אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין תרביות ex vivo של דרוזופילה, אשכי אישונים וציסטה בקו הנבט לביצוע מחקרי הדמיה חיים וטיפולי מעכבים לניתוח פוסט מיוטי עבור מיוגנזה, זה מושג על ידי ניתוח אשכים שלמים מתחילת Puy 24 שעות לאחר היווצרות הפוריום. השלב השני הוא לנתח ציסטות בודדות מהאשכים הללו, ואז ניתן להשתמש באשכים שלמים וציסטות בודדות לניסויי הדמיה חיים. לחלופין, השלב הבא הוא לדגור על האשכים השלמים או ציסטת קו הנבט עם תרכובות מעכבות.

בסופו של דבר, צביעה חיסונית של דלעת, אשכים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשים לניטור השפעת הטיפול. היתרון העיקרי של טכניקת תרבית ex vivo זו על פני השיטות הגנטיות הקיימות הוא שהיא מאפשרת גישה לזרע דילו בשלבים פוסט-מיוטיים. באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו נאבקים מכיוון שכמה חוויות היו צריכות לנתח ולטפל ברקמות האישון.

כדי להתחיל בניסוי, חלקו טיפות של 80 מיקרוליטר של מגנים ומדיום חרקים של סן M שלושה עם סרום בקר עוברי ואנטיביוטיקה לצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. לאחר מכן, בעזרת זוג מלקחיים רחב, בחרו גולם והעבירו אותו לטיפת מדיום על המנה. לאחר מכן העבירו את החומרים למיקרוסקופ סטריאו המצויד בתאורת סיבים אופטיים.

הקפידו לא לחמם את האשכים מעל טמפרטורת החדר במהלך החיתוך באמצעות מלקחיים מספר חמש. תפוס את הגולם בקצה האחורי ביותר שלו והחזק אותו במקומו. תפוס את הכדורים הקדמיים עם זוג מלקחיים נוסף ופתח את האישון סלסול בקצהו הקדמי.

קלף את נרתיק האישון עד שלפחות חלק מבית החזה נחשף. המשיכו להחזיק את הגולם במקומו בקצה האחורי ביותר שלו, ושחררו את הלחץ הפנימי של הגולם על ידי החדרת שתי זרועות של זוג מלקחיים לאזור הראש של הגולם. לאחר מכן, קרעו את הגולם על ידי פתיחת המלקחיים והזזת המלקחיים בכיוון הקדמי וודאו שהפתח גדול ככל האפשר בניסיון הראשון.

הימנע מפגיעה בגולם בקצה האחורי שלו לפני שחרור הלחץ. מכיוון שהדבר עלול לגרום לכך שהאשכים יידחפו ישירות דרך הפתח הקטן וייפגעו. לאחר פתיחת הגולם, הלחץ הפנימי המשתחרר של הגולם לוחץ החוצה גלומרט של תאי גוף ורקמות שומן דרך הפתח הגדול.

לאחר מכן הגדל את גודל הפתח באמצעות זוג מלקחיים אחד והימנע מסחיטת הגולם עם המלקחיים מכיוון שהדבר עלול לפגוע באשכים. לאחר מכן, החזיקו את הגולם בקצה האחורי ביותר שלו קרוב. זוג המלקחיים השני ופסים בעדינות את תוכן הגולם מאחור לקדמית כדי לשחרר את האשכים מהגולם.

בדוק אם אשכי האישונים נדחפו החוצה. הם לא יחוברו לשום רקמה אחרת. לאחר 24 שעות A PF אוסף את האשכים עם קצה פיפטה חתוך מראש של 200 מיקרוליטר.

העבירו רק כמות קטנה מהמדיום כדי להפחית את מספר תאי השומן בגוף הנישאים עם האשכים. ואז מניחים את האשכים לבינוני בכלי תרבות טרי. שטפו את האשכים מספר פעמים במדיום עד שיישארו רק מעט תאי גוף שומן להדמיה חיה.

העבירו את האשכים לתבנית תרבית עם תחתית זכוכית עם מדיום והשתמשו במיקרוסקופ הדמיה הפוך כדי להתחיל בדיסקציה. העבירו אשך אישון אחד או יותר לתבנית תרבית עם תחתית זכוכית מלאה במדיום. השתמש במיקרוסקופ סטריאו עם תאורת סיבים אופטיים ושתי מחטי נירוסטה לדיסקציה של ציסטות זכריות.

