רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג'ין RNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא לרצף 16 S-R-R-N-A. גנים מוגברים מדגימות סביבתיות באמצעות מכונת ריצוף שולחנית. זה מושג על ידי הגברה ראשונה של הגן 16 S-R-R-N-A באמצעות פריימרים ששונו.

השלב השני הוא לטהר את תוצרי ההגברה, לכמת אותם ולאגד אותם. לאחר מכן, מאגר האמפליקון מחובר לכדורי רצף המוגברים באופן משובט במהלך PCR אמולסיה ומרוצפים על רצף ספסל. השלב האחרון הוא ניתוח מערכי נתוני הרצף המתקבלים.

בסופו של דבר 16 S-R-R-N-A. ריצוף אמפליקון גנים משמש לקביעת ההרכב והמגוון של הקהילה המיקרוביאלית בדגימה סביבתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו DGG או ריצוף שיבוט, הוא שהיא נותנת פרספקטיבה עמוקה וברורה יותר על הרכב ומגוון הקהילה המיקרוביאלית.

שיטה זו יכולה לעזור לך לענות על אחת משאלות המפתח באקולוגיה מיקרוביאלית, מי שם כדי להתחיל את הפריימרים קדימה ואחורה? שני ה-X hot start tac plus master mix והדגימות, רצף הפריימרים קדימה ואחורה מתאימים לתבנית המוצגת. הרצף מכיל מתאמים ספציפיים לטורנט יונים.

מקש רצף לכיול עוצמת האות בתחילת הרצף. הפעל פריימר ספציפי לתבנית וברקוד של 10 זוגות בסיסים. לאחר מכן מערבבים היטב את הפריימרים והדגימות לפני השימוש.

הכן תגובת PCR. מערבבים 20 מיקרוליטר לתגובה המכילה 0.5 מיקרומולר של פריימר הפוך, 0.4 מיליגרם למיליליטר BSA ו-X Hot Start tac אחד בתוספת תערובת מאסטר. לאחר מכן, פיפטה 18.5 מיקרוליטר של תערובת המאסטר לכל צינור PCR מוסיפים 0.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פריימר קדמית של 20 מילי-מולרית המכילה ברקוד שונה לכל אחת מהדגימות שירוצפו יחד.

לאחר מכן, מחוץ למכסה ה-PCR, הוסף מיקרוליטר אחד של דגימה בריכוז של 1 עד 10 ננוגרם למיקרוליטר לצינור ה-PCR. הגדר תוכנית עם דנטורציה ראשונית של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.

55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. ההתארכות הסופית צריכה להיות ב 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הנח את הצינורות במכונת PCR והתחל את התוכנית.

ניתן למקם את מוצרי ה-PCR הסופיים בארבע מעלות צלזיוס או שלילי 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הכינו ג'ל 2% ארוס באמצעות המסרקים הגדולים ביותר שיש. לאחר מכן מערבבים חמישה מיקרוליטרים של שישה x צבע טעינת ג'ל עם כל תגובת PCR וטוענים את הדגימות על הג'ל המפרידים כל דגימה בריק.

ובכן הפעל את הג'ל ב 70 וולט למשך 50 דקות. לאחר הפעלת הג'ל יש לצלם את הג'ל ולחתוך את הרצועות בעזרת אזמל. כל פס צפוי להיות בסביבות 250 זוגות בסיסים, המכיל מוצר של 190 זוגות בסיסים עם 63 זוגות בסיסים המרכיבים את המתאמים והברקודים.

לאחר מכן, שקלו את הרצועות שנכרתו והמשיכו במיצוי הג'ל וטיהור מוצרי ה-PCR. השתמש בערכה כגון ערכת מיצוי הג'ל המהירה של הקיאק, ואז כמת כל מוצר PCR עם פיקו ירוק ובצע דילולים כדי לקבל תמיסת מלאי בחמש פעמים 10 עד המולקולה התשיעית למיקרוליטר, שהם בערך ננוגרם אחד למיקרוליטר. אם חלק מהדגימות מראות הגברה נמוכה יותר, התאם את הריכוז לפי הצורך, אך אל תרד מתחת ל-1.57 כפול 10 למולקולות השביעיות למיקרוליטר.

מאגר 10 מיקרוליטר מכל מוצר PCR מדולל כדי לקבל מאגר מולרי שווה של דגימות, הכינו מאגר נפרד אחד לכל אחת מריצות הריצוף המתוכננות. ניתן לשמור את מוצרי ה-PCR המאגרים במקפיא עד לשימוש לביצוע תחליב. PCR תחילה, יש לדלל את מוצרי ה-PCR המאגרים ל-26 פיקה-מולר בנפח של 25 מיקרוליטר ולעבד את הריאגנטים מערכת תבנית PGM יונים.

