Name: התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: חקור התחדשות כליות בדגי זברה מבוגרים באמצעות פגיעה מושרה בגנטמיצין. השיטה מאפשרת לעקוב אחרי תהליך ההתחדשות באמצעות היווצרות יציקות אפיתליות כמדד חזותי לפגיעה בנפרון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH F32DK091998 ל-CNK; מענק NIH RO1DK041071 ומכון תאי הגזע של הרווארד מעניקים D001229 ל-IAD. המחברים מודים לניל הוקרייד על בדיקת lhx1aבאתרה.

הצהרת אתיקה:: הערה כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות בית החולים כלליים מסצ&#39;וסטס לשימוש בבעלי חיים במחקר. 1. הכנה מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כמה מבוגרים דג הזברה ישן 6-12 חודשים כדי לפגוע. תכנית לפגוע בדגים 10-20% יותר מאשר יהיה צורך. על מנת למזער את השונות, גיל שימוש בהתאמת דגי אח שגדלו יחד באותו טנק, כך שהם בערך באותו גודל ויש לי שונות גנטיות פחות. דגי נקבה הם הרבה יותר קלים להזריק בהשוואה לדגי זכרים, בשל הקיבולת הגדולה יותר של הבטן. עם זאת, זכרים ונקבות לתת תוצאות דומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עושה הניסוי בפעם הראשונה, עלילה עקומת מינון כדי לקבוע את המינון המתאים לגנטמיצין זן ספציפי של דגים. לבדוק כל אצווה חדשה של גנטמיצין לפני השימוש בניסויים מאז טוהר גנטמיצין משתנה מיצוו אצווה. מינון נכון צריך להיקבע על ידי הערכת expressiעל פציעה של סמנים כגון lhx1a. (ראה איור 1 א - ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון גנטמיצין. פתרון מניות גנטמיצין עשוי להיות מאוחסן ב-20 ° C ומופשר לשימוש מאוחר יותר. לדוגמא, עבור 80 מ&quot;ג / קילוגרם מינון (80 גנטמיצין מ&quot;ג / קילוגרם ממשקל הגוף) בדגים במשקל 0.5 גרם, להכין 2 מ&quot;ג / מיליליטר של גנטמיצין בופר פוספט כפתרון נוח עבודה. זה מספק 20 μl של גנטמיצין לזריקת intraperitoneal לדגים. הערה: באופן כללי, 80-120 מ&quot;ג / קילוגרם להשיג תוצאות טובות, אך במינונים נמוכות כמו 40 מ&quot;ג / קילוגרם עשוי להיות מתאים. גנטמיצין גם ניתן לרכוש בפתרון כדי למזער את החשיפה מסוכנת לאנשי מעבדה. הערה: גנטמיצין במינונים גבוהים יכול להיות רעיל. ללבוש כפפות ומסכה כאשר משקל אבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של 0.016% מים tricaine 100 מיליליטר להרדמת דגים. הכן מלאי 25x של tricaine (4 g / L 1) מומסת במי MilliQ סטרילי להתאים לpH 7 וחנות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לדלל 4 מ &#39;l במי דגים 100 מיליליטר לריכוז עבודה של 0.016%. הערה: Tricaine הוא גירוי הרדמה ועור, ללבוש כפפות בעת הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דגים לגרוף מתוך pipet העברת פלסטיק על ידי חיתוך את הנורה לצורת כדור וחיתוך 2 חריצים בתחתית לניקוז מים. מזרקים 1ml העומס (עם 10 דרגות μl) עם פתרון גנטמיצין מוכן ולצרף מחט G 30½. הסר את כל בועות אוויר. לסובב את המחט על המזרק כדי לוודא שקצה הזווית על המחט פונה משם ואת סימוני המזרק הם פונים קדימה וקריאים. לזריקות שליטה, להכין מזרק ומחט עם PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בקנה מידה עם משטח נקי או לשקול סירה, כמו גם מגבות נייר לייבוש דגים ולהחזקת דגים להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מכולות חצי ליטר קטנים בודדות עם מכסים להחזקת דגים לפוסט לילה תצפית הזרקה. כלובי הזדווגות פלסטיק שקופים קטנים שימושיים למטרה זו. אלהמכולות לא צריכים להיות לבנה - באופן אידיאלי הם צריכים להיות ברורים כדי שיציקות אפיתל הלבנות לשפוך על ידי הדגים יכולות להיות שנצפו על גבי שחור ספסל. ממלא כל מיכל עם מספיק מים דגים לדגים לשחות בנוחות. </li></ol> 2. הזרקת Intraperitoneal של גנטמיצין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הדגים ב0.016% פתרון tricaine במי דגים. חכה לקצב תחלופת אוויר הזימים כדי להאט ולדגים להגיב כבר לא לגעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים באמצעות הסקופ הדגים, עובר מהראש לכיוון זנב על מנת למנוע פגיעה בזימים או סנפירים. מניחים את הדג על מגבות נייר לספיגת עודפי המים על ידי הפיכת הדגים החוצה בעדינות על צידו ולהתנער מעודפי מים מהכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים שוב ולמקם אותו בסירה לשקול בסולם