העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

תאי גזע סרטני (CSCS) הם מעורבים בהישנות גידול עקב chemoresistance. יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול לבחירה והרחבת CSCS משורות תאי סרטן השחלות. על ידי טיפול בתאים עם ציספלטין כימותרפיות וculturing בתאי גזע קידום תקשורת אנו מעשירים לתרבויות CSC לא חסידות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחור ולבודד תאי גזע של סרטן השחלות העמידים לכימותרפיה או CSCs. זה מושג על ידי תיוג פלואורסצנטי ראשון של קווי תאי סרטן השחלות עם חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP ובחירה עבור תאים חיוביים ל-RFP באמצעות מיון תאים או עובדות המופעלות על ידי פלואורסצנטיות. השלב השני של ההליך הוא טיפול בשורות תאי סרטן השחלות עם ציספלטין כימותרפי למשך 72 שעות ולאחר מכן תרבית התאים השורדים במדיה CSC.

לאחר יומיים ייווצרו סטרואידים שאינם דבקים. CSCs הבאים מאופיינים באמצעות ניתוח ביטוי גנים עבור סמני תאי גזע ו-CSCs מנותחים עבור סמני פני התא באמצעות ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, ניתוח של CSCs לתגובה טיפולית מושג על ידי טיפול בתאים עם ציספלטין או פקליטקסל וביצוע בדיקת MTT למדידת כדאיות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טיפול בתאים סרטניים במינונים גבוהים של פקליטקסל וציספלטין הוא שהשיטה שלנו מניבה תאים ברי קיימא יותר תוך שימוש בכמויות פחות רעילות של חומרים כימותרפיים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על שיפור הטיפול בסרטן השחלות מכיוון ש-CSCs מייצגים אוכלוסייה עמידה לטיפול שתזדקק לשיטות טיפול חדשות. ניתן ליישם שיטה זו גם על מערכות אחרות כגון סרטן הלבלב, סרטן השד וסוגי גידולים אחרים עם תאים עמידים לטיפול.

יחד עם ג'ניפר תדגים את הטכניקה הזו ד"ר לירוי, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל להפיץ Skov three ו-O משתעל 4 2 9 שורות תאים באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ולגדל תאים לשטף משותף של 40 עד 50%. כדי ליצור SCV, שלושה תאים המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP מוסיפים חלקיקים לנטי-ויראליים המבטאים RFP ו-10 מיקרוגרם למיליליטר של פולי-מוח ל-SCV שלוש מדיות בהיעדר פניצילין וסטרפטומיצין למשך 72 שעות.

לאחר 72 שעות, בחר תאים חיוביים ל-RFP על ידי מיון תאים או עובדות המופעלות על ידי טריפסין RFP ותאים שאינם מבטאים RFP ולאחר מכן צנטריפוגה ב-125 פעמים G למשך חמש דקות לאחר צנטריפוגה להשעות מחדש את התאים ב-10 מיליון תאים למיליליטר ב-PBS המכיל 0.1%BSA על סדרן תאים. השתמש בתאים שאינם RFP כדי לקבוע את פרמטרי המיון. לאחר מכן אסוף תאים המבטאים RFP גבוה באמצעות לייזר של 561 ננומטר כדי להעשיר תאי גזע סרטניים.

טפל ב-SCV שלושה, SCV שלושה RFP או O שיעול 4 2 9 קווי תאים עם 20 מיקרו-מולרית של ציספלטין כימותרפי למשך 72 שעות. הטריפסין הבא הוא התאים והתרבות התאים השורדים במדיה CSC. החלף את המדיה כל יומיים על ידי צנטריפוגה של תאים ב-125 פעמים G למשך חמש דקות ו-Resus השעיית הגלולה בתאי בדיקת מדיה CSC טריים לכדאיות כל יומיים על ידי ספירת תאים וביצוע אי הכללה של טריאן כחול.

אסוף CSCs לניסויים נוספים על ידי צנטריפוגה כמו קודם והחזרת הכדור לתמיסה המתאימה. עוקב אחר מורפולוגיה של תאי CSC באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלות של 20 x ו-40x. כדי לאפיין תחילה את ה-CSCs, אסוף שלושה תכשירים של CSCs על ידי צנטריפוגה של מדיה המכילה תאים ב-125 פעמים G למשך חמש דקות.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בתמיסה של פנול המכיל גו אינדיום תיוציאנט. למיצוי RNA, לאחר מכן סנתז DNA משלים או CD NA מ-0.1 למיקרוגרם אחד של RNA באמצעות ערכת שעתוק הפוך CDNA זמינה מסחרית. לאחר מכן, בצע תגובת שרשרת פולימראז מתומללת הפוכה כמותית, בקיצור Q-R-T-P-C-R כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

בצע את כל ה-Q-R-T-P-C-R בשכפול עבור כל דגימה באמצעות תרמו-ציקלר PCR בזמן אמת המסוגל לזהות פלואורופורים מרובים. כשלב אחרון, נרמל את ביטוי הגנים של תאי גזע כדי לפער את ביטוי ה-DH עבור כל דגימה. בשיטת דלתא דלתא CT.