לאחר מכן עבדו במכסה המנוע PCR והכינו את האמולסיה PCR. מערבבים את מוצרי ה-PCR המאגרים וניתן להוסיף את חלקיקי הכדור בעת עבודה על הספסל. מערבבים היטב את התמיסה ואז מכניסים את התערובת למחסנית פילטר ומעליו בזהירות שמן תחליב.

לאחר מכן, הפוך לאט את מחסנית המסנן וטען את המחסנית על מכשיר ה-PCR האוטומטי של תחליב. לאחר מכן בחר את התוכנית המתאימה והתחל את ההליך. לאחר השלמת ה-PCR האוטומטי של תחליב, הסר את הסופרנטנט מצינורות האיסוף ואחזר את חלקיקי הכדור בתחתית הצינורות. החייאה.

השעו את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה וקחו מיניקוט של שני מיקרוליטר לכימות הספרייה. כדי לרצף את מוצרי ה-PCR, הכן תוכנית ריצת רצף המציינת את פרטי ריצת הרצף. לאחר מכן פתח את המכשיר, לחץ על אתחול וכאשר תתבקש, התקן את תמיסת הכביסה מספר שתיים, תמיסת הכביסה מספר אחת ואת תמיסת מאגר ה-pH האוטומטית לתוך מכשיר הרצף.

לאחר מכן, המשך בהליך האתחול וכאשר תתבקש, הוסף את הנוקלאוטידים D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-P ו-DTTP לצינורות ה-50 מיליליטר המתאימים להם. לאחר מכן הברג את הצינורות על מכונת הרצף והמשך בהליך האתחול. לאחר השלמת הליך האתחול, התחל מיד את הליך טעינת הדגימה כדי להכין את הדגימות לריצוף.

צנטריפוגה את הכדורים המועשרים מהאמולסיה PCR ב-15, 500 פעמים G למשך 1.5 דקות כדי לאסוף את הכדורים בתחתית הצינור. לאחר מכן הסר את ה- S natin והשאיר בדיוק שלושה מיקרוליטר בצינור. לאחר מכן, הוסף שלושה מיקרוליטרים של פריימר הרצף לצינור ופיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את החלקיקים ולערבב היטב את התמיסה.

דגרו את הצינור במשך שתי דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן במשך שתי דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. בסיום הדגירה מוסיפים מיקרוליטר פולימראז אחד ומערבבים היטב ואז דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בזמן שהתערובת דוגרת, טען את שבב הריצוף על הרצף ובצע בדיקת איכות שבב.

לאחר מכן מוציאים את הנוזל מהשבב בעזרת צנטריפוגה מהירה ומיקרו צנטריפוגה. טען את הדגימה בשבב על ידי פיזור איטי של שבעה מיקרוליטרים מתערובת כדור האנזים והימנעות מהכנסת בועות לשבב. לאחר טעינת הדגימה בשבב, הכנס את השבב למכשיר והתחל את ריצת הרצף.

כדי להתחיל בניתוח הנתונים, התחבר לשרת נתוני הרצף והורד את קובץ ה- Q המהיר. לאחר מכן צרו טאב קובץ אוליגוס מופרד המכיל את פרטי הפריימר והברקוד. לאחר מכן, הורד את קבצי העזר של הגנים הירוקים מאתר האם, הפעל את האם ובצע את הניתוח.

המר את קבצי ה-FASTQ לקובץ מהיר ואיכותי באמצעות הפקודה המוצגת בתחתית המסך. קבע את החברות בקבוצה של כל רצף וחתוך את הרצפים. באמצעות פקודה זו, לאחר מכן סווג את הרצפים בטקסונומיה של הגנים הירוקים.

באמצעות פקודה זו, התפוקה הממוצעת בעת ריצוף באמצעות ספינה של שלוש 14 על PGM של טורנט יונים היא בסביבות 0.3 עד 0.5 מיליון. קריאות באיכות טובה לאחר סינון התוצאות באם. להלן פירוט אופייני של מספר הקריאות לאחר כל שלב בהליך ריצוף הדור הבא המוצג כאן הוא הרכב הקהילה הממוצע ברמת מחלקת הפילום של כל 36 הדגימות הסביבתיות המרובות שהוגברו עם פריימרים המכוונים לאזור V 3 עד 4 של הריבוזום 16 s ונותחו באמצעות אם מאסטר אחד.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרצף 16 מועמדים ל-RNA ריבוזומלי באמצעות מכונת ריצוף שולחנית.