המבוסס על ניטור מיקום XY, אשר זמין מהמחבר לפי בקשה. יופיע גרף המציג את התנודות הזוויתיות כפונקציה של הזמן, theta T. לאחר שהכל הוגדר ב-lab view, לחצו על כפתור ההקלטה.העקבות יופיעו בזמן אמת כפי שקרה קודם לכן. ב-matlab, השתמש בסקריפט MATLAB כדי להפיק על המסך גרפים של הזווית theta T וגובה החרוג Z של עקבת T, עם התאמה גאוסיאנית לאות הזווית כדי לקבוע את סטיית התקן של התנודות הזוויתיות. Sigma theta.סקריפט זה קובע ישירות את קשיחות המלכוד הסיבובי (torsional trap) מתוך השונות של התנודות הזוויתיות. סיגמא תטא בריבוע ברדיאנים. באמצעות הנוסחה המוצגת כאן, שימו לב שב-MTT נהוג להשיג קשיחות מלכוד סיבובי של 10 עד 1000 pico newton nanometer per radian, ערך הנמוך בהרבה מזה של פינצטה מגנטית קונבנציונלית.כאן, לדוגמה, קבענו כי קשיחות המלכוד הסיבובית היא כ-52 pN nm per radian. קשיחות המלכוד הסיבובית של פינצטות המומנט המגנטיות בהשוואה לפינצטות מגנטיות קונבנציונליות הופכת אותן למתאימות למדידות של מומנט של מולקולה בודדת, אך משמעותה היא גם שהמומנט המקסימלי שניתן להפעיל מופחת. מכאן עולה כי ה-MTT אינה יכולה לאזן מומנטי גרר הנגרמים מסיבוב מהיר.לפיכך, יש להיזהר שלא לסובב במהירות רבה מדי. בדרך כלל אנו מסובבים בקצב של כ-0.1 hertz. לאחר מכן, מפעילים עומס על קשרי ה-DNA על ידי סיבוב איטי של המגנטים למספר סיבובים קבוע; עם הקלטת עקבה נוספת של תנודות זוויתיות, מספר הסיבובים של המגנטים וקצבן הסיבוב מוזנים שוב בפאנל המתאים של תוכנת ה-lab view השולטת.כאן מספר הסיבובים נקבע ל-40 והקצב נקבע ל-0.1 hertz. פעולה זו תגרום למגנטים להסתובב באיטיות במהלך המדידה כדי לקבוע את המומנט שהצטבר בחוט החומצה הגרעינית. לאחר N סיבובים, נשתמש בנוסחה המוצגת כאן, כאשר הסוגריים הזוויתיים מייצגים את הממוצע ואת theta zero.ו-theta N הם הזווית באפס סיבובים המתאימה לקישור רפוי פיתולית והסיבובים, בהתאמה. חזור על השלבים שבהם מסובבים את המגנטים ורשום רמה של תנודות זוויתיות ככל שיידרש כדי לקבוע באופן מלא את תגובת המומנט של המולקולה בריצת מדידה אחת. כדי למדוד שינויים בפיתול של ה-DNA המושרים על ידי חלבון התיקון RAD 51, שקישורו ל-DNA דו-גדילי both lengthens and unwind.DNA rad 51 הוסף למולקולת DNA המקובעת בחזית. כפי שמוצג כאן, החרוד מתווה מסלול ספירלי. ניתן לפרק תנועה זו לרכיבים המתארים כיצד ה-DNA מתארך ונפתח עם הזמן.כדי למדוד את המומנט המא格納 ב-DNA באמצעות ה-MTT, נמדדו המולקולה בעלת סיבובים יתר (over wound) וסיבובים חסרים (under wound) באופן סיסטמטי, וכן נמדדו התנודות הזוויתיות עבור כל מספר של סיבובים שהופעלו. סטיית התקן של התנודות הזוויתיות, המשקפת את קשיחות המלכוד הזוויתית, אמורה להיות בלתי תלויה במספר הסיבובים שהופעלו. כאן, סטיית התקן היא כ תשעה מעלות, כפי שמוצג כאן.הממוצע של המיקומים הזוויתיים משתנה באופן סיסטמטי בהתאם למספר הסיבובים המופעלים תוך שימוש בקשיחות מלכוד זוויתית קבועה. השינויים בזווית הממוצעת מומרים למומנט פיתול, מה שמעניק את מומנט הפיתול האגור ב-DNA אל מול הסיבובים המופעלים. הקלטה סימולטנית של מיקום ה-Z של החרוזיים מעניקה את אורך ה-DNA אל מול הסיבובים המופעלים.שני העקומים הללו יחד מספקים את התגובה המכנית המלאה של ה-DNA לפני winding-יתר (overwinding) ומתח חסר (underwinding). לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן המדידה של פיתול (twist) ומומנט פיתול (torque) במולקולות ביולוגיות באמצעות פינצטות מגנטיות בעלות מסלול חופשי (freely orbiting magnetic tweezers) ופינצטות מומנט מגנטיות (magnetic torque tweezers), ועד לבדיקות חד-מולקולריות חדשניות שניתן להסב אליהן בקלות פינצטות מגנטיות קונבנציונליות. פיתוחן של טכניקות אלו סולל את הדרך למחקר בתחום הביופיזיקה, למשל, לחקר התכונות הפיתליות של DNA או RNA ולצפייה בתהליכים כגון דחיסת DNA ותיקונו. ניתן לשפר את טכניקות ה-font וה-MTT באמצעות שיטות נוספות כמו זיהוי פלואורסצנציה כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון קביעת המיקום הספציפי של חלבון על גבי DNA קשור.