מאופס ולשקול את הדגים. עגול ל0.25 גר &#39;הקרוב, ולחשב את הכמות המתאימה של גנטמיצין להזריק. הערה: לדגים 0.5 גרם להשתמש הזרקת 20 μl בשעה 80 מ&quot;ג / קילוגרם מינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הדגים שוב ומניח אותו על מגבת נייר מקופלת יבשה. אם הזרקה באמצעות יד ימין, להחזיק את מגבת נייר ביד השמאל והנח את ראשו של הדג הצביע שמאלה, עם הבטן נגישה בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את המזרק עם המחט בזווית של 45 מעלות לעור של הבטן, הקדמי לביב. לדחוף את המחט מתחת לעור, ואז להקטין את הזווית והחלק את המחט קדימה מתחת לעור, הימנעות האיברים הפנימיים. לוחץ על המתג הכמות המתאימה, להשהות כדי לוודא שאף נוזל יוצא סביב המחט, אז למשוך את המחט. אם מחזיק את הדגים יציבים הוא בעיה, מרפקי סד נגד פלג גוף עליון כדי לייצב אותם. הערה: יש להשתמש בכפפות בעת הטיפול בפתרון גנטמיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק כל דגים למכל בודד. שים לב לדגים ולהבטיח ההתאוששות שלה מהרדמה. לשמור על דגים על 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: אם הדג לא להחיות באופן מיידי, להשתמש טרנס פלסטיקpipet FER להשקיית מים על פני הזימים שלו להחיות אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו מזרק ומחט כאשר הזרקת דגים מרובים עם אותו המינון של גנטמיצין. השלך את המזרק המשומש ומחט לתוך המכל החדים Biohazard המתאים. </li></ol> 3. תצפית הזרקת הודעה של פגיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (יום לאחר פציעת 1), למקם את הדגים המוזרקים במכל שלה על משטח כהה. יציקות לבנה של רקמת האפיתל המתה מופרשת על ידי הדגים נפצעו צריכה להיות גלויות. (ראה איור 1E - H). אם אין יציקות, גם הדגים לא נפגע על ידי הזרקת גנטמיצין (או המינון היה נמוך מדי, או חלק מגנטמיצין דלף במהלך תהליך ההזרקה) או הדג נפצע קשה וכתוצאה מכך החסימה של השופכנים וביב מלא עם רקמת שהושל. הערה: אם הדגים אינם יכולים לנקות את היציקות מהגוף שלה זה בדרך כלל ימותו תוך 2-3 ימים ולכן לא שמיש למשך זמן ארוך יותרמבחני. אם לא יציקות גלויות, להרדים את הדג במי tricaine ידי טבילה לפחות 10 דקות אחרי תנועת הזימים מפסיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יציקות רקמה הלבנות גלויות, להגדיר את הדגים בצד ולהמשיך לבדוק את הדגים האחרים. מינון מתאים של גנטמיצין יגרום 80-90% מלהיות שמיש הדגים. בריכת הדגים נפצעו ואז לפצל אותם לקבוצות טיפול שונות אם תרצה בכך. </li></ol> 4. טיפול בדגי שחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דגים במים נקיים וסביבה צפופות. מים וצפיפות מלוכלכים יובילו לזיהומים ומוות בלתי צפויה. נסה לשמור על לא יותר מ 6 דגים / 500 מיליליטר של מים דגים ולהחליף את המים מדי יום במידת האפשר. הערה: זהו היקף מינימאלי לשימור של שטח או אם החוקר מבקש לבצע ניסויים באמצעות טיפולים תרופתיים יקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא להאכיל את הדגים עד 3 ימים לאחר פציעה. דגי שחזור לא לאכול בהתחלה, ואוכל כל שבטנק לפרק ולקדם גר חיידקיםowth. החל מ 3 ימים לאחר פציעה, להאכיל כמות קטנה פעם אחת ביום. </li></ol> 5. ניתוח של כליות נפגעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלאה באתר לביטוי mRNA lhx1a, ניתן לקצור כליות מדגים בנקודתי זמן רצויים. להרדים דג במי tricaine על קרח לפחות 10 דקות עד שתנועת זימים מפסיקה, ולאחר מכן להסיר את הראש עם סכין גילוח ולפתוח את חלל הגוף ולהסיר את האיברים הפנימיים עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הכליות במקום (איבר פיגמנט מחובר לקיר גוף הגב) ולתקן את הדגים בparaformaldehyde 4% ב- ​​PBS לילה. לנתח את הכליות 15 ותמשיך עם תקן הכלאה באתר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לשטוף את הכליות בPBST (פוספט Tween 0.5% שנאגרו המלוח 20), permeabilized עם proteinase K בPBST (10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. פוסט לתקן עם paraformaldehyde 4%, ושטף שוב עם PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז לפני להכליא כליות לילה בשעה 68; ° C במאגר הכלאה (פוראמיד 50%, SSC 5x, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 500 מיקרוגרם / מיליליטר tRNA, 0.1% Tween20, pH 6.