הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את התקדמות תאי השד לאחר השתלת תאי גידול בכרית השומן של זיכרון העכבר. זה מושג על ידי הזרקת תאי סרטן השד לתוך כרית השומן של עכבר בוגר, ולאחר מכן מדידת נפח הגידול עם קליפר ברמות זמן קבועות מראש. בסיום הניסוי נקבעו מסת הגידול ונפחו, והדם והריאות של בעל החיים נקצרים להמשך ניתוח.

בסופו של דבר, ניתן לכמת גרורות מאקרו ומיקרו על ידי ניתוח חזותי ואימונוהיסטוכימי בהתאמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הזרקת תאי גידול תת עורי, הוא שאתר הזרקת כרית השומן בשד, מחקה את האתר המקורי של היווצרות גידול השד, ומניב תוצאות אמינות יותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן השד, כגון אילו גידולים, מדכאים, אונקוגנים או רכיבי תא סטרומה מעורבים בהתקדמות הסרטן.

יום לפני ההליך גלחו את עכברי הגמא N-O-D-S-C-I-D מהפטמה הרביעית לקו האמצע ושקלו אותם כדי לוודא שלכל החיות יש משקל דומה בערך. למחרת, שטפו תרבית תאי אדנוקרצינומה בשד אנושי פעם אחת עם PBS ולאחר מכן נסו להחזיר את התאים כאשר רוב התאים התנתקו. הרוו את התגובה עם 10 מיליליטר של סרום המכיל מדיה DMEM ולאחר מכן סובבו את התאים למשך שבע דקות ב-1,200 סל"ד בטמפרטורת החדר, שטפו את הגלולה כדי להסיר כל זכר לסרום, ולאחר מכן השעו מחדש את הגלולה השנייה ב-PBS.

לאחר הספירה, יש לחלק את התאים בריכוזים של 500,000 ל-150 מיקרוליטר לצינורות מיקרו-צנטריפוגות סטריליים על קרח. לאחר מכן מלאו צינור חרוטי אחד של 50 מיליליטר ב-35 מיליליטר PBS ועוד אחד באתנול של 70% והשרו צמר גפן בכל אחד. כאשר כל הכלים מוכנים לכל בעל חיים, מרחו משחה עיניים על עיני החיה.

לאחר מכן השתמש בסרט כדי לרסן בעדינות עכבר מרדים על כרית חימום ולאשר הרגעה על ידי צביטת הבוהן. השתמש בצמר גפן ספוג אתנול כדי לנקות את האזור המגולח ולאחר מכן השתמש בלהב אזמל כדי לבצע חתך קטן בין הפטמה הרביעית לקו האמצע. הכנס את צמר גפן ספוג PBS לתוך החתך כדי ליצור כיס ולאחר מכן השתמש בפינצטה כדי לחשוף כרית שומן זיכרון, שניתן לזהות לפי צבעה הלבן.

השתמש בזוג פינצטה נוסף כדי לסחוט את כרית השומן בבסיסה ולחשוף את הרקמה במלואה. לאחר מכן פיפטה את תאי האדנוקרצינומה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי ליצור תמיסת תאים הומוגנית ולשאוב בעדינות 150 מיקרוליטר תאים למזרק אינסולין. מקפידים להחזיק מזרק אופקית כשחור המחט פונה כלפי מעלה.

הזרקת התאים לתוך כרית השומן החלבי המאשרת הזרקה מוצלחת על ידי נפיחות של הרקמה. לאחר מכן שחרר את כרית השומן בעדינות והשתמש במלקחיים נגד יתושים כדי לתפור את החתך, סובב את התפר סביב מלקחיים היתושים בכיוון השעון, נגד כיוון השעון ובכיוון השעון כדי ליצור שלושה קשרים. לאחר הניתוח, יש להזריק משכך כאבים ולהניח כל בעל חיים בתנוחת שכיבה חזה בכלוב בודד, תוך מעקב אחר העכברים עד להחלמתם המלאה.

שמונה שבועות לאחר השתלת התאים, עכברים מוכנים לקצירת איברים. קבע את החיה לבסיס קצף והשתמש בקליפרים כדי למדוד את נפח הגידול. לאחר מכן, בצע חתך אנכי ארוך בקו האמצע ולאחר מכן בצע שני חתכים אופקיים ממש מתחת לרגל הקדמית ומעל הרגל האחורית.

הצמידו את העור לקצף כדי לחשוף את הגידול, ולאחר מכן השתמשו במספריים כדי לנתק את הגידול מהעור. לאחר מכן הסר בעדינות את הריאות, הנח את הריאה השמאלית בתמיסה של בואן למשך שלושה ימים, ולאחר מכן הפולק הגרורתי השטחי הזה ייראה בבירור לעין בלתי, הקפיא חלק מהרקמה בחנקן נוזלי לבידוד RNA מאוחר יותר והנח את החלק הנותר של הגידול באחד הצינורות החרוטיים המלאים בפורמין. לאחר מכן, לאחר הקרבת החיה על ידי ניקור לב, הוציא את דגימת הדם של 450 מיקרוליטר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 50 מיקרוליטר של 3.2% נתרן ציטראט, ואז סובב את כדוריות הדם האדומות ואחסן את דגימות הפלזמה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף בשגיאות ניסוי כגון חיסון לא מדויק של התאים או דליפה עלולות להוביל לשינויים בגודל הגידול או אפילו היעדר גידול המוביל ל היווצרות מבנה שנראה דומה לזיכרון.

כרית שומן מוזרקת עם מאגר בקרה. קצב הצמיחה של הגידול תלוי גם באופי קו התאים המוזרק, ובאופן כללי ניתן לצפות בו דרך עור העכבר. בנוסף, האזור סביב הגידול עשוי להציג כלי דם גדולים הנובעים משיפוץ כלי הדם ועשויים למלא תפקידים מכריעים בפינוי תוצרי פסולת ואספקת חומרים מזינים וחמצן לרקמת הגידול

בניגוד לניסויים במבחנה, קצב הצמיחה של תאי הגידול עשוי שלא להיות קבוע בזמן in vivo עקב היפוקסיה ומחסור בחומרים מזינים. אזורים נמקיים עשויים להיווצר בתוך הרקמה שמסביב, ואזורים אלה ישפיעו על קצב הצמיחה של הגידול. בנוסף, תאים מוזרקים המבטאים גנים ספציפיים מעניינים עשויים להשפיע על התקדמות הסרטן מכיוון שהגנים עשויים לגרום לצמיחת גידול שמתחילה במהירות, אך מאטה בסוף או להיפך.

איסוף הריאות בתמיסה של בואן עוזר לדמיין את המוקדים הגרורתיים השטחיים, המופיעים כתצורות חיוורות מוגבהות על פני רקמת הריאה. היווצרות מוקדים תלויה בקו התאים. תאים לא אגרסיביים עלולים להוליד גרורות מיקרו בלבד, אותן ניתן לזהות בקלות באמצעות צביעת h ו-e על רקמת ריאה משובצת פרפין.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלייזה כדי לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד צמיחת הגידול הניסיוני משפיעה על רמות הציטוקינים או המולקולות הפרו-אנגיוגניות בפלזמה.