magnetic-tweezers-for-the-measurement-of-twist-and-torque

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

פיתחנו מכשיר (טוויסטר) ללמוד את הרגולציה על פעילות השריר טוניק במהלך תחזוקה יציבה פעיל. טוויסטר אמצעי התנגדות torsional ותגובות שרירי בנושאים עומד במהלך סיבוב של ציר הגוף. המכשיר ניתן להגדיר בגמישות ללמוד היבטים שונים של בקרה טוניק פני הצוואר, גזע, ו / או ירכיים.

שיטה למדוד טון של שרירים נטיית ציר וסמוך

פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

במאמר זה אנו מתארים מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה המבצע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח בקצב מרבי של 1.2 קילוהרץ. אנו מציגים את היישום שלה על סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE כמערכות מודל, אבל זה יהיה ישים גם על מולקולות אחרות המעורבות באירועים מכנוביולוגיים.

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

פרוטוקול זה מדגים שימוש בפינצטה מגנטית של מולקולה אחת כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים קושרי DNA טלומריים (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] ו-TRF2) לבין טלומרים ארוכים שהופקו מתאים אנושיים. הוא מתאר את שלבי ההכנה לטלומרים ולגורמים קושרים חוזרים טלומריים, ביצוע ניסויים במולקולות בודדות ושיטות איסוף הנתונים וניתוחם.

ניתוח אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות באמצעות פינצטה מגנטית של מולקולה אחת

חלקיקים פלורסנט המיוצר במעבדה שלנו משמשים ריכוזי הדמיה יונים והנתיבים יון במערכות ביולוגיות כגון תאים במהלך נוזל איתות ביניים במהלך הומאוסטזיס פיזיולוגיים.

חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

אנו מדגימים את השימוש בפינצטה אופטית צירית קבועה כוח כדי לחקור את התכונות המכאניות של מולקולות דנ"א קצרות. על ידי מתיחת DNA axially, אנחנו למזער מכשולים וממצאים שמקורם במניפולצית רוחב קונבנציונלית סטריים, ומאפשרים לנו לחקור מולקולות דנ"א קצרה כמו ~ 100 ננומטר.

מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

הליך מדגים את המתודולוגיה של elastography תהודה מגנטית לניטור התוצאה מהונדסים של השומן ואת בונה רקמות osteogenic מהונדסים באמצעות הערכה מקומית לא פולשנית של תכונות מכניות באמצעות תהודה מגנטית elastography מיקרוסקופיים (μMRE).

תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

פינצטה אופטית שימשה לחקר קיפול RNA על ידי מתיחת מולקולות בודדות מקצות 5' ו-3' שלהן. כאן מתוארים נהלים נפוצים לסינתזה של מולקולות RNA לפינצטה, כיול המכשיר ושיטות למניפולציה של מולקולות בודדות.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

המאמר מרחיב את הדגימה, חיישן הכנת נהלים, הפרוטוקולים עבור שימוש המתקן מבחן במיוחד עבור מחשבים דינמי הדמיה עם מדידות BH באתרו על מנת להשיג איכות דפוס התחום האופטימלי, מדויק BH מדידות.

פרוטוקול עבור הדמיה מגנטית תחום עם בחיי עיר היסטרזיס מדידת וההתקנה ממוטבת

למד כיצד למדוד טוויסט ומומנט ב-DNA ברמת מולקולה בודדת באמצעות מלקחיים מגנטיים מסתובבים חופשי ומלקחיים מגנטיים למומנט. שיטות אלו מאפשרות מיפוי תגובות DNA לכוחות ומומנטים חיצוניים.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

גלה סרטונים נוספים