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות עם הבדיקה digoxigenin שכותרתו במאגר הכלאה, ולאחר מכן לשטוף למשך 5-10 דקות כל אחד עם 100%, 75%, 50%, 25% חיץ הכלאה 68 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן עבר לטמפרטורת חדר ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם 2x SSC עם 0.1% Tween20, ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם SSC 0.2X עם 0.1% Tween20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן דקות המדגם 3x 5 בMAB (0.1 חומצת M maleic, 0.15 מ &#39;NaCl, pH 7.5) וחסמו את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בMAB עם סרום עיזים 10%. אז דגירה דגימות לילה באנטי digoxigenin-AP Fab 1: 5,000 בMAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את 5x המדגם עבור שעה 1 בMAB, ולאזן 3x במשך 15 דקות בNTMT (0.1 מ &#39;טריס pH9.5, 0.05 M MgCl 2, 0.01 M NaCl, 50 μl Tween20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לטפל בכליות עם NBT / BCIP כדי לזהות אותות. תקן את הכליות עם paraformaldehyde 4% וטופחו בdimethylformamide לרםיש עודף NBT / BCIP, מולבן לילה במים ללא יונים. לשטוף את הכליות ולאחר מכן לצלם בPBST עם גליצרול 50% מתחת coverslip. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li>
<li>Humphreys, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+injured+proximal+tubule+does+not+involve+specialized+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).</li>
<li>Guo, J. K., Cantley, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+maintenance+and+repair+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular maintenance and repair of the kidney.</a> Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).</li>
<li>Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+regeneration%3A+common+themes+from+the+embryo+to+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult.</a> Pediatr Nephrol. , (2013).</li>
<li>Little, M. H., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+such+a+thing+as+a+renal+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Is there such a thing as a renal stem cell.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).</li>
<li>Reimschuessel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fish+model+of+renal+regeneration+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">A fish model of renal regeneration and development.</a> ILAR J. 42, 285-291 (2001).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).</li>
<li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298, 2188-2190 (2002).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Dev Biol. 320, 161-174 (2008).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+lhx1a+transgenic+reporter+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).</li>
<li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li>
<li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity%3A+an+integrative+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kidney Int. 79, 33-45 (2011).</li>
<li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+microscopy+from+the+seventeenth+century+to+the+present+day%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day.</a> Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).</li>
<li>Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+dimorphic+fin+regeneration+in+zebrafish+controlled+by+androgen%2FGSK3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling.</a> Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).</li>
<li>Zhou, W., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+podocyte+injury+and+proteinuria+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+model+of+conditional+targeted+podocyte+ablation+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration.</a> Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.