כאשר מחט אחת מוצמדת בזהירות כלפי מטה, אשך אחד נמצא בקצה הקדמי או האחורי שלו ומחזיק אותו במקומו. הכנס את המחט השנייה לאשך ושבש את מעטפת האשכים על ידי הזזת המחט הצידה, מה שישחרר רבות מהציסטות. המשך להחזיק אשך במקומו עם מחט אחת.

לאחר מכן השתמש במחט השנייה כדי להוציא בעדינות את הציסטות הנותרות מהאשך. לאחר מכן ציסטות מצטברות נפרדות. שימוש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר על ידי העברת הציסטות לכלי מתורבת טרי עם מדיום.

לאחר מכן העבר את הצלחת המתורבתת למיקרוסקופ הדמיה הפוך להדמיה חיה של ציסטות בודדות. פזרו שוב את הציסטות בעזרת מחט במידת הצורך, זהו את שלב הציסטות באמצעות ניגודיות פאזה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התמקדו בציסטה בשלב הרצוי.

אשר את המיקוד ואת מיקום הציסטה לעתים קרובות. במהלך ניסויי הדמיה ארוכים יותר, הציסטות אינן נדבקות לתחתית צלחת התרבות. מתכוון לצוף מחוץ לפוקוס.

מלאו כל באר של צלחת תרבית תאים של 24 בארות ב-500 מיקרוליטר של מדיום לניסוי אחד של 12 שכפולים. לאחר מכן העבירו אשך אישון אחד לכל באר באמצעות קצה פיפטה חתוך מראש של 200 מיקרוליטר. לאחר מכן, בדוק אם יש פרוטמין באשכים המבודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.

האשכים צריכים להיות נקיים מפרוטמין, אות B-E-G-F-P, מה שמעיד על כך שמתג היסון לפרוטמין או HP לא התרחש באף אחת מהציסטות. החלף אשכים שכבר מראים ציסטות חיוביות. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום המכיל חומצה אנדו קרית, התרכובת המעכבת כדי להגיע לריכוז סופי של 150 מיקרומולר במיליליטר אחד לכל אחת מ-12 הבארות הראשונות.

השתמש בבארות הנותרות כבקרות לא מטופלות על ידי הוספת 500 מיקרוליטר מדיום עם ממס. לאחר מכן דגרו את הצלחת בחמש מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בחושך. בדוק שוב אם יש פרוטאמין באשכים המודגרים.

אשכי הבקרה אמורים כעת להראות ציסטה אחת או יותר של פרוטמין, B-E-G-F-P, מה שמעיד על מעבר דרך מתג HP. לאחר מכן, בעזרת פיפטה עם קצה של 200 מיקרוליטר, העבירו את האשכים לשקופיות מצופות פולי ליזין. בצע תכשירי דלעת וצבוע בנוגדנים פלואורסצנטיים.

בעקבות פרוטוקולים שפורסמו, התקבלו תמונות ניגודיות פאזה של אשכי דרוזופילה בשיטת דיסקציה זו. זהו אשכי הר שלם מעוך מעט של גולם דרוזופילה. 24 שעות לאחר היווצרות PY או PF זרעונים מוגבלים לקצה הקדמי מתחת לאזור הרכזת.

האשך הנותר מלא בזרעונים, זרעונים בשלב הנוכחי של נבין עם גרעינים עגולים וזרעים בשלבים מתארכים עם שכבות דגל גדלות של ניגודיות פאזה, התקבלו תמונות פלואורסצנטיות של EGFP ו-RFP מאשכי אישון ביתיים כדי לזהות H שני A-V-D-R-F-P ופרוטמין B-E-G-F-P ב-24 שעות A PF. אף אחד מהזרעונים לא עבר את החלפת HP לעתים קרובות. האשכים שנותחו בשלב זה מכילים מבנה אוטופלואורסצנטי. אשך אישון מנותח 36 שעות PF מציג את הפרוטמין הראשון, ציסטה חיובית B-E-G-F-P.

אשכי אישון 48 שעות ל-PF יש מספר ציסטות בקו הנבט עם גרעינים חיוביים לפרוטמין גלויים. ניתן להקליט תמונות חיות של אשכים שלמים המתפתחים בתרבית. בשיטה זו, אשך אישון נותח 45 שעות PF מודגר במדיום במשך שש שעות וצולם כל חמש דקות.

בתוך מסגרת זמן זו, מספר ציסטות של זרעונים יוצאות משלב החלפת HP ומציגות אות פרוטמין בהיר B-E-G-F-P. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשיג אשך אישון מוקדם וציסטה בודדת בתרבית על מנת לבצע הדמיה in vivo או טיפולי מעכבים.