כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את הטיטר הנגיפי של וירוס מתויג לוציפראז באמצעות שיטת כימות תפוקה גבוהה. זה מושג על ידי העברת הסופרנטנט של הדגימות שיש לטיטר, כמו גם עקומה סטנדרטית ויראלית לקו תאים מתירני כדי לאפשר ביטוי לוציפראז. כשלב שני, ניתן להוסיף זורין RESA לדגימות המקוריות, שישמשו להערכת כדאיות התא.

לאחר מכן, לאחר זמן דגירה מתאים, מוסיפים לוציפריאן לתאים על מנת לכמת על ידי זוהר. התוצאות מראות את כמות הנגיף בדגימה על סמך ביטוי לוציפראז. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טיטרינג פלאק, הוא שניתן לעבד מספר רב של דגימות במהירות ובמקביל.

ניתן להרחיב שיטה זו גם לנגיפים המבטאים לוציפראז שאינם מקרקשים. מכיוון שהיא אינה תלויה בהיווצרות פלאק, ניתן לשלב בקלות קריאה של ציטוטוקסיות תאים בזרימת העבודה ועשויה להיות שימושית בהקשר של מסך תרופות. המדגימים את ההליך יהיו ונסה, רמיה וקולין, שלושה סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי, תחילה לבצע זיהומים באמצעות VSP דלתא 51, המבטא את לוציפראז הגחלילית ב-96.

ובכן, צלחות תרבית רקמות מהצלחות הללו יעברו טיטרציה לאחר זמן דגירה מתאים 24 שעות לפני הטיטר. הכן תרחיף של תאי Vero בריכוז של 2.5 כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר ב-DMEM המכיל 10% FBS 30 ערימות מילי-מולריות, ו-1% סטרפטומיצין C של פניצילין, 2.5 כפול 10 לתאים הרביעיים ב-96. ובכן צלחות תחתונות שטוחות לבנות ומוצקות באמצעות מתקן מיקרופלייט להכנת מתלה התאים, נקו קלטת מתקן מיקרופלייט על ידי שטיפת הצינור ב -50 מיליליטר מים סטריליים.

לאחר מכן מלאו את קווי מתקן המיקרופלייט במתלה תאים, ואפשרו לחמישה מיליליטר של מתלה התא לזרום דרכם. בחר תוכנית שתחלק 100 מיקרוליטר לכל באר של צלחות 96 בארות עם קירות לבנים וחזור על הפעולה לפי הצורך עבור צלחות נוספות. זרע גם כמה בארות בצלחת תחתונה לבנה שקופה 96 לאימות בריאות התא וצפיפותו.

בסיום, שטוף את התאים בחזרה למיכל המקורי. נקה את הקסטה על ידי הפעלת 50 מיליליטר של אתנול 70%, ואחריו 50 מיליליטר מים סטריליים חמים דרך הצינור. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני לחה של 5%.

הכן עקומה סטנדרטית של VSV Delta 51 ב-DMEM ללא סרום כך שהריכוז הסופי של יחידות פלטפורמה למיליליטר לאחר ההעברה לתאי Vero יהיה כדלקמן. הכן 50 מיקרוליטר מכל ריכוז לצלחת של תאי Vero, בתוספת 10% נוספיםניתן להעביר את העקומה הסטנדרטית לצלחת באר עמוקה של 96. לאחר מכן, בדוק את תאי ה-Vero המצופים בצלחת 96 הבאר התחתונה השקופה תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר שחד-שכבות הן לפחות 95% העברת טרנס קונפלואנט.

25 מיקרוליטר של סופרנטנט דגימה על תאי Vero היושבים בלוחות הקירות הלבנים באמצעות פיפטר רב-ערוצי 12 ערוצים ב-25 מיקרוליטר מכל דילול של העקומה הסטנדרטית לתאי Vero בשני העמודים המיועדים. צנטריפוגה את הצלחות למשך חמש דקות בחום של 430 גרם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך חמש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של פחמן דו חמצני של 5%.