דג הזברה היא אידיאלי ללימוד התחדשות של איברים בוגרים כולל המבוגרים כליות mesonephric 6. מחקרים שנעשו לאחרונה ניצלו סמנים מולקולריים וקווי כתב מהונדס חדשים לאפיין טוב יותר את הצעדים המתרחשים במהלך התחדשות נפרון ומה תאים עשויים להיות אחראי 7,12. תצפית של יציקות שתן הייתה בשימוש כבר יותר ממאה שנה כדי לאבחן מחלת כליות בבני אדם 16. כאן אנו משתמשים הנוכחות של יציקות כאינדיקטור קל, לא פולשנית והמוקדם של היקף פגיעה בכליות חריפה לאחר הזרקת גנטמיצין. אנו צופ...

הכליות היא חיוניות להומאוסטזיס נוזל, ויסות לחץ דם וסינון של פסולת מהגוף. למרות יונקים מסוגלים לתקן nephrons הקיים לאחר פציעה באמצעות תאים אפיתל מובחנים 1-4, נראה שהם חסרי מאגר של תאי גזע שמורים 5 ולא מצליחין ליצור nephrons החדש דה נובו. בניגוד ליונקים, דגים בוגרים יכולים ליצור nephrons החדש לאורך כל חיים בוגרים כדי לתמוך בצמיחה של הדגים ובתגובה לפציעה 6,7. דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל לא יסולא בפז לחקר התחדשות איבר 8-10 ויש לו הפוטנציאל לספק תובנות רבות עוצמה ליישומים להנדסת התיקון של כליות אנושיות. Tg (Lhx1a: EGFP) transgene 11 הוכח תווית בריכה של תאי נפרון בכליות דג הזברה המבוגר 12, לעומת זאת מנגנוני שליטה התגובה של lhx1a + תאים לימין פציעהemain לא ברור. גנטמיצין aminoglycoside הוא אנטיביוטיקה בשימוש נרחבת עם אפקטי nephrotoxic וototoxic ידועים בבני אדם 13. זריקת intraperitoneal של גנטמיצין היא שיטה מבוססת של גרימת ניזק כלייתי חריף בדגים 6. פגיעה זו במחקה דגי אובדן אפיתל וצלקות של glomeruli המתרחשת בבני אדם לאחר גנטמיצין מנת יתר 14 צינור. גרימת פציעה בדג זברה על ידי הזרקת גנטמיצין היא דרך נוחה של גרימת תגובת התחדשות חזקה, סינכרוני, עם הרבה nephrons החדש מיוצר ובו זמנית ממשיך דרך שלבים של היווצרות, שגשוג והתמיינות. פרוטוקול זה מפרט את השיטה שלנו לפגיעה חזקה ושחזור בכליות דג הזברה המבוגר על ידי ניצול תהליך מיון חזותי לא פולשנית כדי למזער חריגים. אנו מנצלים את העובדה שפציעה עם גנטמיצין מובילה למוות של רקמת הכליה אפיתל ופורמטיון של יציקות צינורי כליות, אשר לאחר מכן לצבור להמונים בצינורות וביב mesonephric. אלה הועברו על ידי הדגים וניתן לצפות מבחינה ויזואלית במים. זה מאפשר לנו להקרין לדגים עם פגיעה קטלנית חזקה, אשר לאחר מכן ניתן נקוותה לניסויים נוספים. מזעור המספרים של דגים או דגים ללא כל פגע שימותו לפני שהם מגיעים לנקודת הסיום של הניסוי מובילה ליותר אחיד ואיסוף נתונים יעיל וניתוח. בנוסף, אין התקנים או חומרים כימיים מיוחדים נדרשים, מה שהופך את השיטה זו חסכונית ומתאימה לשימוש בסביבה אקדמית או הוראה. שימוש בשיטה שלנו, כאן אנו מראים את ההשפעות הגוברים של מינון גנטמיצין על התחדשות בכליות, כמו גם את ההשפעה של טמפרטורה עלתה.