קצור CSCs על ידי איסוף מדיה המכילה תאים וצנטריפוגה ב-125 פעמים G למשך חמש דקות. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים שאינה פרוטאוליטית כדי לפרק את התאים לפני הצנטריפוגה שוב כדי להסיר את תמיסת ניתוק התאים. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם PBS קר.

דגרו את התאים במצע גידול רגיל במשך שעה אחת לפני סימון התאים לאחר סיבוב התאים. כמו קודם, השעו מחדש את התאים ב-PBS עם 0.1% BSA המכיל אנטי CD 1 33 PE ואנטי CD אחד 17 FE. לאחר מכן תקן את התאים למשך הלילה ב-1%Para פורמלדהיד בצע ציטומטריית זרימה כדי לנתח את ביטוי פני התא CD 1 17 ו-CD 1 33. אסוף נתונים על תאים בערוץ FL one ו-FL שלושה וצור שערים לתאים המבטאים גם מתאים E וגם pe.

צור עלילת נקודות עם ארבעה רבעים וקבע את מספר התאים בכל לוחית רבע. 5,000 תאים לבאר עבור כל וריאנט תא על 96 לוחות באר בן לילה. לאחר מכן טפל בתאים בריכוזים שונים של ציספלטין או פקליטקסל למשך 96 שעות.

לאחר 96 שעות, הוסף 10 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר. MTT דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות עד שנוצרים משקעים המסיסים. MTT. הוסף את ממס ה-MTT, תמיסה המכילה ארבע חומצה הידרוכלורית מילי-מולרית ו-0.1% NP 40 באיזופרופנול.

לאחר הדגירה במשך 15 דקות בחושך, קרא את הלוחות ב-570 ננומטר על קורא צלחות כדי להדגים ש-CSCs בודדו מקווי תאי סרטן השחלות האפיתל באמצעות טיפול בציספלטין. תמונות של קווי התאים נרכשו לפני הטיפול ולאחר הבחירה, מיקרוסקופ אור לכד תמונות של הדבקות. תאי SCV 3 ו-OCA 4 2 9, כמו גם SCV שלושה CSCs ו-OCA 4 2 9 CSCs CSCs נראים עגולים ואינם מחוברים ללוחות תרבית הרקמה.

SCV: שלושה תאים שהומרו עם RFP שומרים על הקרינה שלהם לאחר בידוד ה-CSCs, מה שמדגים שהתאים ברי קיימא. קיימא. תרביות CSC הוערכו לתגובתן לטיפול תרופתי. CSCs הפגינו עמידות מוגברת לביטוי ציספלטין ופקליטקסל של גנים של תאי גזע.

CD 1 33 NEIN nano ו-T 4 נבדקו. בניסויים ראשוניים. T 4 nano ו-nein היו גבוהים ב-S SCV שלוש תרביות CSC בהשוואה ללא טיפול, אך התוצאות לא היו מובהקות סטטיסטית.

CD 1 33 הושרה באופן משמעותי בשלוש תרביות CSC SCV בהשוואה לתאים לא מטופלים. עם חזרה על ניסויים אלה, T ארבע וננו עלו ב-S SCV שלושה CSCs בהשוואה לתאי ביקורת הורים. SCV שלוש, CSCs מציגים ביטוי מוגבר של פני התא של סמן CSC CD one 17 כפי שנחשף בניתוח פקס בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהמגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא משך הזמן שבו ה-CSC נשאר בר-קיימא.

באמצעות פרוטוקול זה, ה-CSC נשאר בר קיימא למשך פחות משבוע. לכן, יש לתזמן בקפידה את סוגי הניסויים והניתוח עבור ה-CSC. אל תשכח שעבודה עם ציספלטין עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בביגוד מגן והימנעות ממגע עם עור וריריות לאחר הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אי הכללת טריאם כחול על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לכדאיות התא, כמו גם מבחני דילול מוגבלים כדי להדגים את המאפיינים מקדמי הגידול של ה-CSCs לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסרטן לחקור מסלולים המובילים לעמידות לכימותרפיה.