בשלב זה, הוסף זורין בכמות השווה ל-10% מהנפח בכל באר של צלחת 96 בארות המכילות נגיף ותאים. לאחר שעתיים עד ארבע שעות, קרא והקלט את האות עם קורא לוחות פלואורסצנטי תוך שימוש ב-530 עד 560 לעירור ו-590 לדוח פליטה. כדאיות התא עבור המדגם על פי הנוסחה הבאה.

30 דקות לפני תום הדגירה של חמש שעות, הכינו את הלוציפר לקבלת תמיסה של שני מיליגרם למיליליטר במי מלח סטריליים עם פוספט. הגן על התמיסה מפני אור לאחר תקופת הדגירה של חמש שעות ב-25 מיקרוליטר לוציפר לכל באר של תאי Vero בלוחות המוצקים הלבנים עם מתקן אוטומטי המשולב בלומינומטר. קרא את הלוחות עם הפרמטרים הבאים.

יש לנער במשך חמש שניות ולהמתין 30 שניות. קרא זוהר בערך חשיפה מתאים ללוכסן ברגישות קבועה, ולאחר מכן רשום ושמור את עוצמת האור הביולוגי הכמותי. אם נעשה שימוש במתקן אוטומטי כדי להוסיף לוציפריאן, להושיב את הלוציפריאן ולטשטש את הקווים במים סטריליים או בתוצאות מדויקות, לפתור את הרגרסיה הלא ליניארית כדי ליצור משוואת גבעה מהעקומות הסטנדרטיות.

החל משוואה זו על הדגימות המסומנות כדי לחשב יחידות ביטוי ויראליות. התוצאות של עקומה סטנדרטית טיפוסית של VSV Delta 51 מוצגות כאן, או ניתוח רגרסיה לא ליניארית של פרמטרים יצר עלילת ברד שממנה ניתן לבצע אינטרפולציה של יחידות יוצרות קלט לא ידועות. טיטרים נגיפיים שהתקבלו על ידי בדיקת פלאק סטנדרטית על תאי Vero הושוו לטיטר ויראלי מחושב מאותן דגימות.

דגימות בדיקת לוציפראז בתפוקה גבוהה מקורן בניסוי שבו נעשה שימוש בכימיקלים שונים כדי לשפר את השכפול וההתפשטות של תאי VSV Delta 51 ו-7, 8, 6 0. המתאם הליניארי בין טיטרים ליחידות ביטוי ויראליות עם R בריבוע של 0.8083 וציון Pearsons R של 0.899 מוצג כאן. נתוני ציטוטוקסיות תאים אופייניים המתקבלים מבדיקה מטבולית מוצגים כאן עבור 7, 8 6 0 תאים שטופלו בכימיקלים לפני ההדבקה.

עם VSV Delta 51, עקומות סטנדרטיות טיפוסיות המתקבלות עם וירוס הרפס סימפלקס, וירוס חיסון ווירוס הקשור לאדנו, כולם מבטאים לוציפראז גחלילית מוצגים כאן. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבצע מסכי תפוקה גבוהה של ספריות תרכובות בשילוב עם הווירוס המעניין שלך כדי ליצור טיטרים ונתוני ציטוטוקסיות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לדלל כראוי את העקומה הסטנדרטית מכיוון שזה קריטי לאינטרפולציה של יחידות ביטוי נגיפי.

אל תשכח שעבודה עם וירוסים חיים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון עבודה בארון בטיחות ביולוגי ולבישת ציוד המגן האישי המתאים בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך טיטרים נגיפיים באמצעות שיטת כימות תפוקה גבוהה המבוססת על ביטוי של מדידת טרנסגן לוציפראז של ביולומינסנציה באינטרפולציה של יחידות ביטוי נגיפיות לא ידועות. מדגימת עקומה סטנדרטית, ניתן לקבוע ציטוטוקסיות בו זמנית על ידי בדיקת כדאיות מתאימה.