<table><tbody><tr><td>גנטמיצין נתרן סולפט</td><td>Sigma</td><td>G1264</td><td>רעיל, הטוהר משתנה מאצווה לאצווה</td></tr><tr><td>צנרת העברת פלסטיק</td><td>פישר</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרקי Norm-Ject Electron</td><td>Microscopy Sciences</td><td>72520</td><td>מזרקי פלסטיק ירוקים, מזרקים רגילים של 1 מ"ל הם בסדר, אבל קשה יותר לקרוא במדויק</td></tr><tr><td>30 G1/2 מחטים</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (טריקאין)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td>הכינו 4% ב-1x PBS לתמיסת עבודה</td></tr></tbody></table>

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

הכליה חיונית להומאוסטזיס נוזלים, ויסות לחץ דם וסינון פסולת מהגוף. היחידה הבסיסית של תפקוד הכליות היא הנפרון. יונקים מסוגלים לתקן נפרונים קיימים לאחר פציעה, אך מאבדים את היכולת ליצור נפרונים חדשים זמן קצר לאחר הלידה. בניגוד ליונקים, דגים בוגרים מייצרים נפרונים חדשים (ניאונפרוגנזה) לאורך חייהם בתגובה לדרישות גדילה או פציעה. לאחרונה, הוכח כי lhx1a מסמן תאי אב נפרון בכליה הבוגרת של דג הזברה, אולם מנגנונים השולטים בהיווצרות נפרונים חדשים לאחר פציעה נותרו לא ידועים. כאן אנו מראים את השיטה שלנו לפגיעה חזקה וניתנת לשחזור בכליה של דג הזברה הבוגר על ידי הזרקה תוך-צפקית (i.p.) של גנטמיצין, המשתמשת בתהליך סינון חזותי לא פולשני כדי לבחור דגים עם פגיעה חזקה אך לא קטלנית. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים לקבוע מינונים אופטימליים של גנטמיצין לפציעה ולהמשיך להדגים את ההשפעה של טמפרטורות גבוהות יותר על התחדשות הכליות בדג הזברה.

פציעת גנטמיצין ניתן לאשר באופן חזותי על ידי ההתבוננות ביציקות אפיתל כליות במים (איור 1). מינונים שונים של גנטמיצין שמשו לפגוע דג הזברה TuAB wildtype מבוגר, וכתוצאה מכך הגדלת מספרם של lhx1a + אגרגטים הסלולר בכליות ההתחדשות (איור 1 א - ד). יכולות בקלות לראות יציקות לבנים במי היום 1 לאחר פציעה (איור 1E - H). מינון נמוך של גנטמיצין הביא ברוב הדגים שאין לי יציקות, ואילו במינונים גבוהים יותר הב...

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בדגי זברה בוגרים על מנת לחקור התחדשות כליות. זה מושג על ידי הזרקת הנפרוטוקסין גנטמיצין לחלל הצפק של הדג כדי לגרום לתגובת פציעה חריפה. לאחר מכן, הדגים שוכנים במיכלים בודדים למשך הלילה לתצפית.במהלך תקופה זו, היווצרות גבס מתרחשת מכיוון שאפיתל הנפרון הפצוע נשפך ונאסף בלומן של צינורות וברווזים. דגים פצועים מזוהים למחרת על סמך היווצרות יציקות וניתן להשתמש בהם בניסויים נוספים לחקר התחדשות הכליות. הרעיון לשיטה הזו עלה לראשונה כששמנו לב שהדגים הפצועים מפרישים יציקות, שהן אינדיקטור ידוע לפציעה בבני אדם.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת להזרקת ג'נמיצין הוא שהיווצרות CAS היא אינדיקטור חזותי קל לפציעה. לאחר גידול דג זברה בוגר בן שישה עד 12 חודשים והכנת מי גנטמיצין וטריקה, על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו כף דג מפיפטה להעברה מפלסטיק על ידי חיתוך הנורה לצורת כף וחיתוך שני חריצים בתחתית כדי לנקז את המים העמיסו מזרקים של מיליליטר אחד עם תמיסת הגנטמיצין המוכנה ונתקו מחט בגודל 30 וחצי. לאחר מכן הסר את כל בועות האוויר וסובב את המחט על המזרק כדי לוודא שקצה הקרסול פונה הצידה וסימני המזרק פונים קדימה וקריאים.הכינו מיכלים קטנים ושקופים של חצי ליטר עם מכסים להחזקת דגים לתצפית לילה לאחר ההזרקה, ולתצפית על יציקת האפיתל הלבנה שנשפכה על ידי הדג. מלאו כל מיכל במספיק מי דגים כדי שהדגים יוכלו לשחות בנוחות. לאחר הרדמת דג על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בכף הדג הנעה מהראש לכיוון הזנב על מנת להימנע מפגיעה בזימים או בסנפירים כדי לגרוף את הדג, הנח את הדג על מגבות נייר כדי לספוג את עודפי המים על ידי הפיכתו בעדינות על צידו וניעור עודפי המים מהכף.לאחר מכן, קחו שוב את הדג והניחו אותו בסירת הדרך על המשקל המאופס ושקלו את הדג עגול ל-0.25 גרם הקרוב ביותר וחשבו את הכמות המתאימה של גנטמיצין להזרקה. השתמש בכף כדי להרים שוב את הדג ולהניח אותו על מגבת נייר מקופלת יבשה. אם מזריקים, בעזרת יד ימין, החזיקו את מגבת הנייר ביד שמאל והניחו את ראש הדג הפונה שמאלה עם הבטן.נגיש בקלות. אם החזקת הדג יציב היא בעיה, ייצב את המרפקים כנגד פלג גוף עליון. לאחר מכן, החזק את המזרק עם המחט בזווית של 45 מעלות לעור הבטן הקדמית לקלואקה.דחפו את המחט ממש מתחת לעור, ואז הפחיתו את הזווית והחליקו את המחט קדימה מתחת לעור, תוך הימנעות מהאיברים הפנימיים. לחץ על הבוכנה בכמות המתאימה והשהה כדי לוודא שלא יוצא נוזל סביב המחט. לפני משיכת המחט, זרוק את הדג למיכל בודד וודא שהוא מתאושש מההרדמה.שמור את הדג על 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יום לאחר ההזרקה הניחו את הדג המוזרק במיכל שלו על משטח כהה. יש לראות יציקות לבנות של רקמת אפיתל מתה המופרשת על ידי הדג הפצוע, להניח את הדג בצד ולהמשיך לבדוק דגים אחרים.80 עד 90% מהדגים המוזרקים אמורים לייצר CAS אם הוזרק מינון מתאים של גנטמיצין. אם אין קאס, או שהדג לא נפגע מהזרקת הגנטמיצין או שהדג נפצע קשה, וכתוצאה מכך חסימה מוחלטת של השופכנים והקלאקו ברקמות רכות כדי לטפל בדגים המתאוששים. שמור לא יותר משישה דגים לקבוצת טיפול לכל 500 מיליליטר מי דגים, והחלף את המים מדי יום במידת האפשר כדי לשמור על ניקיונם.שלושה ימים לאחר הפציעה. התחל להאכיל את הדגים בכמויות קטנות פעם ביום. נתח את הכליות הפגועות על פי פרוטוקול הטקסט כפי שניתן לראות כאן, מינונים שונים של גנטמיצין שימשו לפגיעה בדגי זברה בוגרים מסוג 2 a b, ואושרו חזותית על ידי תצפית על יציקות אפיתל כליות במים.יום אחד אחרי הפציעה. מינון נמוך של גנטמיצין הביא לכך שלרוב הדגים אין גבס, בעוד שמינונים גבוהים יותר גרמו לכך שליותר מ-75% מהדגים היו יציקות כפי שמודגם כאן. מינונים שונים של גנטמיצין הביאו למספר גדל והולך של LHX אחד מאגרגטים תאיים חיוביים בכליה המתחדשת.בניסוי זה לאחר פציעה עם 80 מיליגרם לק"ג גנטמיצין, הדגים שייצרו גבס חולקו לשתי קבוצות. אחד מהם קיבל טיפול בהלם חום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות, ולאחר מכן תקופת מנוחה של 28.5 מעלות צלזיוס בכל יום. כפי שמוצג כאן, הלם חום לבדו אינו גורם לתגובת פציעה כפי שנצפה על ידי צפיפות ה-LHX של אגרגטים חיוביים.עם זאת, דוגמה זו ממחישה כי הלם חום האיץ את התגובה בדגים פצועים בהשוואה לחוסר בקרות הלם חום עד שבעה ימים לאחר הפציעה, כבר לא היה הבדל משמעותי בין קבוצות פצועות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפגוע בסופרפיק מבוגר עם גן נפרוטוקסין ולשפוט חזותית את רמת הפציעה שלהם על סמך היווצרות CAS על מנת לחקור התחדשות כליות בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו הוספת מפעילים או מעכבים של מסלולי איתות כדי לקבוע אילו אותות מעורבים בתגובה הרגנרטיבית.

kidney-regeneration-in-adult-zebrafish-by-gentamicin-induced-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים טכניקה של microinjecting aminoglycoside, גנטמיצין, תוך 2 ימים שלאחר fetilization (DPF) הזחלים דג הזברה לגרום לפציעה כליות חריפה (AKI). כמו כן, אנו מתארים שיטה אימונוהיסטוכימיה הר שלמה, פלסטיק הטבעה ואת חתך של הזחלים דג הזברה לדמיין את הנזק בתיווך AKI.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

השתלת היא טכניקה חיונית לחקר התחדשות רקמות לפיתוח טיפולים מבוססי תאים של המחלה. אנו מדגימים כאן טכניקה microsurgical המאפשר השתלת תאים שכותרתו גנטית ישירות לתוך הכליה של הדגים הבוגרים דג הזברה.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

כליות דג הזברה הוא ביתם של שני גזע / ובתאים כליות hematopoietic מבוגרים, מהווה הזדמנות מעולה ללמוד סוגי תאים אלה וצאצאיהם באורגניזם מודל החולייתנים. הנה, אנחנו מדגימים הליך לנתיחה מפורט המאפשר חוקר לזהות בניתוח להסרת הכליה דג הזברה למבוגרים, אשר יכול לשמש עבור יישומים כגון בידוד התא, השתלה, ומחקרים ביטוי וכליות / או אוכלוסיות תאים דם.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של...

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

דג הזברה מהווה מודל חשוב ללמוד את מנגנוני התחדשות לב אצל בעלי חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אינדוקציה של אוטם לב דג הזברה למבוגרים באמצעות cryoinjury. שיטה זו גורמת מוות של תאים מסיבית של 20% קיר החדר, בדומה לזו שנצפתה אוטמים יונקים.

אינדוקציה של אוטם שריר הלב ב דג הזברה למבוגרים באמצעות Cryoinjury

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

כדי לשפוך אור על המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות בוגרים של דג הזברה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח פולשני הגורם לפציעות מכניות בטלנצפלון הבוגר של דג הזברה וניטור לאחר מכן של שינויים בחצי הכדור הדקירה על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.

מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

חקור התחדשות כליות בדגי זברה מבוגרים באמצעות פגיעה מושרה בגנטמיצין. השיטה מאפשרת לעקוב אחרי תהליך ההתחדשות באמצעות היווצרות יציקות אפיתליות כמדד חזותי לפגיעה בנפרון.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

גלה סרטונים נוספים